„Biosensoren & Biochips für eine nachhaltige Zukunft“
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Biochips erschienen in den 1980er Jahren als innovative Mikrotechnologie-Plattform zur Analyse von Biomolekülen.
Inhalt
Biosensoren & Biochips: Ein Überblick
Biochips erschienen in den 1980er Jahren als innovative Mikrotechnologie-Plattform zur Analyse von Biomolekülen. An den zugrunde liegenden Technologien sind verschiedene Technologien beteiligt, wie Life Sciences, Informationstechnologie, Mikroelektronik und Mikromechanik. Biochips gelten als hochleistungsfähige, miniaturisierte, automatisierte und kostengünstige Funktionen als wichtige potenzielle Instrumente in der modernen Life-Science-Forschung, der medizinischen Diagnose, der Wirkstoffforschung, der Überwachung der Lebensmittelsicherheit und der Landwirtschaft. Von Biochips wird erwartet, dass sie die Geschwindigkeit und den Umfang des Analyseprozesses drastisch erhöhen und einen enormen wirtschaftlichen Wert bieten. Darüber hinaus haben in den letzten Jahren zahlreiche Regierungen und Industrieunternehmen weltweit massiv in diesen Sektor investiert. Die Biochip-Technologie befindet sich vorerst noch in ihrer frühen Entwicklung. Dies ist ein Bereich, der sich ständig verändert. Die Zukunft der Biochip-Forschung und -Entwicklung ist rosig. In diesem Bereich herrscht ein heftiger Wettbewerb.
In der biomedizinischen und Life-Science-Forschung ist die Miniaturisierung chemischer und biomedizinischer Laborprozesse auf Mikrochips ein schnell wachsendes Feld. Lab-on-Chip-Technologien werden gegenüber ihren Gegenstücken in Makrogröße viele Vorteile bringen. Insbesondere führen höhere Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnisse zu reduzierten Chemikalienanforderungen, reduziertem Abfall, besserer Kontrolle, schneller Verarbeitung und signifikanter Fähigkeit zur parallelen Verarbeitung und Prozessintegration. Lab-on-Chip-Technologien haben das Potenzial, erhebliche sozioökonomische Auswirkungen zu haben. In der Labormedizin bieten vollständig integrierte Mikrogeräte für die chemische Synthese und Krankheitsdiagnose einen wissenschaftlichen Durchbruch und einen Paradigmenwechsel in der chemischen Verarbeitung. Das Humangenomprojekt hat einen großen Beitrag zu dieser Technologie geleistet.
Im Bereich der Analytik ermöglichen Biosensoren wichtige Innovationen, die durch Entwicklungen in der synthetischen Biologie erleichtert werden. Das Potenzial von Biosensoren, eine Vielzahl von Molekülen einfach und präzise zu identifizieren, macht sie für eine Vielzahl von industriellen, medizinischen, ökologischen und wissenschaftlichen Anwendungen von großer Bedeutung. Die Designstrategien von Biosensoren sind ebenso zahlreich wie ihre Anwendungen, wobei die wichtigsten Gruppen von Biosensoren Nukleinsäuren, Proteine und Transkriptionsfaktoren umfassen. Basierend auf der erwarteten Verwendung und den für eine optimale Leistung erforderlichen Parametern hat jeder dieser Biosensortypen Vorteile und Einschränkungen, insbesondere Aspekte wie Ligandenspezifität, Sensitivität, Dynamikbereich, Funktionsumfang, Ausgabemodus, Aktivierungszeit und Benutzerfreundlichkeit,
Blaupausen für Biosensoren: Design & Betrieb
Biosensoren sind Sensoren, die Bioerkennungsprozesse durch einen physikalisch-chemischen Wandler in beobachtbare Signale umwandeln, wobei elektronische und optische Techniken als zwei Hauptwandler dienen. Die Entwicklung von Biosensoren trägt dem schnell steigenden Bedarf an klinischer Diagnostik Rechnung. Durch den Einsatz von Biosensoren ergibt sich eine Kombination von Vorteilen. Biosensoren sind erstens hochempfindlich. Dies liegt daran, dass Biomoleküle eine hohe Affinität zu ihren Zielen haben, zum Beispiel fangen Antikörper Antigene mit einer Dissoziationskonstante im nanomolaren Maßstab ein und DNA-DNA-Wechselwirkungen sind so viel stärker als Antigen-Antikörper. Zweitens ist die biologische Erkennung typischerweise sehr selektiv. Enzym und Substrat ähneln beispielsweise einem Schloss und einem Schlüssel. Eine derart hohe Selektivität führt häufig zu selektiven Biosensoren. Drittens, die Herstellung von kostengünstigen, integrierten und gebrauchsfertigen Biosensorvorrichtungen ist aufgrund der Entwicklung der modernen Elektronikindustrie relativ einfach zu entwickeln. Die Möglichkeit, Krankheitserreger nachzuweisen oder genetische Analysen in Krankenhäusern durchzuführen, wird durch diese biologischen Sensoren sicherlich verbessert; Noch wichtiger ist, dass sie besonders für kleine Kliniken und sogar Point-of-Care-Analysen nützlich sind.
Für Biosensoren mit klinischen Anwendungen wurde eine Reihe neuer Techniken entwickelt. Biosensoren sind im Allgemeinen analytische Geräte, die aus einem Element der biologischen Erkennung und einem optischen/elektronischen Wandler aufgebaut sind. Das biologische Element ist für das Einfangen von Lösungsanalyten verantwortlich und der Transducer wandelt das Bindungsereignis in eine messbare Signalvariation um. Aufgrund der Art der Erkennung könnten enzymbasierte Biosensoren, immunologische Biosensoren und DNA-Biosensoren die Art von Biosensoren kategorisieren. Darüber hinaus stehen je nach Wandlertyp elektronische Biosensoren (elektrisch oder elektrochemisch), optische Biosensoren (Fluoreszenz, Oberflächenplasmonenresonanz oder Raman) und piezoelektrische Biosensoren (Quarzkristall-Mikrowaage) zur Verfügung.
Elektrochemische Biosensoren
Für die biologische Sensorik, bei der Elektroden entweder als Elektronendonatoren oder Elektronenakzeptoren fungieren, sind elektrochemische Techniken besonders nützlich. Umfangreiche elektrochemische Experimente haben gezeigt, dass die Marcus-Elektronentransfertheorie auch mit einem heterogenen Elektronentransfer zwischen Elektroden und oberflächenbegrenzten Redoxmolekülen übereinstimmt, ähnlich wie Donor-Akzeptor-Paare in homogenen Lösungen. Dies bedeutet, dass kleine Abstandsänderungen in Redox-Oberflächen-begrenzten Molekülen große Variationen in den heterogenen Elektronentransferraten verursachen können, die sich in nachweisbare Änderungen elektrochemischer Signale niederschlagen sollen. Hellinga und Mitarbeiter schlugen beispielsweise eine elektrochemische Sensorstrategie vor, die Proteinliganden-vermittelte Scharnierbeugungsbewegungen nutzt. Zunächst wurde eine Goldelektrode mit einer selbstorganisierten Monoschicht (SAM) beschichtet. was eine vielseitige Plattform für die ortsspezifische Proteinimmobilisierung bietet. Das Maltose-bindende Protein (MBP) wurde dann mit einer bestimmten Orientierung an die Oberfläche der Goldelektrode gebunden, da die Redox-Reportergruppe des Rutheniums (Ru(II)) in einem bestimmten Bereich über der Elektrode fixiert ist. Wenn der Ligand Maltose an das aktive Zentrum bindet, entfernt sich der Ru(II)-Reporter von der Elektrode, indem er eine gelenkbeugende Bewegung von MBP (Abbildung 1).
Abbildung 1. Aufbau und Betrieb des elektrochemischen Biosensors
Diese durch die Maltosebindung induzierte Abstandsänderung verursacht eine konzentrationsabhängige Abnahme der elektrochemischen Signale und bietet somit eine Möglichkeit für die elektronische Erfassung von Maltose. Die Verwendung dieses stark verallgemeinerten Sensoransatzes zum Nachweis verschiedener Analyten mit einer Familie von Proteinen oder Enzymen, die durch Ligandenbindung induzierte Konformationsänderungen erfahren, wurde ebenfalls gezeigt.
Enzymbasierte Biosensoren
Die ersten jemals dokumentierten Biosensoren waren auf Glucoseoxidase (GOD) basierende Biosensoren, die 1962 von Clark und Lyons eingeführt wurden. Hyperglykämie, eine chronisch erhöhte Blutzuckerkonzentration, ist bei Diabetes mellitus häufig. Daher ist eine regelmäßige Kontrolle des Blutzuckerspiegels für Diabetiker unerlässlich. Der Vorteil der Elektrochemie in Verbindung mit der Enzymkatalyse liegt in diesem Biosensor und seinen neueren Versionen. Eine mit GOD immobilisierte Elektrode war Clarks Biosensor. Die oxidierte Form von GOD interagiert mit Glucose in Gegenwart von Glucose und produziert Gluconsäure und reduziertes GOD, wobei zwei Elektronen und zwei Protonen beteiligt sind. Da gelöster Sauerstoff mit reduziertem GOD reagiert, verbraucht diese Glucoseoxidation auch Sauerstoff in der Lösung, wodurch Wasserstoffperoxid und oxidiertes GOD erzeugt und der Sauerstoffdruck gesenkt wird. Infolge, durch elektrochemisches Erfassen von Sauerstoff mit einer Clark-Sauerstoffelektrode kann die Elektrode die Glukose nachweisen. Diese Art von Sensor gilt als Biosensor der „ersten Generation“. Die Yellow Springs Instrument Company (Ohio, USA) hat diesen Biosensor der ersten Generation in den 1970er Jahren auf den Markt gebracht.
Der Biosensor der zweiten Generation ersetzt das natürlich vorhandene Substrat Sauerstoff durch kleine künstliche Redoxmoleküle, die als Redoxmediatoren fungieren und Elektronen zwischen Elektroden und Enzymen austauschen. Zur Verbesserung der Sensoreffizienz, d. h. Empfindlichkeit und Signal-Rausch-Verhältnis, wurden verschiedene lösliche Redoxmoleküle wie Ferrocen, Thionin, Methylenblau, Methylviologen verwendet. Diese Mediatoren wurden zunächst in einer Lösung gelöst. Sie erhalten Elektronen von den Elektroden und diese Elektronen werden dann oder umgekehrt zum Redoxzentrum der Enzyme transportiert. Als ein Schritt nach vorn wurden immobilisierte Mediatoren vorgeschlagen, um reagenzfreie Biosensoren zu verbessern. Für Wasserstoffperoxid dokumentierten beispielsweise Ruan et al. 1998 einen reagenzfreien Festkörpersensor. Goldelektroden wurden zuerst mit L-Cystein modifiziert, und dann wurden mehrere Schichten von Meerrettichperoxidase (HRP) durch Glutaraldehyd mit der Amingruppe von Cystein verbunden, und Thionin wurde weiter über dieselbe chemische Verbindung mit dem Enzym verbunden. Als Ergebnis wurde die Goldelektrode sowohl durch das Enzym als auch durch den Mediator immobilisiert, die ohne weitere Reagenszugabe Wasserstoffperoxid sensitiv in der Testlösung nachweisen konnten. Ein wesentlicher Vorteil dieser Konfiguration des Biosensors besteht darin, dass der Mediator auf der Elektrodenoberfläche fixiert ist, wodurch das Diffusionsproblem vermieden wird. die ohne weitere Reagenzzugabe Wasserstoffperoxid in der Testlösung empfindlich nachweisen konnten. Ein wesentlicher Vorteil dieser Konfiguration des Biosensors besteht darin, dass der Mediator auf der Elektrodenoberfläche fixiert ist, wodurch das Diffusionsproblem vermieden wird. die ohne weitere Reagenzzugabe Wasserstoffperoxid in der Testlösung empfindlich nachweisen konnten. Ein wesentlicher Vorteil dieser Konfiguration des Biosensors besteht darin, dass der Mediator auf der Elektrodenoberfläche fixiert ist, wodurch das Diffusionsproblem vermieden wird.
Eine alternative Lösung, die die Verwendung von Redoxpolymeren beinhaltet, wurde von Heller und Mitarbeitern angegeben. Zuerst stellten sie ein dotiertes Polymer mit Os2+-Komplex her. Diese Art von Polymer fungiert als „molekularer Draht“ und tauscht Elektronen zwischen dem Enzym und der Elektrode aus. Das Os-Polymer und die Glucoseoxidase werden dann gemeinsam auf der Kohlenstoffelektrode immobilisiert, was eine empfindliche Reaktion auf die Anwesenheit von Glucose erzeugt. Mit diesen Redox-Polymeren konnten sie fast 100 % immobilisierte Enzymmoleküle elektroaktiv machen, was zu einer sehr hochempfindlichen Methode des Glukosenachweises beitrug.
Die Kommerzialisierung des enzymbasierten Biosensors der zweiten Generation war recht erfolgreich. 1987 wurde MediSense gegründet und die Glukosesensoren von ExactechTM im Pen-Format veröffentlicht. Dieser Erfolg hat zu einer Revolution im Gesundheitswesen für Diabetiker geführt. Anstatt ins Krankenhaus zu reisen, konnten sie ihre Blutzuckerkonzentration zu Hause kontrollieren. Die MediSense und später amperometrische Biosensorsysteme bestehen aus GOD-beschichteten, siebgedruckten Kohleelektroden und Mediatoren (Teststreifen). Der Sensor beginnt zu funktionieren, wenn ein Blutstropfen auf den Teststreifen aufgetragen wird und zeichnet die amperometrische Reaktion auf, die in eine auf dem LCD angezeigte Ziffer umgewandelt wird, die die Glukosekonzentration anzeigt.
Vor kurzem veröffentlichten Xiao et al. (2003) durch die Entwicklung eines rekonstruierten GOD-Enzyms eine neue Generation von Glukose-Biosensoren. Sie stellten zunächst Apo-GOD frei vom Cofaktor Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD) her, funktionalisierten und rekonstruierten dann ein 1,4-nm-Gold-Nanopartikel mit FAD in das Apo-GOD. Unter Verwendung einer Dithiol-Monoschicht wurde ein solches rekonstruiertes Enzym mit Goldelektroden ausgerichtet (Figur 2). Sie zeigten, dass der Elektronentransferumsatz dieses künstlichen Enzyms mit 5000 s-1 ungefähr 8-mal höher ist als der des normalen Enzyms (700 s-1). Das Gold-Nanopartikel in diesem System dient als Elektronenrelais für die elektrische Verdrahtung des Redoxzentrums des Enzyms. In diesem Bereich stellt der von Xiao et al. etablierte Glucose-Biosensor einen neuen Weg dar, frei von Mediatoren und hochempfindlich. In jüngerer Zeit dokumentierte Willners Gruppe durch die Verwendung von einwandigen Kohlenstoffnanoröhren (SWNTs) anstelle von Goldnanopartikeln eine modifizierte Version dieses Sensors und erzielte eine ähnlich überlegene Effizienz. Obwohl es noch keine Kommerzialisierung dieser Technologie gibt, wird erwartet, dass die modernen Biosensoren weiter verbessert werden.
Abbildung 2 Aufbau und Betrieb eines enzymbasierten Biosensors
Immunologischer Biosensor
Um umweltrelevante oder klinisch wichtige Ziele zu identifizieren, sind immunologische Biosensoren auf ein hochspezifisches immunologisches System angewiesen, dh Antikörper und Antigene. In Wirklichkeit sind immunologische Biosensoren eine moderne Variante des Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) mit geringeren Kosten, höherer Geschwindigkeit und einfacherem Service sowie vergleichbarer oder sogar höherer Empfindlichkeit.
Zu den gebräuchlichsten gehören elektrochemische immunologische Biosensoren. Es stehen zwei Typen immunologischer Biosensoren zur Verfügung. Zuerst wird die Elektrode mit einem Fänger-Antikörper immobilisiert, der ein bestimmtes Zielantigen fängt. Über einen mit Redoxmolekülen oder Enzymen markierten Sekundärantikörper wird die Signalübertragung erreicht. Zweitens wird ein Elektrodenantigen immobilisiert, das spezifische Antikörper nachweist.
Ju und Mitarbeiter entwickelten einen amperometrischen immunologischen Biosensor für das karzinoembryonale Antigen (CEA). Thionin- und HRP-markierte CEA-Antikörper wurden auf einer mit Glutaraldehyd vernetzten Glaskohlenstoffelektrode co-immobilisiert. In der Lösung, die an die Elektrodenreaktion von Thionin gekoppelt war, reduzierte HRP katalytisch Wasserstoffperoxid, was zu einem katalysierten Signal führte. Das Redoxzentrum von HRP wurde durch das Einfangen von CEA teilweise blockiert, was zu einer Dämpfung amperometrischer Signale führte.
Rusling und Kollegen haben kürzlich SWNTs genutzt, um die Leistung immunologischer Biosensoren zu verbessern (Figur 3).
Abbildung 3. Aufbau und Betrieb eines immunologischen Biosensors
Mithilfe der metallvermittelten Selbstorganisation entwarfen sie vertikal ausgerichtete Anordnungen von SWNTs (SWNT-Wald) auf pyrolytischen Graphitelektroden. Anti-HSA wurde dann unter Verwendung von EDC/NHS kovalent an die carboxylierten Enden des SWNT-Walds gebunden. Die Elektrode wurde weiter mit einem sekundären HRP-markierten Anti-HSA-Antikörper inkubiert, nachdem das HSA-Target gefangen wurde. Das HSA-Target in der Testlösung kann anhand des katalytischen Signals von HRP für Wasserstoffperoxid identifiziert werden. Die Nachweisempfindlichkeit, die bei etwa 1 nM lag, wurde durch die Verwendung von SWNT-Wäldern dramatisch verbessert. Dies lag wahrscheinlich an der verbesserten Reaktivität des Elektronentransfers von HRP, das in SWNT-Wäldern eingekapselt ist.
Eines der relevantesten klinischen Werkzeuge sind die immunologischen Assays. Bestehende Assay-Verfahren, wie ELISA, erfordern jedoch große und kostspielige Instrumente sowie gut ausgebildete Spezialisten. Für die Entwicklung billiger, miniaturisierter und kompakter Geräte sind elektrochemische Verfahren gut geeignet. Als Ergebnis ist die Entwicklung elektrochemischer immunologischer Biosensoren für die Feld- und Point-of-Care-Analyse höchst wünschenswert. Es ist wichtig zu erwähnen, dass die Verwendung von Einweg-Siebdruckelektroden für dieses Ziel entscheidend sein könnte, vergleichbar mit Glukose-Biosensoren. Um High-Throughput (HTS) Assays durchführen zu können, ist es auch wichtig, Antikörper-Microarrays auf Basis der Elektrochemie zu etablieren.
DNA-Biosensoren
Es besteht ein enormes wissenschaftliches und technologisches Interesse an der Identifizierung von DNA-Hybridisierungsereignissen. Das stark wachsende Interesse an chipbasierter klinischer Diagnostik hat diese Bedeutung besonders deutlich gemacht. Daher wurde im Laufe der Jahre eine Vielzahl von Techniken entwickelt, einschließlich optischer, akustischer und elektronischer Ansätze. In den letzten Jahrzehnten hat die Fluoreszenzdetektion die modernen Genosensoren unter ihnen dominiert. Elektrochemische Verfahren, die sich bei einfachen chemischen Spezies, insbesondere Metallionen, als effektiv erwiesen haben, haben jedoch ein zunehmend wachsendes Interesse an Anwendungen zum Nachweis biologisch verwandter Spezies auf sich gezogen.
Die Vorteile der elektronischen Detektion umfassen: 1) Die elektrochemische Detektion ist typischerweise kostengünstig und ermöglicht somit ein hochempfindliches und schnelles Screening; 2) mehrere elektroaktive Markierungen, z. B. Metallocene, sind stabil und umweltunempfindlich, im Gegensatz zu Fluorophoren, die oft Probleme mit dem „Photobleichen“ haben; 3) geeignetes molekulares Design und Synthese, die eine Vielzahl von Derivaten mit jeweils einem spezifischen Redoxpotential erzeugen, haben es ermöglicht, „mehrfarbig“ zu kennzeichnen; 4) Die schnell etablierte Siliziumindustrie haben den Weg für die Massenproduktion integrierter Schaltkreise geebnet, wodurch die elektronische Detektion besonders geeignet und mit Mikroarray-basierten Technologien kompatibel ist.
Ein Jahr später entwickelte Thorp eine Technologie, die auf der relativ hohen Oxidationsaktivität von Guanin und seiner Kooperation durch exogene Redoxkatalysatoren basiert. Die Unterscheidung von ds/ss wird dadurch erreicht, dass Guanin aufgrund des sterischen Effekts in Duplexen eine relativ geringe Elektronentransferreaktivität aufweist. Beim Nachweis von PCR-Produkten ist dieses Verfahren hochempfindlich, jedoch relativ schlecht in der Unterscheidung von Hybridisierungsereignissen. Zudem ist dieses Verfahren bisher nur auf ITO-Oberflächen möglich, da das hohe Oxidationspotential den Einsatz von Gold noch ausschließt. wegen der sterischen Wirkung. Beim Nachweis von PCR-Produkten ist dieses Verfahren hochempfindlich, jedoch relativ schlecht in der Unterscheidung von Hybridisierungsereignissen. Zudem ist dieses Verfahren bisher nur auf ITO-Oberflächen möglich, da das hohe Oxidationspotential den Einsatz von Gold noch ausschließt. wegen der sterischen Wirkung. Beim Nachweis von PCR-Produkten ist dieses Verfahren hochempfindlich, jedoch relativ schlecht in der Unterscheidung von Hybridisierungsereignissen. Zudem ist dieses Verfahren bisher nur auf ITO-Oberflächen möglich, da das hohe Oxidationspotential den Einsatz von Gold noch ausschließt.
Trotz Fortschritten ist die Entwicklung eines All-in-One-Sensors (dh ohne Reagentien), der spezifisch das Einfangen von Zielen signalisiert, immer noch sehr wichtig (dh die Vermeidung einer weiteren Behandlung mit entweder Signalmolekülen oder Hybridisierungsindikatoren). Ein brauchbares Mittel hierfür bieten DNA- oder RNA-Aptamere. Aptamere sind gut strukturierte DNA oder RNA, die eine hohe Affinität und Selektivität für bestimmte Targets sowie natürliche Enzyme zeigen und somit eine überlegene Robustheit gegenüber fragilen Enzymen aufweisen. Sie sind ein vielversprechendes Instrument für Therapie und Diagnose. Bis dahin war die gut entwickelte In-vitro-Selektion für praktisch jedes beliebige Ziel in der Lage, Aptamere zu produzieren. Angesichts dieser Vorteile werden Oligonukleotid-Aptamere als die biosensorischen Komponenten der nächsten Generation vorhergesagt.(Abbildung 4).
Abbildung 4. Aufbau und Betrieb des DNA-Biosensors
Haarnadel-ähnliche DNA war ein unglaublich faszinierendes Aptamer, das die Grundlage für die homogene Hybridisierungserkennung von fluoreszierenden „Molecular Beacons“ bildet. Die DNA-Sequenz wurde so konzipiert, dass sich dieses „Beacon“ in Abwesenheit von Zielen im nahen Zustand befindet, während es „angeschaltet“ wird, wenn es sein bestimmtes Genziel erreicht. Das Vorhandensein des Designs der Stammschleife in der Struktur bietet einen Ein/Aus-Schalter sowie eine Stringenz, um gegen einzelne DNA-Hybridisierungsfehlpaarungen zu differenzieren. Ein thiolierter Terminus verleiht der Goldoberfläche dieser elektronischen DNA-Haarnadel ein klebriges Ende, während ein Ferrocen-Tag am anderen Ende elektronische Signale umwandelt. Die anfängliche Haarnadel lokalisiert das Ferrocen proximal zur Elektrodenoberfläche und ermöglicht so einen Elektronentransfer an der Grenzfläche. Nach der Hybridisierung die Bildung der linearen Duplexstruktur unterbricht die Haarnadel und zwingt das Ferrocen und die Elektrode auseinander. Diese signifikante Abstandsänderung (bis zu einigen nm) blockiert effektiv den Grenzflächenelektronentransfer und führt zur Verminderung entsprechender elektrochemischer Stromsignale. Diese Strategie bietet die Möglichkeit, 10 pM DNA-Ziele zu identifizieren. Noch wichtiger ist, dass ein solches Design den Vorteil nutzt, den einfangenden Teil (Sondensequenz) und den signalgebenden Teil (elektroaktive Spezies) innerhalb einer einzigen oberflächenbegrenzten Haarnadelstruktur zu integrieren. Im Gegensatz zu den meisten bisher vorgeschlagenen Festkörper-DNA-Sensoren ist dieses Design daher effektiv reagensfrei, dh außer DNA-Targets wird während des Erkennungsprozesses kein exogenes Reagens benötigt.
Ein Medium für den Fernelektronentransfer (ET) über seine Basenstapelung wurde als DNA-Doppelhelix vorgeschlagen. Obwohl dieses Thema seit langem diskutiert wird, haben Barton und Kollegen elektrochemisch bewiesen, dass gut orientierte Goldelektroden-DNA-Filme einen weitreichenden Elektronentransfer ermöglichen und dass ein solcher ET sehr empfindlich gegenüber Basenstapelungsstörungen wie Fehlpaarungen ist. Sie fanden heraus, dass elektroaktive Interkalatoren wie Methylenblau (MB) durch eine vollständig angepasste DNA-Duplex-modifizierte Elektrode effektiv reduziert werden können. Die Existenz nur einer einzigen Fehlanpassung wandelt jedoch das drahtähnliche ET-Medium in einen Isolator um, wodurch der ET zwischen MB und Elektrode vollständig unterbrochen wird. Über zyklische voltammetrische oder coulometrische Assays, die die Grundlage eines schnellen DNA-Mutations-Screening-Sensors bilden, kann ein solcher Unterschied leicht ausgelesen werden. Barton und Kollegen zeigten auch, dass die Elektrokatalyse die Sensitivität dieser Strategie verbessern könnte. In Lösung zieht die Zugabe von Ferricyanid ständig Elektronen aus elektrochemisch reduziertem MB und verstärkt den Elektronenfluss durch die Doppelhelix der DNA. Dies hilft beim Nachweis von ~108 DNA-Molekülen mit einer 30-μm-Elektrode. Sie haben auch DNA-basierte Sensoren entwickelt, um DNA-bindende Proteine parallel zur DNA-Detektion zu detektieren. Es wird angenommen, dass einige DNA-bindende Proteine oder Enzyme mit der Basenpaar-Stapelung der DNA interagieren und die Doppelhelix der DNA von effektiven ET-Drähten in Isolatoren verwandeln. Sie etablierten einen sensitiven Weg, um eine Vielzahl von DNA-bindenden Proteinen auf der Grundlage einer vergleichbaren Sensing-Strategie elektrisch zu testen. Entscheidend ist, dass diese Sensoren erfolgreich Proteine unterscheiden, die an DNA binden, aber sie stören das Stapeln der Basen nicht. Dies bestätigt sicherlich, dass die Signalgrenze bei der Proteinbindung auf die Änderung des ET-Mediums zurückzuführen ist, die für die Basenstapelung relevant ist.
Das Zukunft klinischer Biosensoren
Trotz der raschen Fortschritte bei der Entwicklung von Biosensoren sind klinische Anwendungen von Biosensoren mit Ausnahme des Glukosemonitors noch selten. Dies steht in direktem Gegensatz zu dem kritischen Bedarf an Point-of-Care-Tests in kleinen Kliniken. Wir gehen davon aus, dass die folgenden Spezifikationen relevant sind. Erstens hohe Sensitivität: Die Verbesserung der Sensitivität ist eine immerwährende Priorität bei der Entwicklung von Biosensoren. Es ist klar, dass das Sensitivitätskriterium von Fall zu Fall reicht. Da beispielsweise die Glukosespiegel im Blut hoch sind, benötigt man keine sehr hohe Empfindlichkeit für den Glukosenachweis. Dies ist im Wesentlichen einer der Gründe, warum Glukosemonitore erfolgreich waren. Um jedoch den Anforderungen der Molekulardiagnostik und des Erregernachweises gerecht zu werden, ist es sehr wichtig, hochempfindliche Biosensoren mit optimaler Einzelmoleküldetektion zu etablieren. Zweitens, hohe Selektivität: Bei der Anwendung von Biosensoren kann dies ein erhebliches Hindernis sein. Die meisten der in der Literatur genannten Biosensoren funktionieren im Labor sehr gut, in realen Prüfmustern können jedoch Serienprobleme angegangen werden. Um eine unspezifische Oberflächenadsorption zu verhindern, ist es daher wichtig, neue Ansätze zur Oberflächenmodifizierung zu etablieren. Drittens ist Multiplexing entscheidend, um Assayzeit zu sparen, was besonders wichtig für Labor- oder Klinikassays ist. Daher ist es wichtig, Arrays von Elektroden mit hoher Dichte sowie elektrochemische Instrumente einzurichten, die eine große Anzahl von Assays gleichzeitig durchführen können. Viertens, um die Portabilität zu erhöhen, es ist unabdingbar, miniaturisierte Biosensoren zu entwickeln, die den Anforderungen von Feld- und Point-of-Care-Tests gerecht werden. Fünftens ist es angemessen, einen idealen Biosensor zu integrieren und hochgradig zu automatisieren. Eine Lösung für dieses Ziel bieten aktuelle Lab-on-a-Chip-Technologien (Mikrofluidik). Wir können davon ausgehen, dass all diese Funktionen in Zukunft in erfolgreiche Biosensoren integriert werden und winzige Ziele innerhalb kurzer Zeit leicht erkennen können.
Blaupausen für Biochips: Design & Betrieb
Der Begriff „Biochip“ hat mehrere Bedeutungen. Jedes Gerät oder jede Komponente, die biologisches Material einführt, entweder aus biologischen Spezies extrahiert oder in einem Labor auf einem festen Substrat synthetisiert, kann als Biochip im allgemeinsten Sinne angesehen werden. In der Praxis geht es bei Biochips jedoch häufig sowohl um Miniaturisierungen, meist im Microarray-Format, als auch um die Möglichkeit einer kostengünstigen Massenproduktion. Die elektronische Nase oder der künstliche Nasenchip, die elektronische Zunge, der Polymerase-Kettenreaktionschip, der DNA-Microarray-Chip (Genchip), der Proteinchip und das biochemische Lab-on-a-Chip sind einige Beispiele, die diese Qualifikationen erfüllen. Beim Genchip und beim Proteinchip wurde die dynamischste Biochip-Forschung betrieben.
Besondere Aufmerksamkeit wurde Biochips gewidmet, die konventionelle Biotechnologie mit Halbleiterverarbeitung, mikroelektromechanischen Systemen (MEMS), Optoelektronik und digitaler Signal- und Bilderfassung und -verarbeitung integrieren.
Es wird allgemein angenommen, dass Tausende von Genen und ihren Derivaten (dh RNA und Proteine) in einem bestimmten lebenden Organismus auf komplizierte und koordinierte Weise agieren, die das Mysterium des Lebens schaffen. Herkömmliche Methoden in der Molekularbiologie arbeiten jedoch typischerweise auf der Basis „ein Gen in einem Experiment“, was davon ausgeht, dass der Durchsatz sehr begrenzt ist und es schwierig ist, das „ganze Bild“ der Genfunktion zu erhalten. Eine neue Technologie namens DNA-Microarray hat in den letzten Jahrzehnten unter Biologen große Aufmerksamkeit erregt. Ziel dieser Technologie ist es, das gesamte Genom auf einem einzigen Chip zu vermessen, damit sich Forscher inzwischen ein besseres Bild von den Wechselwirkungen zwischen Tausenden von Genen machen können.
Ein Gen- oder DNA-Chip entspricht einem zweidimensionalen Array kleiner Reaktionszellen (je 100 x 100 µm), die mit Hochgeschwindigkeitsrobotik auf einem festen Substrat hergestellt wurden. Ein Siliziumwafer, eine dünne Glasscheibe, Kunststoff oder eine Nylonmembran könnten das feste Substrat sein. In jeder Reaktionszelle sind Billionen polymerer Moleküle aus einer bestimmten Sequenz einzelsträngiger DNA-Fragmente immobilisiert (Abbildung 5).
Abbildung 5. Schematische Darstellung eines Genchips
DNA-Fragmente können entweder kurze (etwa 20 bis 25) Basensequenzen (A, T, G und C) oder längere komplementäre DNA-Stränge (cDNA) sein. In jeder Zelle wird die einzigartige Basensequenz (zB CTATGC…) in Abhängigkeit von der erwarteten Verwendung vorausgewählt oder konfiguriert. Die Sonden werden auch als erkannte Sequenzen von einzelsträngigen DNA-Fragmenten bezeichnet, die auf dem Substrat immobilisiert sind. Doppelsträngige DNA-Fragmente entstehen, wenn unbekannte Fragmente von einzelsträngigen DNA-Proben, das sogenannte Target, mit den Sonden auf dem Chip reagieren (oder hybridisieren), wobei Target und Sonde gemäß der Basenpaarungsregel (A paired mit T und G gepaart mit C). Die Zielproben werden oft mit Markierungen, wie beispielsweise Fluoreszenzmitteln, Farbstoffen oder Radioisotopenmolekülen, markiert, um die Diagnose oder Analyse des hybridisierten Chips zu erleichtern. Jedes ist mit seinem eigenen unterscheidbaren Tag gekennzeichnet, wenn die Ziele mehr als einen Probentyp enthalten. Diese Art von DNA-Mikroarray-Chip bietet eine Plattform, auf der, basierend auf der Größe des Arrays, das unbekannte Ziel oder die unbekannten Ziele theoretisch mit sehr hoher Geschwindigkeit und hohem Durchsatz definiert werden können, indem die an der Forschung und Entwicklung der Biochip-Technologie beteiligten Komponenten mit zehn von Tausenden verschiedener Sondentypen durch parallele Hybridisierung, und die verwandten technischen Disziplinen sind in Abbildung 6 angegeben. Biochip-Technologie ist grundsätzlich interdisziplinär. Es ist wichtig, dass Wissenschaftler und Ingenieure verschiedener Disziplinen synergetisch zusammenarbeiten, um diese neuartige Technologie vom Laborinteresse zu praktischen Geräten und Systemen zu entwickeln. Diese Art von DNA-Mikroarray-Chip bietet eine Plattform, auf der, basierend auf der Größe des Arrays, das unbekannte Ziel oder die unbekannten Ziele theoretisch mit sehr hoher Geschwindigkeit und hohem Durchsatz definiert werden können, indem die an der Forschung und Entwicklung der Biochip-Technologie beteiligten Komponenten mit zehn von Tausenden verschiedener Sondentypen durch parallele Hybridisierung angegeben werden. (Die verwandten technischen Disziplinen sind in Abbildung 6 angegeben.)
Abbildung 6. Die Komponenten und die dazugehörigen technischen Disziplinen, die an der F&E der Biochip-Technologie beteiligt sind
DNA Mikroarray
Hinsichtlich der Eigenschaft der arrayed DNA-Sequenz bekannter Identität gibt es zwei Varianten der DNA-Microarray-Technologie:
Tippe I: Sonden-cDNA (500~5.000 Basen lang) wird mittels Roboter-Spotting auf einer festen Oberfläche wie Glas immobilisiert und entweder separat oder in einer Mischung einem Satz von Targets ausgesetzt. Diese Strategie, die „traditionell“ als DNA-Mikroarray bezeichnet wird, ist weitgehend bekannt dafür, dass sie an der Stanford University entwickelt wurde.
Typ II: In situ (auf dem Chip) oder durch konventionelle Synthese, begleitet von einer Immobilisierung auf dem Chip, wird ein Array von Oligonukleotid (20~80-mer Oligos) oder Peptidnukleinsäure (PNA) Sonden synthetisiert. Der Array wird hybridisierter, markierter Proben-DNA ausgesetzt und bestimmt die Identität/Häufigkeit von komplementären Sequenzen. Diese Methode, „historisch“ DNA-Chips genannt, wurde bei Affymetrix INC. etabliert, die ihre photolithographisch hergestellten Produkte unter der Marke Genechip vertreibt. Chips auf Oligonukleotidbasis werden von mehreren Unternehmen unter Verwendung alternativer In-situ-Synthese- oder Abscheidungstechnologien entwickelt.
Abhängig von der Art des immobilisierten Moleküls wird der Biochip hauptsächlich in zwei Formaten hergestellt. CDNA-Arrays werden auch als Biochips bezeichnet, die PCR-Produkte von 200 Basenpaaren bis 2 KB Größe enthalten, die entlang der Länge des Moleküls durch kovalentes Vernetzen mit der Oberfläche des Arrays immobilisiert sind. Alternativ können Oligonukleotidsonden entweder in situ auf dem Array synthetisiert werden, oder kovalente Bindungen an die Termini können durch vorsynthetisierte Oligos fixiert werden. Die Genchip-Entwicklung umfasst mehrere verschiedene Teile, wie Herstellung, Probenvorbereitung und Hybridisierung der Zielsequenz, Nachweis der Hybridisierungsergebnisse, Design der Oligonukleotidsonde und Hybridisierungsbildanalyse sowie verschiedene Anwendungen, wie in Abbildung 7.
Abbildung 7. Mehrere wichtige Aspekte im Zusammenhang mit der Genechip-Technologie
Zunächst werden gemäß einem bestimmten Ziel viele relevante Gensequenzen aus der DNA-Datenbank ausgewählt (einzelner Nukleinpolymorphismus für ein spezifisches Gen, differentielle Expression für eine gegebene Gruppe von Genen oder Mutationsidentifikation). Durch Bestimmung der Sequenz und Länge jeder Sonde und ihrer genauen Position auf dem Chip wird eine Reihe einzigartiger Oligonukleotidsonden basierend auf den ausgewählten Sequenzen entworfen. Mit dem Spotting-Verfahren oder der On-Chip-Synthese kann die Synthese des DNA-Mikroarrays durchgeführt werden. Die Zielgene sind normalerweise notwendig, damit die Fluoreszenz amplifiziert und markiert werden kann. In den meisten Fällen ist die Auswahl geeigneter PCR-Primes sowie die Optimierung der Amplifikations- und Hybridisierungsbedingungen erforderlich. Für die Hybridisierungsergebnisse auf einem Genchip gibt es mehrere verschiedene Nachweisstrategien. Ein traditioneller Ansatz ist die Fluoreszenzdetektion. Für die Behandlung einer so großen Menge eines Genchips ist eine Datenanalyse auf der Grundlage der Fluoreszenzbilder und der Datenbankkonfiguration erforderlich. Die Verwendung von den Genen entsprechenden PCR-Produkten als Sondenmoleküle ist eine gängige Plattform zur Herstellung von Microarrays. Biologische Quellen von cDNA-Bibliotheken bieten eine effektive Matrize für die PCR-Amplifikation der Sonden. Diese Plattform wird daher als cDNA-Arrays bezeichnet. Biologische Quellen von cDNA-Bibliotheken bieten eine effektive Matrize für die PCR-Amplifikation der Sonden. Diese Plattform wird daher als cDNA-Arrays bezeichnet. Biologische Quellen von cDNA-Bibliotheken bieten eine effektive Matrize für die PCR-Amplifikation der Sonden. Diese Plattform wird daher als cDNA-Arrays bezeichnet.
Die Verwendung von Oligonukleotidsonden anstelle von PCR-Produkten hat mehrere Vorteile. Erstens sind sie typischerweise von ähnlicher Länge und können so erzeugt werden, dass sie ähnliche Hybridisierungseigenschaften aufweisen. Zweitens können sie konfiguriert sein, um gegen die spezifische Genregion zu hybridisieren; das PCR-Produkt ermöglicht auch eine Kreuzhybridisierung zwischen homologen Genen, die Mitglieder der Genexpressionsprofile derselben Genfamilie stören. Darüber hinaus entfällt durch Oligonukleotid-Arrays die Notwendigkeit einer mühsamen PCR-Amplifikation der Sondenmoleküle und verringert das Fehlerrisiko durch Klonhandhabung und Kontamination während des Transfers.
Mikrofluidischer Chip
In den letzten Jahrzehnten hat sich die Mikrofluidik-Technologie rasant entwickelt und bietet vielfältige Anwendungen in den Lebenswissenschaften. Dank der deutlichen Vorteile der Systemminiaturisierung entstand die Mikrofluidik-Revolution, einschließlich hoher analytischer Effizienz, erhöhter Empfindlichkeit, verbesserter analytischer Leistung, schneller Multiplexing-Parallelisierung, der Fähigkeit, reduzierte Reagenzienvolumina zu verwalten und zu verarbeiten und drastisch reduzierter Gerätebedarf.
Mikrofluidik könnte als Miniaturisierungstechnologie gleichzeitig analytische Effizienz und hohe Durchsatzfähigkeit bieten, ohne dass es an Genauigkeit und Automatisierung mangelt. Die Mikrofluidik-Technologie ist nicht nur ein leistungsstarkes Werkzeug für das schnelle Screening und die Untersuchung der Arzneimittelentwicklung während des Arzneimittelapplikationsprozesses, sondern auch für ihre miniaturisierten Geräte zur Senkung der Kosten und des Reagenzienverbrauchs.
Bei der Entwicklung von Komponenten und Systemen zum Wirkstoffscreening auf Basis der Mikrofluidik wurden in den letzten Jahren erhebliche Fortschritte erzielt. Beim Wirkstoffscreening werden verschiedene Arten von Mikrofluidikchips verwendet, um die Screeningeffizienz zu verbessern und die Kosten zu senken. In den folgenden Abschnitten werden mehrere gängige Arten von Chiptechnologie beschrieben.
Abbildung 8. Anwendung eines Mikrofluidik-Chips beim Wirkstoff-Screening.
Tröpfchen-Mikrofluidik– Um Experimente im kontinuierlichen oder segmentierten Fluss durchzuführen, verwendet die Tröpfchen-Mikrofluidik-Technologie flüssige Tröpfchen, die durch eine nicht mischbare Flüssigkeit als Nanoliter-zu-Pikoliter-Reaktionsgefäße unterteilt sind. Solche Methoden zeigen signifikante Vorteile, wie z. B. reduzierten Probenverbrauch, verbesserte Reaktionsgeschwindigkeit und erhöhte Effizienz und Reproduzierbarkeit, wobei unglaublich kleine Volumina mit robuster Zusammensetzungskontrolle verarbeitet werden.
Basierend auf der Tröpfchen-Array-Technik mit sequenziellem Prozess können mikrofluidische Tröpfchenverfahren für das Screening von Wirkstoffkombinationen verwendet werden (Abbildung 8A), um verschiedene Dosierungskombinationen und Verabreichungsdauern zu screenen und das optimale Dosierungsschema mit minimaler Einnahme zu verfeinern, das für kombinierte Krankheitssituationen wichtig ist.
Organ-on-Chip– Die detaillierte Regulierung der mikroskaligen Struktur und des Flusses ermöglicht die präzise Modellierung der mikroskaligen Strukturen von Organgewebe. Organs-on-Chips sind biomimetische Systeme, die mikrotechnisch hergestellt werden und wesentliche Funktionseinheiten lebender menschlicher Organe darstellen. Die Funktionen mehrerer Organe und Gewebe wie Leber, Niere, Lunge und Darm wurden bisher als in vitro-Modelle nachgebildet. Diese Systeme könnten als In-vitro-Modelle verwendet werden, die es ermöglichen, komplexe biologische Prozesse zu simulieren und pharmakologisch zu modulieren.
Der Organchip simuliert die grundlegenden Prozesse des menschlichen Körpers, indem er aus einer Reihe von Zellen einen biomimetischen Chip mit ähnlichen physiologischen Funktionen auf der einzigartigen Struktur des Chips erzeugt, der mit der tatsächlichen äußeren Umgebung der Krankheit vergleichbar ist als das typische Einzelzellkulturmodell.
Um die komplexe Mikroarchitektur von Krebsgewebe zu replizieren, wurde ein Mikrosystem entwickelt, das die Kokultur von Brusttumor-Sphäroiden mit benachbarten Zellen in einem kompartimentierten 3D-Mikrofluidiksystem ermöglicht, um die Plattform für das Screening von Anti-Brustkrebs-Medikamenten zu schaffen (Abbildung 8B). Für die Untersuchung der Migration von Krebszellen und des Screenings von Krebsmedikamenten könnte die Kokultur mehrerer Gewebe mit einem mikrofluidischen System verwendet werden.
Andere mikrofluidische Chips für das Wirkstoffscreening– Neben den oben genannten bestehenden Methoden gibt es mehrere andere Technologien, die auf Mikrofluidik-Chips für das Wirkstoff-Screening angewendet werden und die Ideen der Forscher erweitern. Der bedeutendste und integriertste Aspekt der Arzneimittelentwicklung in den meisten pharmazeutischen und mehreren biotechnologischen Industrien weltweit ist ein herausragendes HTDS-System.
Mit der Verwendung von Open-Access-Mikrofluidik-Gewebe-Array-Systemen und Zell-Mikroarray-Chips können verschiedene Konzentrationen und Kombinationen von Medikamenten gescreent werden. Durch das unterschiedliche Design des Chips können verschiedene Konfigurationen und Anordnungen von kleinen Kulturkammern erzeugt werden. Konzentrationsgradientengeneratoren können einen effektiven Gradienten für die Flüssigkeitskonzentrationen bereitstellen, und diese Geräte wurden von mehreren Forschungsgruppen implementiert und mit Mikrofluidiktechnologien kombiniert, um HTDS-Systeme zu optimieren. Die diffusiven mikrofluidischen Mischer in Abbildung 8C könnte auch ein vollautomatisches HTDS erkennen.
Zellarray-Plattformen werden unter Verwendung von Polydimethylsiloxan (PDMS)-Material in bestimmten mikrofluidischen Kanälen für das Wirkstoff-Screening gebaut. Der Aufbau der Chips ist jedoch schwierig und hat einige Nachteile, wie teure Silikonformen und biomolekulare Absorption. Als natürliche extrazelluläre Matrix (ECM) hat Poly(ethylenglycol)diacrylat (PEGDA) Hydrogel identische mechanische Eigenschaften und Wassergehalt. Mikrofluidische Hydrogele aus PEGDA werden häufig zur Zellverkapselung verwendet und sind durchlässig für Verbindungen wie Wasser, Biomoleküle und Chemikalien. Um die kombinatorische Behandlungswirkung zweier Medikamente zu erforschen, wurden mikrofluidische Geräte aus solchen Materialien in Kombination mit 3D-Gehirnzellkulturtechnologien verwendet (Abbildung 8D).
Der Reiz des Mikrofluidik-Chips besteht darin, dass er verschiedene Funktionen erfüllen kann, mehrere entworfene Strukturen aufweisen und kombiniert werden kann, um seinen Anwendungsbereich mit verschiedenen Geräten und Testgeräten zu erweitern. Es sind jedoch erhebliche Konstruktions-, Herstellungs- und Optimierungsarbeiten erforderlich. Jedes Modell hat seine eigenen einzigartigen Eigenschaften. Es wird nicht nur für das Drogenscreening, sondern auch für Drogentests verwendet.
Protein-Mikroarray
In der Erforschung von Proteinen sind Protein-Microarrays nützliche Werkzeuge im unvoreingenommenen Hochdurchsatz, da sie die parallele Charakterisierung von bis zu Tausenden von einzeln gereinigten Proteinen ermöglichen. Die Anpassungsfähigkeit dieser Technologie hat es möglich gemacht, in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt zu werden, einschließlich der Untersuchung proteomweiter molekularer Wechselwirkungen, der Analyse posttranslationaler Veränderungen, der Entdeckung neuer Wirkstoff-Targets und der Bewertung von Pathogen-Wirt-Interaktionen . Darüber hinaus hat sich die Technologie bereits bei der Profilierung der Spezifität von Antikörpern sowie bei der Identifizierung neuer Biomarker insbesondere für Autoimmunerkrankungen und Krebs als wirksam erwiesen.
Proteine sind komplexe Biomoleküle mit einem großen Spektrum an Strukturen und Funktionen, daher ist ihre Erforschung im Hochdurchsatz eine Herausforderung. Es gibt drei Haupttypen von Protein-Mikroarrays: funktionelle, analytische und Umkehrphasen. Funktionelle Protein-Microarrays werden im Hochdurchsatz aus gereinigten/synthetisierten Proteinen zusammengesetzt, so dass Hunderte oder sogar Tausende verschiedener Proteine parallel auf ihre biochemischen Eigenschaften untersucht werden können. Um komplexe biologische Proben nachzuweisen oder zu messen, verwenden analytische Protein-Mikroarrays auf dem Array immobilisierte Affinitätsreagenzien. Schließlich werden komplexe biologische Proben, die auf dem Array immobilisiert sind, durch Umkehrphasen-Protein-Mikroarrays verwendet, die Affinitätsreagenzien zur Identifizierung verwenden.
Funktionelle Protein-Mikroarrays sind im Vergleich zu anderen Methoden wie der Massenspektrometrie besser in der Lage, schwache Wechselwirkungen zu identifizieren, sind flexibler für Proteine mit geringer Häufigkeit und können Rohproben wie Serum besser analysieren. In Bezug auf die Unterschiede in der Proteomabdeckung, Proteinlängen und Produktionspipelines wurden bisher mehrere verschiedene Arten von funktionellen Protein-Mikroarrays hergestellt.
Entwicklung des funktionellen Protein-Mikroarrays– Der gesamte Satz von Proteinen, der von einem Genom exprimiert werden kann, ist das Proteom. Typischerweise erfordert die Erstellung eines gereinigten Proteom-Mikroarrays den Zusammenbau eines genomweiten Satzes von offenen Leserahmen (ORFs), die in einen Expressionsvektor kloniert sind, eine kodierte Proteinexpression in Zellen, eine individuelle Proteinreinigung mit hohem Durchsatz und eine Proteinimmobilisierung auf einem Mikroarray .
Anwendung von Hefe-Proteom-Mikroarrays– Für die Profilierung von proteomweiten molekularen Wechselwirkungen sind funktionelle Protein-Mikroarrays, insbesondere gereinigte Proteom-Mikroarrays, nützlich und ermöglichen ein detailliertes, unvoreingenommenes Screening. Forscher haben funktionelle Protein-Mikroarrays in der Grundlagenforschung verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen, Protein-Lipid-Wechselwirkungen, Protein-DNA-Wechselwirkungen, Protein-Zelle/Lysate, Bindung kleiner Moleküle, Protein-RNA-Wechselwirkungen und PTMs wie Acetylierung, SUMOylierung, Glykosylierung, Ubiquitylierung, Phosphorylierung und Methylierung (Abbildung 9A-9G). In Tabelle I fassen wir repräsentative Studien basierend auf den Forschungsanwendungen in Abbildung 9.
Abbildung 9. Anwendung von funktionellen Protein-Mikroarrays
Anwendungen von Biochips
Die aufkommenden Anwendungen von Biochips sind in Tabelle 1 aufgeführt.
| Biochip in Lebensmitteln | Biochip zum Nachweis genetisch veränderter Organismen (GVO) in Lebensmitteln. |
| Biochip in der Diagnostik | DNA-Biochip, der die Art und Weise revolutioniert, wie Ärzte Bluttests durchführen. |
| Biochip bei Tuberkulose-Epidemie | Biochip-Technologie soll helfen, die neue Vielfalt arzneimittelresistenter Stämme der Krankheit zu bekämpfen. |
| Biochip bei Krebs | Die Biosensor-Chip-Technologie bietet schnellen und einfachen Zugriff auf wichtige Informationen zu DNA-Schäden durch krebserzeugende Verbindungen und hilft bei der Früherkennung von Dickdarmkrebs. |
| Biochip in der Medikamentenentwicklung | DNA-Chips, die genetische Unterschiede zwischen Menschen finden, die auf ein Medikament ansprechen, und solchen, die dies nicht tun, beginnend in Phase II oder im mittleren Stadium klinischer Studien. |
Test: LO3 Basisniveau
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Biosensoren & Biochips for Sustainable Future
Fortgeschrittenes Niveau
Das Gebiet der synthetischen Biologie ist in den letzten zehn Jahren explodiert und hat einen großen Einfluss auf Bereiche wie Metabolic Engineering, Protein Engineering, Digital Biology und Whole Genome Engineering.
Inhalt
Biosensoren & Biochips-Technologien: Beitrag zum nachhaltigen Leben der Zukunft
Das Gebiet der synthetischen Biologie ist in den letzten zehn Jahren explodiert und hat einen großen Einfluss auf Bereiche wie Metabolic Engineering, Protein Engineering, Digital Biology und Whole Genome Engineering. Im Rahmen von iterativen „Design-Build-Test“-Entwicklungszyklen hat ein bedeutender Teil der Innovationen der synthetischen Biologie stattgefunden. Im Bereich der Synthetischen Biologie kann Fortschritt mit Innovationen in jedem der Prozesse „Design“, „Build“ und „Test“ verbunden werden. So gab es beispielsweise einen großen Vorstoß zur Standardisierung von Elementen innerhalb der synthetischen Biologie, wobei der Modularität und „Plug-and-Play“-Komponenten große Aufmerksamkeit gewidmet wurde. Diese Modularisierung hat zusammen mit dem beschleunigten Fortschritt in der Systembiologie ermöglicht, dass die „Design“-Phase weniger zeitaufwändig und weniger abhängig von fortgeschrittenem Wissen ist. In den vergangenen Jahren sind die Kosten für die DNA-Sequenzierung und -Synthese ebenfalls dramatisch gesunken, was die kostengünstige Synthese großer Konstrukte ermöglicht. In der Bauphase hat dies eine schnelle Verbesserung ermöglicht und den Forschern geholfen, einen größeren Anteil des Raums der biologischen Lösung zu untersuchen. Schließlich ist innerhalb der „Test“-Phase der synthetischen Biologie auch das Hochdurchsatz-Screening in den Fokus gerückt. Das gestiegene „Design“- und „Build“-Potenzial hat zu einem erhöhten Erfolgsanspruch bei der Bewertung der Fülle neuer Designs beigetragen. Dies wiederum geschah durch die Einbindung von Robotern und Hochdurchsatzanalytik in das Laborumfeld, in dem neue Modelle auf einem Niveau evaluiert werden können, das für menschliche Forscher nicht erreichbar ist. Dadurch können große Konstrukte kostengünstig synthetisiert werden. In der Bauphase hat dies eine schnelle Verbesserung ermöglicht und den Forschern geholfen, einen größeren Anteil des Raums der biologischen Lösung zu untersuchen. Schließlich ist innerhalb der „Test“-Phase der synthetischen Biologie auch das Hochdurchsatz-Screening in den Fokus gerückt.
Biosensoren stellen eine bahnbrechende neue Technologie für das Hochdurchsatz-Screening dar, die implementiert werden kann. Genauer gesagt werden sie als analytisches Werkzeug klassifiziert, das aus biologischen Komponenten besteht, die zum Nachweis und zur Erzeugung eines Signals für die Anwesenheit eines Zielliganden verwendet werden. Die Synthetische Biologie steht an der Spitze der Biosensorik, sowohl als Werkzeug für das Hochdurchsatz-Screening, als auch als direktes Ergebnis von Entwicklungen auf dem Gebiet der Synthetischen Biologie selbst. Darüber hinaus haben Biosensoren aufgrund der beispiellosen Spezifität und Sensitivität, die biologische Teile im Vergleich zu herkömmlichen analytischen Methoden bieten, zunehmendes Interesse als Alternativen zur traditionellen Analytik gewonnen.
Das Design und der Bau von Biosensoren ist ein multidisziplinäres Unterfangen und kann Expertise in Bereichen wie Proteinengineering, Molekularbiologie, Affinitätschemie, Molekulardynamik von Nukleinsäuren, Materialwissenschaften und Nanotechnologie umfassen. Biosensoren verbinden sich in ihrem einfachsten Stadium mit einem Zielliganden, erfahren irgendeine Art von Modifikation und geben ein Signal aus. In allen Teilen dieses Prozesses gibt es eine große Vielfalt an möglichen Konfigurationen. Zielliganden reichen von einzelnen Atomen wie Calcium bis hin zu ganzen Proteinen wie Thrombin. So unterschiedliche Prozesse wie enzymatische Aktivität, Fluoreszenz, Erzeugung von elektrischem Strom und transkriptionelle Aktivität umfassen Ausgangssignale. Ebenso vielfältig sind die Mechanismen, die die Ligandenerkennung in funktionelle Signale umwandeln.
Im Bereich der Analytik stellen Biosensoren einen bedeutenden Fortschritt dar. Um die Analytik weg von rein physik- oder chemiebasierten Frameworks zu bewegen, hat die Integration biologischer Komponenten in die sensorische Diagnostik begonnen. Dies hat analytische Funktionen ermöglicht, die nicht gut an konventionelle Verfahren angepasst sind, um eine große Vielfalt und Spezifität biologischer Komponenten durchzuführen. Die theoretischen und demonstrierten Biosensoranwendungen decken einen bedeutenden Bereich der menschlichen Gesellschaft und Aktivität ab. Biosensoranwendungen werden je nach Messbereich in drei große Kategorien eingeteilt.
- Gruppendiagnostik: Umwelt-, Landwirtschafts- und Industrieanwendungen
- Point-of-Use-Diagnostik: Medizin- und Sicherheitsanwendungen
- Einzelzelldiagnostik: Metabolic Engineering und Anwendungen der synthetischen Biologie
Biosensoren & Biochips: Fortschritte in der medizinischen Diagnostik
Biosensoren bestehen aus einem Biokatalysator, der ein biologisches Element erkennen kann, und einem Transducer, der das Auftreten der Biokatalysator- und der biologischen Elementkombination in einen messbaren Parameter umwandeln kann.
Der Biokatalysator kann über Biomoleküle wie Enzyme, DNA, RNA, Metabolite, Zellen, Oligonukleotide usw. und elektrochemische, kalorimetrische, optische, akustische, piezoelektrische usw. der Wandler sein. Biosensoren, die immobilisierte Zellen, Enzyme und Nukleinsäuren verwenden, sind in den letzten Jahren in der Krankheitsdiagnostik auf den Markt gekommen. Für die Entwicklung krankheitsdiagnostischer Biosensoren wurden auch Nanobiosensoren verwendet, die die ultrakleine Größe und die einzigartigen Eigenschaften nutzen. Der Einsatz von Biosensoren kann schnell den Gesundheitszustand, den Ausbruch und das Fortschreiten der Erkrankung bestimmen und mit Hilfe einer multidisziplinären Kombination aus Chemie, Medizin und Nanotechnologie helfen, die Behandlung vieler Krankheiten vorzubereiten. Die Geräte sind kostengünstig, reaktionsschnell, schnell, benutzerfreundlich und können in großen Mengen für den menschlichen Gebrauch hergestellt werden.
Solche von Cammann geprägten Biosensoren sind analytische Instrumente, die ein elektrisches Signal in eine biologische Reaktion umwandeln. Biosensoren können in der Regel hochpräzise sein und sollten recycelbar und unabhängig von physikalischen Grenzen wie pH, Temperatur sein. Ein praktischer Ansatz zum Design eines Biosensors erfordert Herstellungs-, Immobilisierungs- und Transduktionsgeräte, die multidisziplinäre Forschungstechniken sowohl in der Chemie als auch in der Biologie bieten.
Aufgrund ihres Wirkmechanismus werden die diagnostischen Biosensoren in vier große Gruppen eingeteilt:
- Enzymbasierte biokatalytische Biosensoren
- Bioaffinitätsgruppe, dh Anwesenheit von Antikörper, Antigen und Nukleinsäure
- Mikroben, dh Mikroorganismen enthaltende Biosensoren
- Nanosensoren, dh aktive Nanopartikelsensoren, die typischerweise die Sensitivität und Spezifität für die Früherkennung von Krankheiten erhöhen
Diese verschiedenen Arten von Biosensoren helfen dabei, Hormonspiegel, Medikamente, Toxine, Schadstoffe, Schwermetalle, Pestizide usw. mit signifikanter Spezifität zu identifizieren.
Biosensoren sind Werkzeuge, die üblicherweise biologische Markerniveaus oder jede chemische Reaktion schätzen, indem sie Signale erzeugen, die hauptsächlich mit der Konzentration eines Analyten in der chemischen Reaktion in Verbindung stehen. Typischerweise helfen solche Biosensoren bei der Überwachung von Krankheiten, der Entdeckung von Medikamenten, der Erkennung von Schadstoffen, der Erkennung von Bakterien, die Krankheiten verursachen, und Markern, die normalerweise auf Krankheitszustände wie Körperflüssigkeiten (Speichel, Blut, Urin, Schweiß usw.) hinweisen. Ein typischer Biosensor ist in Abbildung 1. Gezeigt.
Abbildung 1. Schematische Darstellung des Biosensors
Ein typischer Biosensor besteht aus:
- Analyt: Eine Substanz von Interesse, wie Glukose für Diabetes, die bestimmt werden muss.
- Biorezeptor: Ein Biorezeptor für Enzyme kann ein Molekül sein, das den Analyten erkennt.
- Transducer: Normalerweise wird ein Bioerkennungsereignis in ein nachweisbares Signal umgewandelt, das als Signalisierung bezeichnet wird.
- Elektronik: In Anzeigeform verarbeitet sie typischerweise das umgewandelte Signal.
- Anzeige: Typischerweise ergibt sich die Flüssigkristallanzeige in Kombination mit Hard- und Software zur Biosensorgenerierung benutzerfreundlich.
Es gibt mehrere Biosensoranwendungen, die in verschiedenen Bereichen eingeführt wurden, z. B. in der Medizin, im Meeressektor, in der Lebensmittelindustrie usw., und diese Biosensoren sind oft auf eine verbesserte Empfindlichkeit und Linearität im Vergleich zu herkömmlichen Methoden programmiert. Die Anwendung von Biosensoren nimmt jedoch im Bereich der Medizin immer mehr zu.
Glukose-Biosensoren im Diabetesmanagement
Die Blutzuckerüberwachung ist zu einem wertvollen Instrument bei der Behandlung von Diabetes geworden, und die täglichen Blutzuckerspiegel werden typischerweise von konsultierten Klinikern aufrechterhalten, die eine Reihe von Blutzuckersensoren entwickelt haben. Diabetes mellitus ist die größte vorherrschende endokrine Störung des Kohlenhydratstoffwechsels mit einer höheren Morbidität und Mortalität in Entwicklungsländern. Bei Diabetikern sind Mehrfachtests zur Untersuchung und Überwachung von Diabetesmarkern üblich. Die wichtigsten Diagnosekriterien für Diabetes sind der Blutzuckerspiegel, zu dem auch die Selbstkontrolle des Blutzuckerspiegels durch Diabetiker gehört. Studien haben gezeigt, dass mikrovaskuläre (Nephropathie, Neuropathie und Retinopathie) und makrovaskuläre (koronare Herzkrankheit und Schlaganfall) Komplikationen durch Kontrolle des Blutzuckerspiegels im normalen Bereich verbessert werden können. Die Blutglukose wird bei gesunden Personen typischerweise im Bereich von 4,9-6,9 mM beobachtet und kann bei Diabetikern nach der Glukoseaufnahme auf bis zu 40 mM ansteigen. Obwohl verschiedene Arten von Glukosesensoren im Handel erhältlich sind, wird die dritte Generation von Glukose-Biosensoren gezeigt inFigur 2als Beispiel.
Abbildung 2. Glukose-Biosensor der dritten Generation
Erkennung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen mit Biosensoren
Die Zahl der weltweit durch Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) verursachten Todesfälle ist beträchtlich und mehr Menschen sterben an CVD als an jeder anderen Krankheit. Bis 2015 starben etwa 17,7 Millionen Menschen an Herz-Kreislauf-Erkrankungen, was insgesamt 31 % aller weltweiten Todesfälle entspricht. 7,4 Millionen davon waren auf eine koronare Herzkrankheit und 6,7 Millionen auf einen Schlaganfall zurückzuführen. Durch Medikamente und Therapie muss eine Person mit CVD früher erkannt und behandelt werden. Die aktuelle Strategie zur Erkennung von CVD basiert auf der traditionellen Methode, die normalerweise auf Tests basiert, die viele Stunden oder sogar Tage dauern können. Die WHO legt diese diagnostischen Kriterien fest, unter denen Patienten mindestens eine der Bedingungen wie Veränderungen im diagnostischen Elektrokardiogramm (EKG), Erhöhung biochemischer Marker in ihren Blutproben und charakteristische Brustschmerzen verfolgen sollten. Das EKG ist ein wichtiger Parameter für das Therapiemanagement, jedoch ist das EKG bei CVD ein schlechter diagnostischer Test, da die Hälfte der CVD-Patienten ein normales Kardiogramm aufweist, was die Diagnose dieser Erkrankung erschwert. Biosensoren helfen bei der schnellen Diagnose, bieten eine hervorragende Gesundheitsversorgung und reduzieren die Verzögerungszeit für die Verteilung der Ergebnisse, die für die Patienten eine immense Belastung darstellen kann.
Biosensor zur Erkennung von Krebs
Krebs ist eine der tödlichsten Krankheiten, und mehrere Forscher haben kürzlich Biosensoren zur Krebsfrüherkennung entwickelt. Die meisten Krebsarten werden typischerweise durch MRT-, Ultraschall- oder Biopsiemethoden diagnostiziert, die auf den physikalischen Eigenschaften und dem Vorhandensein des Tumors beruhen und entweder fortschrittliche oder invasive Instrumente identifizieren. Die Variationen der Gensequenzen, also Mutationen, verursachen in erster Linie Krebs und erfordern daher eine frühzeitige Diagnose, bevor die Krankheit fortschreitet. Die Krebsfrüherkennung macht die Behandlung schneller und erfolgreicher und eröffnet eine Biosensor-Plattform zur Erkennung von Krebsfrühstadien. Viele Experten gehen davon aus, dass bei Krebs eine Früherkennung möglich sein könnte, da Auffälligkeiten in der chemischen und genetischen Zusammensetzung lange vor Ausbruch der Krankheit erkannt werden können. Unkontrolliertes und unregelmäßiges Zellwachstum, das allgemein für Krebs gehalten wird, tritt aufgrund der Anhäufung einzigartiger genetischer Mutationen und epigenetischer Defekte auf. Die Tumorzellen sind resistent gegen Apoptose und die körpereigenen Abwehrmechanismen gegen Wachstum. Wenn es fortschreitet und beginnt, sich auf andere Körperorgane und -systeme auszudehnen, dh im Stadium der Metastasierung, wird der Krebs unheilbar. Die onkogene Stimulation und die Einschränkung der Funktion von Tumorsuppressorgenen (TSGs) sind die beiden wichtigsten Tumorentstehungsmechanismen. Aufgrund der Mutation oder Replikation eines normalen Gens (Proto-Onkogen) findet eine Aktivierung des Onkogens statt, das Schlüsselrollen einschließlich der Kontrolle des Zellwachstums, der Proliferation und/oder der Differenzierung spielt. Eine solche genetische Mutation führt das Gen dazu, eine überschüssige Menge seines Genprodukts zu produzieren, was zu einer Fehlregulation der Zellteilung, des Zellwachstums und der Tumorbildung führt. Viele Onkogene gelten als vielversprechende Krebsbiomarker für Wachstumsfaktorrezeptoren. Bei ~ 33 % aller Brustkrebserkrankungen ist der humane epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor Her-2 verstärkt, und Krebserkrankungen mit verstärktem Her-2 scheinen sich schneller zu entwickeln und zuzunehmen. Die Kenntnis des Her-2-Status ist daher für den Abschluss eines möglichen Medikationsverlaufs unerlässlich. Trastuzumab ist heute eine typische adjuvante Therapie für Patienten mit dieser Art von verstärkter Genexpression, ein rekombinanter humanisierter monoklonaler Antikörper, der auf Her-2 als unkomplizierte Behandlung von Brustkrebs abzielt. TSGs stehen im Zusammenhang mit der Kontrolle von unzureichendem Zellwachstum und -proliferation durch Minimieren oder Verhindern der Zellteilung. Retinoblastomprotein (Rb), BRCA1/2 und p53 sind drei der gut untersuchten TSGs bei Krebs. Rb ist ein Hauptregulator der Zellteilung, und Rb-Mutation spielt bei verschiedenen Krebsarten eine bedeutende Rolle. Die häufigsten Ursachen für die Inaktivierung des Rb1-Gens sind Punktmutationen und Deletionen. BRCA1 ist ein DNA-Reparaturenzym, das mit dem „Korrekturlesen“ von neu replizierter DNA auf Genauigkeit und Mutationensuche in Verbindung gebracht wird. Bis sich die Zelle teilt, arbeiten DNA-Reparaturenzyme normalerweise daran, Replikationsfehler auszuschneiden. BRCA1-Genmutationen sind für 50 % der erblichen Brustkrebserkrankungen und 80-90 % der erblichen Brust- und Eierstockkrebsarten verantwortlich. Schließlich ist das p53-Protein ein Hauptregulator der Apoptose oder des programmierten Zelltods. In Gehirn, Brust, Dickdarm, Lunge, hepatozellulären Karzinomen und Leukämie werden p53-Mutationen gefunden. Eine weitere signifikante Beteiligung am p53-Verlust besteht darin, dass er zum Resistenzmechanismus von Chemotherapeutika führt.
Biochip in der Diagnostik
Der DNA-Biochip eröffnet ein neues genetisch basiertes Feld der Diagnostik. Die Art und Weise, wie die Mediziner Bluttests durchführen, könnte durch einen neu entwickelten DNA-Biochip revolutioniert werden. Mit dem streichholzschachtelgroßen Biochip sind sie praktisch sofort da, ohne dass ein Patient mehrere Tage auf Ergebnisse aus einem Labor warten muss. Und ohne Einbußen bei der Genauigkeit erfordert es weniger Blut. Der DNA-Biochip reduziert den Bedarf an radioaktiven Markierungen für den Nachweis und spart zusätzlich Zeit. Für Techniker und Labormitarbeiter, die Proben handhaben und Tests durchführen, reduziert dies die Kosten und zukünftige Auswirkungen auf die Gesundheit erheblich. Es senkt auch die Entsorgungskosten, das nach strengen Vorschriften mit chemisch gekennzeichnetem Blut gehandhabt werden muss.
Ein Biosensor muss hochempfindlich und in der Lage sein, beispielsweise zwischen Bakterien, Viren oder anderen chemischen oder biologischen Spezies zu unterscheiden, um zum Nachweis von Verbindungen in einer Probe aus dem wirklichen Leben nützlich zu sein. Laut Vo-Dinh, der klarstellte, dass der Biochip die ausgeklügelten Erkennungsfähigkeiten eines lebenden Systems nachahmt, tun dies DNA-Biochips. Der DNA-Biochip ist ein auf Gensonden basierender Biosensor, im Gegensatz zu anderen Biosensoren, die auf Enzym- und Antikörpersonden basieren. Biosensoren auf Gensondenbasis bieten eine außergewöhnliche Selektivität und Sensitivität, was sie zu wertvollen Werkzeugen für die Diagnose genetischer Krankheiten und infektiöser Arten macht.
Biochip bei Tuberkulose-Epidemie
Die Entwicklung neuer Biochip-Technologien durch russische und amerikanische Wissenschaftler könnte Hoffnung machen, das weltweite Wiederaufleben der Tuberkulose zu stoppen. Die Technologie wurde vom Argonne National Laboratory des US-Energieministeriums und dem WA Englehardt Institute of Molecular Biology (Moskau) der Russischen Akademie der Wissenschaften entwickelt und soll helfen, die derzeitige Vielfalt arzneimittelresistenter Stämme der Krankheit zu bekämpfen.
Die Weltgesundheitsorganisation berichtet, dass an Tuberkulose mehr junge Menschen und Erwachsene sterben, einschließlich AIDS und Malaria zusammen, als an jeder anderen Infektionskrankheit. Die größte Herausforderung der anhaltenden Tuberkulose-Epidemie besteht darin, dass die Krankheit durch mehrere verschiedene Bakterienarten verursacht werden kann und jede einzelne gegen verschiedene Medikamente resistent ist. Das entscheidende Element bei der Kontrolle der Krankheit besteht darin, den Stamm zu bestimmen, der einen bestimmten Patienten betrifft, und das beste Antibiotikum zur Bekämpfung dieses Stamms zu bestimmen. Um zwischen zahlreichen Tuberkulose-Stämmen zu unterscheiden, will Argonne die Biochip-Technologie in der Forschung einsetzen. Zunächst würden Tests an Segmenten von genetischem Material durchgeführt, die Tuberkulosebakterien entnommen wurden. Biochips sind so konzipiert, dass sie gleichzeitig eine Reihe biochemischer Reaktionen durchführen und haben sich in Labortests als zufriedenstellend erwiesen. Da der Nachweis bestimmter Tuberkulosestämme Wochen oder Monate dauert, werden Patienten häufig mehrere Antibiotika gleichzeitig verschrieben.
Biochip bei Krebs
Die Biosensor-Chip-Technologie bietet auch schnellen und einfachen Zugang zu wichtigen Informationen über krebserregende DNA-Schäden, die die Forscher im Kampf gegen Krebs einen Schritt näher bringen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden der Biosensorik bietet eine laserbasierte, hochauflösende und Niedertemperatur-Fluoreszenzmethode einen präzisen Fingerabdruck des Moleküls. Möglicherweise fördert die einfache Handhabung den Ersatz invasiver endoskopischer Verfahren und hilft, Dickdarmkrebs frühzeitig zu erkennen.
Biosensoren & Biochips für Lebensmittel und Landwirtschaft
Die heutige Nahrungsmittelproduktion steht vor immensen Herausforderungen durch die wachsende Bevölkerung, die Erhaltung sauberer Ressourcen und Nahrungsmittelqualität sowie den Schutz von Umwelt und Klima. Lebensmittelnachhaltigkeit ist hauptsächlich eine gemeinsame Anstrengung, die zur Entwicklung von Technologien führt, die sowohl von Regierungen als auch von Unternehmen finanziert werden. Mehrere Versuche wurden unterstützt, um Herausforderungen zu überwinden und die Triebkräfte in der Lebensmittelproduktion zu verbessern. Biosensoren und Biosensor-Technologien werden über ihre Anwendungen weit verbreitet eingesetzt, um die großen Herausforderungen der Lebensmittelproduktion und deren Nachhaltigkeit zu lösen. Dadurch steigt der Bedarf an Biosensorik im Bereich der Lebensmittelnachhaltigkeit. Die Mikrofluidik definiert ein technologisches System, das mehrere Technologien kombiniert. Nanomaterialien mit ihrer Biosensor-Technologie, ist bekannt als das innovativste Instrument, das mit der Weltbevölkerung im Umgang mit Gesundheits-, Energie- und Umweltfragen eng verbunden ist. Der Bedarf an Point-of-Care-Technologie (POC) in diesem Bereich konzentriert sich auf Analysewerkzeuge, die schnell, einfach, präzise, kompakt und kostengünstig sind.
Für unsere Existenz und unser Leben ist Nahrung mit ihrer Produktionsindustrie unerlässlich; und ihre Nachhaltigkeit ist für das kontinuierliche menschliche Wachstum auf dem Planeten von wesentlicher Bedeutung. Die gegenwärtige Nahrungsmittelproduktion steht vor immensen Schwierigkeiten durch die Zunahme der menschlichen Bevölkerung, die Erhaltung sauberer Ressourcen und Nahrungsmittelqualität sowie den Schutz von Umwelt und Klima. Einige dieser Probleme stammen aus der Lebensmittelproduktion selbst; andere stammen aus anderen mit der Lebensmittelproduktion verbundenen Industrien. Lebensmittelrückrufe zum Beispiel verursachen mit schätzungsweise 15 Millionen US-Dollar pro Vorfall in den letzten Jahren großen Schäden für die Glaubwürdigkeit und das Prestige von Lebensmittelmarken. 48 Millionen Krankheitsfälle sind jährlich für 3000 Todesfälle durch lebensmittelbedingte Krankheiten verantwortlich.
Lebensmittelsicherheit ist weitgehend eine gemeinsame Anstrengung von Regierungen und Unternehmen in der Technologieentwicklung. Um neue Herausforderungen in Fragen der Lebensmittelsicherheit zu stellen, können Informationstechnologien wie die Blockchain-Technologie die Kommunikation zwischen Lebensmittelqualität, Medien und Verbrauchern beschleunigen. Fünf Herausforderungen können als die Hauptherausforderungen bei der Nachhaltigkeit der Lebensmittelproduktion zusammengefasst werden: die Herausforderung der Lebensmittelsicherheit bei der Produktion; die Qualitätsherausforderung der Lebensmittelvielfalt und -qualität; die wirtschaftliche Herausforderung im führenden Lebensmittelsystem, einschließlich seiner Verpackung und Lieferkette; die Umweltherausforderung, einschließlich der Verarbeitung von Lebensmittelabfällen; und die technische Herausforderung bei der Schaffung und Erzeugung neuartiger Lebensmittel.
Grundsätzlich ist ein Biosensor ein analytisches Instrument, das verwendet wird, um das interessierende Molekül (Ziel) einer Probe zu messen. Im Allgemeinen wird ein für das Ziel einzigartiger Bioerkennungsfaktor (Aptamer, Antikörper, Enzym usw.) verwendet. Durch molekulare Erkennungsereignisse zwischen dem Erkennungselement und der Zielverbindung wird ein physikalisch-chemisches oder biologisches Signal ausgelöst, das durch den Transducer in eine messbare Größe umgewandelt wird. Die Signale werden entweder optisch (kolorimetrisch, Fluoreszenz, Chemilumineszenz und Plasmonenoberflächenresonanz) oder elektrisch (Voltammetrie, Impedanz und Kapazität) oder in jedem anderen gewählten Format angezeigt (Abbildung 3).
Abbildung 3. Klassifizierung von Biosensoren basierend auf Transducer- und Bioerkennungselementen, die in der Lebensmittelanalyse verwendet werden
Als eines der Hauptziele der Lebensmittelanalyse ist die Lebensmittelsicherheit ein wichtiges Gesundheitsproblem sowohl für das Leben von Tieren als auch für den Menschen. Der Fortschritt der Analysetechnologie für die Lebensmittelsicherheit bedeutet, dass sie im Einklang mit dem steigenden Interesse an und dem Schwerpunkt auf Fragen der Lebensmittelversorgungssicherheit gedeiht. In der Lebensmittelsicherheitsanalyse sind traditionelle Ansätze arbeitsintensiv, zeitaufwändig und erfordern geschulte Techniker. Die Anwendung der Mikrofluidik in der Lebensmittelsicherheitsanalyse bietet neue Erkenntnisse darüber, wie durch Lebensmittel übertragene Toxine, Allergene, Krankheitserreger, Gefahrstoffe, Schwermetalle und andere Kontaminanten effektiv und schnell nachgewiesen werden können. Die Eigenschaften der Mikrofluidik, wie Miniaturisierungsfähigkeit, kompakte und reduzierbare Proben- und Reagenzienmengen, machen sie zu einer perfekten Technologie für die Entwicklung der Nachhaltigkeit von Lebensmitteln. Die komplexe Zubereitung der Lebensmittelmatrix und schwierige Herstellungsschritte sind die aktuellen Herausforderungen bei der Anwendung der Mikrofluidik auf die Nachhaltigkeit von Lebensmitteln. Diesen Herausforderungen kann begegnet werden, indem physikalische Eigenschaften in Abhängigkeit von spezifischen Testzielen genutzt, komplexe mikrofluidische Plattformen für die reale Lebensmittelanalyse entwickelt und Biomoleküle wie Lebensmittelproteine und DNA in mikrofluidische Systeme integriert werden.
Nanomaterialien in der Biosensorik
Mit ihrer Biosensor-Technologie sind Nanomaterialien das meistversprechendste Werkzeug im Umgang mit Gesundheits-, Energie- und Umweltproblemen der Bevölkerung in der Welt. Als Nanomaterialien werden Partikel bezeichnet, die in mindestens einer Größendimension kleiner als 100 nm sind. Bei diesen Nanomaterialien handelt es sich um Biokompositpolymere auf Basis von Metall, Metalloxid und Kohlenstoff, und es wurden verschiedene Arten von Nanopartikeln etabliert, wie magnetische Eisen-, Aluminium-, Gold-, Silber-, Kupfer-, Siliziumdioxid-, Zink-, Zinkoxid-, Ceroxid- und Titandioxid-Nanopartikel. und ein-/mehrwandige Kohlenstoffnanoröhren (CNTs). Die Nanotechnologie und ihre landwirtschaftliche Entwicklung wurden in verschiedenen Bereichen stark ausgeweitet. Zu diesen Bereichen gehören die Lebensmittelproduktion, der Pflanzenschutz, der Nachweis von Krankheitserregern und Toxinen, die Wasserreinigung, die Lebensmittelverpackung, die Abwasserentsorgung, und Umweltsanierung. Die Verbesserung der Produktivität und Leistung der Anwendungen ist die Priorität dieser landwirtschaftlichen Bereiche.
Im Bereich Lebensmittelsicherheit und -schutz wurden Biosensor-Technologien für den Nährstoff- und Qualitätsnachweis, den Nachweis von Krankheitserregern und den Nachweis von Toxinen entwickelt, wie unten aufgeführt.
Nährstoff- und Qualitätsnachweis
Lebensmittelschutzmaßnahmen können in zwei Kategorien unterteilt werden: Verlust nach der Ernte und Biosicherheit der Lebensmittel. Biosicherheit von Nahrungsmitteln bedeutet Kontamination und Degradation von Nahrungsmitteln, die in den späteren Abschnitten angesprochen werden, durch ökologische, politische, unfaire wirtschaftliche Gewinne, Krieg oder Rache. Andererseits deutet der Verlust nach der Ernte auf die Nährstoffe und essbaren Bedingungen in Lebensmitteln hin, die zwischen der Erntezeit und dem Moment des Verzehrs durch Technologien aufrechterhalten werden müssen. Da die Zeit von Minuten bis Jahren unterschiedlich ist, sind bei der Aufrechterhaltung und Reduzierung von Verlusten Technologien wichtig, die sich auf die Reduzierung von Nachernteverlusten konzentrieren.
Um die Lebensmittelqualität zu erhalten und Nachernteverluste zu vermeiden, können neue Technologien wie Biosensorik eingesetzt werden. Biosensoren wurden beispielsweise entwickelt, um Süßstoffmengen in Lebensmitteln zu erkennen und zu analysieren, mit denen sowohl natürliche als auch künstliche Süßstoffe nachgewiesen werden können. Süßstoffe werden häufig in der Lebensmittelproduktion und -verarbeitung verwendet, aber vor kurzem wurde festgestellt, dass sie beim Menschen gesundheitliche Probleme verursachen. Ein Mehrkanal-Biosensor wurde entwickelt, um die elektrophysiologische Erfassung von Geschmacksepithelien zu nutzen, um sowohl natürliche als auch künstliche Süßstoffe zu erkennen und zu analysieren. Um Langzeitsignale von Saccharose, Glucose, Cyclamat bzw. Saccharin zu erkennen, werden die Signale durch raumzeitliche Techniken untersucht. Der Biosensor kann zwischen verschiedenen Konzentrationen mit dosisabhängig erhöhten Reaktionen des Geschmacksepithels von verschiedenen Süßungsmitteln unterscheiden. Es kann auch zwischen zwei natürlichen Süßstoffen unterscheiden: Saccharose und Glukose, mit zwei Signalmustern. Für Glukose beträgt der Nachweisbereich 50–150 mM und für Saccharin 5–15 mM.
Nachweis von Krankheitserregern
Aufgrund ihres reduzierten Formats können Biosensoren zum Nachweis von Krankheitserregern wie Bakterien (Tabelle 1) und Pilzen (Tabelle 2) eingesetzt werden. Das begann vor mehr als zwei Jahrzehnten: ein Gerät, um mehrere Probleme zu beheben, und eine Multi-Panel-Signalerkennung. Das Ligandenmotiv ist ein entscheidendes Element im Biosensordesign für den Pathogennachweis, da es die Empfindlichkeit und Effizienz des Geräts bestimmt. Ziel ist es, eine schnelle, spezifische und sensitive Plattform zu etablieren, um in Lebensmittelproben das Vorhandensein oder Fehlen von Krankheitserregern nachzuweisen. Es wurde entdeckt, dass es keinen idealen Liganden gibt und verschiedene Liganden unterschiedliche Vorteile haben. Die Kombination von Biorezeptoren zum Nachweis einer großen Vielfalt von Mikroben in verschiedenen Proben stellt aktuelle Herausforderungen beim Nachweis von Pathogen-Biosensoren dar; neue synthetische Ligandendesigns wie Aptamere, kleine Moleküle und Peptide; und der Einbau verschiedener Liganden in ein tragbares Gerät, um einen schnellen, effektiven und kostengünstigen Nachweis zu erreichen.
Tabelle 1. Bedingungen für die Anzahl der in Milch gewachsenen Bakterien
| Temperatur °C | 24 Stunden | 48 Stunden | 96 Stunden | 168 Stunden |
|---|---|---|---|---|
| 0 | 2100 | 2100 | 1850 | 1400 |
| 4 | 2500 | 3600 | 218,000 | 4,200,000 |
| 8 | 3100 | 12,000 | 1,480,000 | |
| 10 | 11,600 | 540,000 | ||
| 15 | 180,000 | 28,000,000 | ||
| 30 | 1,400,000,000 |
Tabelle 2. Temperatur- und Wasseraktivitätsanforderungen für das Pilzwachstum
| Spezies | Minimum | Optimum | Maximal | Minimum | Optimum |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus ruber | 5 | 24 | 38 | 0.72 | 0.93 |
| A. amstelodami | 10 | 30 | 42 | 0.70 | 0.94 |
| A. flavus | 12 | 35 | 45 | 0.80 | 0.99 |
| A. fuminatus | 12 | 40 | 52 | 0.83 | 0.99 |
| A. niger | 10 | 35 | 45 | 0.77 | 0.99 |
| Penicillium martensii | 5 | 24 | 32 | 0.90 | 0.99 |
Nachweis von Toxinen
Der Hauptstrom der Entwicklung in der Lebensmittelsicherheit sind elektrochemische Biosensoren zum schnellen Nachweis und zur Bewertung von Lebensmittelgiften. Es wurden zahlreiche Plattformen entwickelt, um kundenspezifische und individualisierte Geräte zu ermöglichen, um besondere Umwelt- und Organisationsanforderungen zu erfüllen und die Nachweisgrenzen von nM bis fM zu erreichen. Um beispielsweise einzigartige Bindungsprofile zu fördern, adressieren Biorezeptor-Arrays einzelne Elektroden, die mit verschiedenen Biorezeptoren mit Bindungszielen funktionalisiert sind. Neben der elektrochemischen Biosensorik wurden Toxin- und chemische Detektion in der Lebensmittelproduktion auch auf andere Biosensoren wie optische und piezoelektrische Sensoren angewendet (Figur 4). Um Giftstoffe zu erkennen, wurden fluoreszierende Nanopartikel in Lebensmitteln und Körpern hergestellt, einschließlich oberflächlicher, inter- und intrazellulärer Lebensmittel.
Abbildung 4. Vorherrschende Lebensmittelkontaminanten und die Zielanalyten in der Lebensmittelindustrie
Die Toxinextraktion aus komplizierten Lebensmittelproben ist eines der Haupthindernisse bei der Entwicklung eines vollautomatischen Toxindetektors. Um ihre schädlichen Konzentrationen aus Lebensmittel- und Wasserproben automatisch zu bestimmen, wird erwartet, dass potenzielle Systeme Toxine extrahieren, verarbeiten und messen. Bei der Identifizierung, Unterscheidung und Quantifizierung chemischer Toxine in Lebensmittelmatrices wurden ausgeklügelte Trennstrategien mit SERS gekoppelt. Darüber hinaus können chemische Verunreinigungen aus der Lebensmittelverarbeitung eine Herausforderung darstellen, auch wenn sie normalerweise in geringeren Mengen vorliegen. Geringere Stabilität, Selektivität und Sensitivität sind eine weitere Herausforderung beim Nachweis von Lebensmitteltoxinen, bei denen MIPs eine Lösung sein können, um stabile und kostengünstige Alternativen bereitzustellen.
Schwermetalle wie Ag+, As3+, Cd2+, Hg2+, Pb2+ und Zn2+ sind als chemische Schadstoffe bekannt, die stabile Oxidationszustände bilden und Stoffwechselwege stören, was zu Gesundheitsproblemen führt. Aptamer- und DNA-basierte Biosensoren können Schwermetalle sowohl im Nanobereich als auch im sehr großen Maßstab nachweisen, was für das Screening und die Überwachung der Lebensmittelsicherheit geeignet ist. Um Arsenat in Lebensmitteln nachzuweisen, basiert ein schwermetalldetektierender Biosensor auf gentechnisch veränderten Bakterienzellen und einem grün fluoreszierenden Signalverstärker. Mit einem Detektionsbereich von 5-140 μg/L Arsen dauert die Arsen-Detektion nur eine Stunde und kann in die optische Ausgangsleistung für seine zukünftige Biosensor-Lichtleitfaser integriert werden. Andere Biosensortechnologien sind zum Beipiel Aptamere,
Die Nanotechnologie wurde auf zwei getrennte Bereiche von Pestiziden für die Landwirtschaft und Ernährung angepasst: als Träger von Pestiziden für das Pestizidmanagement und als Spurenmengendetektor für Pestizide. Im ersten Bereich sind Nanopartikel in der Lage, Pestizide langsam zu modifizieren, um Insektenschädlinge zu bekämpfen, was dazu beiträgt, die Verschmutzung des Grundwassers und des Oberbodens zu verhindern, den Pestizidgehalt zu senken und die Effizienz zu verbessern. Im zweiten Feld verbessert bio- oder biomimetisch basierte Nanotechnologie wie Antikörper, Enzyme, Aptamere und MIP-ähnliche Makromoleküle die Stabilität, Selektivität, Sensitivität und Nachweisgeschwindigkeit. Darüber hinaus sind Bakterien-, Pilz-, Algen- und Säugerzellen zellbasierte Biosensoren, die beim Nachweis von Pestiziden und Herbiziden verwendet werden und helfen, schnelle, zuverlässige, Echtzeit- und kostengünstige Werkzeuge für Dekontaminationsverfahren und präventive Unfallschäden zu entwickeln.
Karzinogene, Geruchsstoffe und Meeresschadstoffe sind weitere Giftstoffe, die bei der Lebensmittelproduktion von Bedeutung sind. Karzinogene sind eine komplexe Gruppe von Spuren von Toxinen, wie Pestizide, Schwermetalle, Mykotoxine und Acrylamid, bei denen die Schwierigkeit der Identifizierung von Spurenmengen eine Herausforderung darstellt; und geprägte Aptamere, Nanotechnologie und Biosensorik sind optimistisch für eine vielversprechende zukünftige Verwendung. Empfindliche und lösliche Moleküle, die bei der Geruchserkennung für olfaktorische Tiersysteme wirksam sind, sind geruchsbindende Proteine. Es wurde ein Nanosensor entwickelt, der lokalisierte SPR und kleine geruchsstoffbindende Proteine von Honigbienen kombiniert, wobei der Nachweisbereich 10 nM – 1 mM unter Verwendung einer quantitativen Anordnung von Nanobechern beträgt. Um eine stabile Umgebung für marine Nahrungssysteme zu überwachen und zu erhalten, wird die Erkennung von Meereskontaminanten verwendet.
Ein weiteres Entwicklungskit für Biosensoren für die Lebensmittelsicherheit konzentriert sich auf den Nachweis von genetisch veränderten Organismen (GVO) in Lebensmitteln. Seit den 1990er Jahren gelten GVO in allen Bereichen landwirtschaftlicher Produkte als biotechnologische Revolution. Derzeit sind mehr als 45 Prozent der weltweit angebauten Sojabohnen, 40 Prozent des Maises und 50 Prozent der Baumwolle gentechnisch veränderte Produkte; und GM wird auch in der Viehzucht verwendet. Neuere Forschungen zeigen jedoch, dass GVO-Produkte den menschlichen und tierischen Körper durch Magen-Darm-Probleme, Antibiotikaresistenz, Allergenität, Diversität des Abbaus von landwirtschaftlichen Produkten und unerwünschten Genfluss auf andere Arten beeinträchtigen können. Biosensoren wurden entwickelt, um GVO in Lebens- und Futtermitteln mit isothermer DNA-Amplifikation und schneller Erkennung von Signalen zu messen, um gv-Gene zu identifizieren.
Biosensoren & Biochips für die Umweltüberwachung
Aufgrund des starken Zusammenhangs zwischen Umweltverschmutzung und menschlicher Gesundheit/sozioökonomischem Fortschritt ist die Umweltüberwachung zu einer Priorität auf europäischer und globaler Ebene geworden. Biosensoren werden auf diesem Gebiet häufig als kostengünstige, schnelle In-situ- und Echtzeit-Analysetechniken verwendet. Die jüngste Entwicklung von Biosensoren mit neuen Transduktionsmaterialien aus der Nanotechnologie und für den Multiplex-Schadstoffnachweis unter Einbeziehung multidisziplinärer Experten erklärt den Bedarf an kompakten, schnellen und intelligenten Biosensorgeräten. Bei der Überwachung von Luft-, Wasser- und Bodenverunreinigungen durch Biosensoren unter realen Bedingungen gibt es mehrere neuere Entwicklungen, wie Pestizide, hochgiftige Komponenten und kleine organische Moleküle, einschließlich Toxinen und endokrin wirksamen Chemikalien.
Biosensoren, die in der Umweltüberwachung verwendet werden, können aufgrund ihrer Transduktion in optische (einschließlich Glasfaser- und Oberflächenplasmonenresonanz-Biosensoren), elektrochemische (einschließlich amperometrische und Impedanz-Biosensoren) und piezoelektrische (einschließlich Quarzkristall-Mikrowaagen-Biosensoren) oder als Immunsensoren, Aptasensoren, Genosensoren kategorisiert werden. Hinzukommen enzymatische Biosensoren, die sich auf ihren Erkennungselementen bzw. bei Verwendung von Antikörpern, Aptameren, Nukleinsäuren und Enzymen basieren lassen. Die meisten Biosensoren in der Umweltüberwachung werden als Immunsensoren und enzymatische Biosensoren anerkannt, aber die Entwicklung von Aptasensoren hat in letzter Zeit aufgrund der vorteilhaften Eigenschaften von Aptameren, wie einfache Modifizierung, thermische Stabilität, In-vitro-Synthese und die Fähigkeit, ihre Struktur zu entwerfen, zugenommen.
Die Studie zum Design von Biosensoren zur Überwachung von organischen Schadstoffen, potenziell toxischen Elementen und Krankheitserregern in der Umwelt hat aufgrund der Umweltverschmutzungsprobleme, mit denen die menschliche Gesundheit konfrontiert ist, zu einer nachhaltigen Entwicklung der Zivilisation geführt. Verschiedene chromatographische Techniken (wie Gaschromatographie und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Kombination mit Kapillarelektrophorese oder Massenspektrometrie) sind konventionelle Analysemethoden zur Umweltüberwachung von Schadstoffen, die jedoch teure Reagenzien, zeitaufwändige Probenvorbehandlung und teure Geräte erfordern. Also, zur Überwachung von Schadstoffen, die für schädliche Auswirkungen auf Lebensräume und die menschliche Gesundheit verantwortlich sind, für sensible, kostengünstige, schnellere, einfacher und kompaktere Biosensor-Geräte werden dringend benötigt, um die Vergrößerung von Umweltproblemen zu überwinden. Im Falle einer versehentlichen Freisetzung von Pestiziden oder einer akuten Vergiftung sind beispielsweise übliche Methoden nicht für In-situ-Messungen geeignet, bei denen schnelle, miniaturisierte und tragbare Geräte wie Biosensoren zur Umweltüberwachung erforderlich sind. In dieser Hinsicht ist die Rolle der Nanotechnologie bei der Entwicklung schneller und intelligenter Biosensorik-Geräte entscheidend für den Erfolg des Nachweises von Umweltschadstoffen. Die neuesten Biosensoren umfassen Nanomaterialien und neuartige Nanokomposite in ihren Systemen, die für die Verbesserung der analytischen Leistung, wie Empfindlichkeit und Nachweisgrenzen, von Vorteil sind. Gängige Methoden sind nicht für In-situ-Messungen geeignet, bei denen schnelle, miniaturisierte und tragbare Geräte wie Biosensoren zur Umweltüberwachung erforderlich sind. In dieser Hinsicht ist die Rolle der Nanotechnologie bei der Entwicklung schneller und intelligenter Biosensorik-Geräte entscheidend für den Erfolg des Nachweises von Umweltschadstoffen.
Für den Nachweis und die Überwachung verschiedener Umweltschadstoffe wurden Biosensoren, einschließlich Immunsensoren, Aptasensoren, Genosensoren und enzymatische Biosensoren, unter Verwendung von Antikörpern, Aptameren, Nukleinsäuren und Enzymen als Erkennungselemente dokumentiert.
Pestizide
Pestizide gehören aufgrund ihrer großen Präsenz in der Umwelt zu den bedeutendsten Umweltschadstoffen. In der Landwirtschaft werden beispielsweise phosphororganische Insektizide häufig verwendet und stellen eine Gruppe von Pestiziden dar, die aufgrund ihrer hohen Toxizität von immenser Umweltbelastung sind. Daher haben sich einfache, reaktionsschnelle und miniaturisierte In-situ-Methoden wie Biosensoren als analytische Strategien für deren Nachweis und Überwachung etabliert, ohne dass eine umfassende Probenvorbehandlung erforderlich ist.
Amperometrische enzymatische Einweg-Biosensoren (Acetylcholinesterase) wurden für den Nachweis von Organophosphor-Insektiziden unter Verwendung von Paraoxon als Modellanalyt vorgeschlagen, der eine selbstorganisierte Cysteamin-Monoschicht auf Gold-Siebdruckelektroden aufbringt. Die Einweg-Biosensoren zeigten ein lineares Spektrum von bis zu 40 ppb mit einer Nachweisgrenze von 2 ppb und einer Empfindlichkeit von 113 µA mM cm-2. Bei Verwendung der selbstorganisierten Monoschicht könnte ein gutes analytisches Ergebnis auf die stark orientierte Enzymimmobilisierung zurückzuführen sein. Nach Tests in Flusswasserproben, die mit 10 ppb Paraoxon versetzt waren, wurden Wiederfindungen von 97 ± 5 Prozent (n = 3) berichtet, was auf die Wirksamkeit solcher enzymatischer Biosensoren hinweist. Darüber hinaus entfallen durch den Einsatz von Einweg-Siebdruckelektroden zeitaufwändige Verfahren wie die Reaktivierung immobilisierter Enzyme unter Verwendung von z.B.
Nanopartikel auf Basis von Iridiumoxid wurden in dem enzymatischen Einweg-Biosensor mit Tyrosinase basierend auf kostengünstigen siebgedruckten Kohlenstoffelektroden zum Nachweis von Chlorpyrifos in Flusswasserproben verwendet. Es wurde über eine lineare Biosensorantwort (0,01–0,1 μM) und eine niedrige Nachweisgrenze (3 nM) berichtet, was auf die hohe Leitfähigkeit der Nanopartikel von Iridiumoxid und die Tyrosinase-Effizienz zurückzuführen sein könnte. Wiederfindungstests wurden in Flusswasserproben unter Zugabe von 0,1 μM Chlorpyrifos durchgeführt und es wurden Wiederfindungen von 90 ± 9,6 Prozent mit einer Reststandardabweichung (RSD) von weniger als 10 Prozent (n = 3) erzielt, um die Anwendbarkeit des Biosensors zu demonstrieren .
Acetamiprid wurde durch kolorimetrische Aptasensoren und Wasserproben durch impedimetrische Aptasensoren in realen Umweltproben, wie frischen Oberflächenbodenproben, nachgewiesen. Beim kolorimetrischen Aptasensor wurde ein linearer Bereich von 75 nM bis 7,5 μM und eine Nachweisgrenze von 5 nM beobachtet, während beim impedimetrischen Aptasensor ein breiterer linearer Bereich (50 fM bis 10 μM) und eine untere Nachweisgrenze (17 fM) beobachtet wurden. Goldnanopartikel, mehrwandige Kohlenstoffnanoröhren (MWCNT) und reduzierte Graphenoxid-Nanobänder wurden in diesem Biosensor als Verbundwerkstoff verwendet, um das Acetamiprid-Aptamer der Elektrodenoberfläche zu erhalten, das für einen höheren Elektronentransfer und eine verbesserte analytische Leistung des Biosensors verantwortlich sein könnte.
Krankheitserreger
Das Vorhandensein von Krankheitserregern in Umweltmatrizen und insbesondere in Wasserkompartimenten könnte ein ernsthaftes Risiko für die menschliche Gesundheit darstellen, und kürzlich wurden einige Biosensoren für die Überwachung der Umwelt vorgeschlagen. Beispielsweise wurden für den Nachweis von metabolisch aktiver Legionella pneumophila in komplexen Umweltwasserproben schnelle und präzise optische Biosensoren basierend auf Oberflächenplasmonenresonanz vorgeschlagen. In einer Studie beruhte das Nachweisprinzip auf der Identifizierung bakterieller RNA durch die immobilisierte RNA-Detektorsonde auf der Goldoberfläche des Biochips. Zur Signalverstärkung wurden Streptavidin-konjugierte Quantenpunkte verwendet, und die Nachweiszeit betrug ungefähr drei Stunden, was die Lebensfähigkeit der Biosensorvorrichtung für einen erfolgreichen Bakteriennachweis im Bereich von 104-108 KBE ml-1 anzeigt.
Potenziell giftige Elemente
Die Belastung der natürlichen Gewässer mit Schwermetallen und entsprechenden Ionen kann erhebliche Risiken für die menschliche Gesundheit darstellen und kompakte, kostengünstige und schnelle Schwermetallanalysen haben weltweit Priorität. Als Modelltarget zum Testen eines optischen DNA-Biosensors zum Nachweis extrem giftiger und in der Umwelt häufig vorkommender Schwermetallionen wurden Quecksilberionen (Hg2+) verwendet. Der Biosensor war kompakt, kostengünstig und schnell mit einem In-situ-Screening von Hg2+ in natürlichen Gewässern in weniger als 10 Minuten. Das Detektionsprinzip konzentriert sich auf die Fähigkeit bestimmter Metallionen, selektiv an bestimmte Basen zu binden, um stabile metallvermittelte DNA-Duplexe zu bilden; im Fall von Hg2+ können Thyminbasen selektiv koordiniert werden, um stabile Thymin-Hg2+-Thymin-Komplexe zu bilden. Im Nachweisbereich zwischen 0 und 1000 nM gilt eine Nachweisgrenze von 1.
Für den Nachweis von Pb2+ in Wasserproben (Teich- und Seewasserproben) unter Verwendung von DNAzymen/carboxylierten magnetischen Beads und DNA-Aptameren wurden kürzlich zwei fluoreszenzbasierte optische Biosensoren vorgeschlagen. Die Nachweisgrenzen von 5 nM bzw. 61 nM wurden von Biosensoren auf Basis von DNAzymen und DNA-Aptameren mit einem jeweiligen linearen Nachweisbereich von 0 bis 50 nM bzw. 100 bis 1000 nM eingehalten. Die Verwendung eines markierungsfreien einzigartigen Farbstoffs (SYBER Green I), der mit doppelsträngiger DNA interkaliert wurde und starke Fluoreszenzintensitäten zeigt, wie in Abbildung 5. Darüber hinaus wird das Fehlen der Biosensor-Fluoreszenzintensität nur mit dem Farbstoff beobachtet (Kurve a). Beim DNAzym + Pb2+ (Kurve b) nimmt die Fluoreszenzintensität mit der Zugabe von Farbstoff + DNAzym + Pb2+ zu, was die Sensitivität des Biosensors gegenüber Pb2+ verdeutlicht.
Abbildung 5. Fluoreszenzemissionsspektren zum Nachweis von Pb2+
Giftstoffe
Schädliche Toxine wie Brevetoxine und Microcystine werden durch die Eutrophierung aquatischer Systeme durch die Algenblüte von Cyanobakterien erzeugt, und daher werden genaue und kostengünstige Systeme zur Früherkennung solcher Toxine benötigt. Für den empfindlichen Nachweis von Brevetoxin-2, einem marinen Neurotoxin, wurde ein elektrochemischer Aptasensor verwendet, der aus Goldelektroden besteht, die mit selbstorganisierten Cysteamin-Monoschichten funktionalisiert sind. Es wurde eine Nachweisgrenze von 106 pg mL-1 erreicht und für Brevetoxin-2 wurde eine starke Selektivität gegenüber anderen Toxinen verschiedener Gruppen, wie Okadainsäure und Microcystin, beobachtet. Die Machbarkeit des Aptasensors zum Nachweis von Brevetoxin-2 in echten Proben wurde durch die Analyse von Schalentieren erreicht, und es wurden starke Wiederfindungen (102-110 Prozent) berichtet, was darauf hindeutet, dass keine Interaktion mit der Aptasensor-Antwort von der Schalentiermatrix vorliegt.
Endokrin wirksame Chemikalien
In Wasserproben wurde Bisphenol A als endokrin wirksame Chemikalie durch Aptasensoren nachgewiesen, die auf dem Fluoreszenzprinzip mit funktionalisierten Aptameren (Fluoresceinamidit) und Goldnanopartikeln basieren und auf evaneszenten Lichtwellenleitern basieren. Der optische Faseraptasensor für evaneszente Wellen war kompakt und erwies sich als schnell, kostengünstig, empfindlich und selektiv für den Nachweis von Bisphenol A in Wasserproben, wobei keine Vorkonzentrations- oder Behandlungsschritte erforderlich waren. Darüber hinaus kann der Aptasensor durch Regenerieren mit einer 0,5%igen Natriumdodecylsulfat (SDS)-Lösung und weiteres Waschen mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,2) für über hundert Testzyklen ohne merklichen Verlust an 90 s wiederverwendet werden (Effizienz). Ähnliche Nachweisgrenzen (0,1 und 0. 45 ng mL-1) wurden in beiden optischen Biosensoren beobachtet, bei denen die DNA-Molekülsonde, die die komplementäre Sequenz einer kleinen Fraktion des Bisphenol-A-Aptamers ist, durch elektrostatische Wechselwirkung an der Oberfläche von Goldnanopartikeln adsorbiert und auf der Oberfläche kovalent immobilisiert wurde der Faser. Für den Nachweis von Bisphenol A in Flusswasserproben mit Molybdäncarbid-Nanoröhren wurde kürzlich ein weiterer fluoreszenzbasierter Aptasensor vorgeschlagen. Mit einem solchen markierungsfreien, kostengünstigen und einfach zu verwendenden Aptasensor wurde eine niedrige Nachweisgrenze von 0.23 ng mL−1 erreicht. Die Spezifität des Aptasensors wurde durch die Analyse anderer Moleküle mit ähnlichen Strukturen wie Bisphenol A (z. B. 4,4J-Biphenol, Bisphenol AF und 4,
Ein wegwerfbarer und markierungsfreier elektrochemischer Immunsensor auf der Basis eines Feldeffekttransistors mit SWCNT wurde kürzlich in Meerwasserproben verwendet, um eine andere endokrinschädigende Chemikalie zu untersuchen – 4-Nonylphenol. Der Immunsensor hat eine hohe Reproduzierbarkeit (0,56 ± 0,08%), eine durchschnittliche Wiederfindung von 97,8% bis 104,6% und eine niedrige Nachweisgrenze (5 µg L-1), die unter der empfohlenen maximalen Konzentration von 7 µg L-1 liegt durch die entsprechenden Vorschriften. In Meerwasserproben wie 4-Nonylphenol könnte der Biosensor verwendet werden, um gefährliche prioritäre Stoffe selbst in niedrigen Konzentrationen und mit einer einfachen und kostengünstigen Methodik zu erkennen.
Andere Umweltverbindungen
Für die Früherkennung und Überwachung verschiedener anderer gefährlicher Verbindungen, die während der Algenblüte freigesetzt werden, wurden neue, schnelle und genaue Analysemethoden benötigt. Aufgrund der hervorragenden Sensitivität und Spezifität von Nukleinsäuresonden gegenüber ihren komplementären Bindungspartnern wurden Biosensoren zum Nachweis von Algen-RNA entwickelt. Für den verbesserten selektiven und sensitiven Nachweis von RNA aus 13 schädlichen Algenorganismen wurde kürzlich ein elektrochemischer Genosensor auf der Grundlage einer siebgedruckten Goldelektrode beschrieben; der Genosensor konnte RNA-Ziele von Umweltproben (Meerwasserproben mit Spikes) unterscheiden, die 105 Zellen enthielten, was als Nachweisgrenze gilt.
Test: LO3 Fortgeschrittenes Niveau
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