Βιολογικά συστήματα και τεχνολογία Omics

Αρχάριο επίπεδο

Τις τελευταίες δεκαετίες η ταχεία πρόοδος της μοριακής βιολογίας και τα επιτεύγματα σε αυτόν τον επιστημονικό τομέα συνδέονται άμεσα με την πρόοδο στις επιστήμες των υπολογιστών και την ανάπτυξη νέων εργαλείων λογισμικού.

Περιεχόμενα

Βιολογικά συστήματα και τεχνολογίες Omics: Η μεγάλη εικόνα

Βιολογικά κυτταρικά συστήματα: Πειραματικά δεδομένα από τα απλά omics στα σύνθετα omics

Διάφορα σκέλη των omics – Προκλήσεις στον συνδιασμό βιολογικής πληροφορίας

Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα των τεχνολογιών omics

TEST: LO1-Αρχάριο επίπεδο

Βιβλιογραφικές αναφορές

Βιολογικά συστήματα και τεχνολογίες Omics: Η μεγάλη εικόνα

Βιολογικά κυτταρικά συστήματα: Πειραματικά δεδομένα από τα απλά omics στα σύνθετα omics

Διάφορα σκέλη των omics – Προκλήσεις στον συνδιασμό βιολογικής πληροφορίας

Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα των τεχνολογιών omics

TEST: LO1-Αρχάριο επίπεδο

Βιβλιογραφικές αναφορές

 

Βιολογικά συστήματα και τεχνολογίες Omics: Η μεγάλη εικόνα

Τις τελευταίες δεκαετίες η ταχεία πρόοδος της μοριακής βιολογίας και τα επιτεύγματα σε αυτόν τον επιστημονικό τομέα συνδέονται άμεσα με την πρόοδο στις επιστήμες των υπολογιστών και την ανάπτυξη νέων εργαλείων λογισμικού. Η εφαρμογή διαφόρων τεχνολογιών που σχετίζονται με την τεχνολογία omics (γονιδιωματική, επιγενωμική, μεταγραφική, πρωτεομική, μεταβολική, κ.λπ.) οδηγεί στη συσσώρευση ευέλικτων βιολογικών δεδομένων και η συνδυασμένη ερμηνεία τους ανοίγει νέες δυνατότητες στους επιστήμονες να μετακινηθούν από τη μελέτη απομονωμένων βιολογικών μορίων προς μια ευρεία ανάλυση μεγάλων συνόλων βιολογικών μορίων. Οι βιολογικές επιστήμες έχουν γίνει επιστήμες μεγάλων δεδομένων, οι οποίες έχουν αυξανόμενη σημασία για την επίλυση προβλημάτων που αφορούν την ανθρώπινη υγεία και το περιβάλλον. Οι μεγάλες προκλήσεις των δεδομένων δεν είναι μόνο το μέγεθός τους αλλά και η αυξανόμενη πολυπλοκότητά τους.

Βιολογικά κυτταρικά συστήματα: Πειραματικά δεδομένα από τα απλά omics στα σύνθετα omics

Η βιολογία των κυτταρικών συστημάτων έχει αναδειχθεί ως ένα νέο πεδίο διεπιστημονικής μελέτης που έχει κερδίσει τεράστια προσοχή τα τελευταία χρόνια. Παρόλο που ο όρος «βιολογία συστημάτων» έχει χρησιμοποιηθεί με διάφορους τρόπους, είναι γενικά κατανοητό ότι περιγράφεται η έρευνα που συνδυάζει τη βιολογία με φαινομενικά διαφορετικούς κλάδους όπως η φυσική, η βιοχημεία, η μηχανική, η βιοστατιστική, τα μαθηματικά, η επιστήμη των υπολογιστών, η βιοπληροφορική και άλλα. Ο κύριος σκοπός αυτού του διεπιστημονικού πεδίου είναι να αποκτήσει μια παράλληλη εικόνα των βιολογικών συστημάτων σε μοριακό επίπεδο και να κατανοήσει πώς λειτουργούν ως σύνολο αντί για άθροισμα τμημάτων. Διασαφηνίζοντας τους μοριακούς μηχανισμούς και διαδικασίες σε διαφορετικά επίπεδα συστήματος στον οργανισμό ή ένα κύτταρο, θα μπορούσε να προβλεφθεί πώς αυτά τα συστήματα αλλάζουν με την πάροδο του χρόνου και υπό διαφορετικές συνθήκες. Η μεγάλη ποσότητα πληροφοριών που λαμβάνονται σε μοριακές βάσεις κυτταρικής φυσιολογίας και οργάνωσης θα μπορούσε να δώσει λύσεις σχετικά με ασθένειες, τοξικότητες, θεραπείες, ανακάλυψη φαρμάκων κ.λπ.

Η βιολογία συστημάτων ξεκίνησε ως ξεχωριστός κλάδος τη δεκαετία του 1950 με το έργο των θεωρητικών συστημάτων των Mihajlo Mesarovic και Ludwig von Bertalanffy στη γενική θεωρία συστημάτων. Η βασική ιδέα αυτής της θεωρίας είναι ότι η δυναμική οποιουδήποτε συστήματος είναι αποτέλεσμα των σχέσεων μεταξύ των ξεχωριστών μονάδων του που καθορίζουν τη λειτουργία του. Εκείνη την εποχή, μελετώντας διεξοδικά τα ένζυμα και την κινητική των ενζυμικών αντιδράσεων, οι βιοχημικοί, οπαδοί της θεωρίας του συστήματος, προσπάθησαν να εξετάσουν τη συμπεριφορά των βιοχημικών οδών ως δίκτυο αντί για ένα σύνολο των μερών του. Απομακρυνόμενος από τη βιοχημική περιοχή, ο Reinhart Heinrich ανέπτυξε θεωρητικές προσεγγίσεις για την περιγραφή και την ποσοτική διερεύνηση των οδών σηματοδότησης και ανέπτυξε μια θεωρία μεταβολικού ελέγχου. Η ανάγκη για μια ολοκληρωμένη προσέγγιση για μια πιο λεπτομερή μελέτη και κατανόηση των πολύπλοκων βιολογικών διεργασιών έγινε εμφανής.

Η βιολογία των συστημάτων εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τις βιολογικές πληροφορίες που λαμβάνονται από τη μοριακή βιολογία και / ή μεμονωμένες προσεγγίσεις ομικών, αλλά συχνά είναι σε μεγάλο βαθμό υποθετικές ή αναγωγικές. Στην αναγωγική προσέγγιση μελετώνται οι λειτουργικές ιδιότητες των επιμέρους μοριακών συστατικών στα πολύπλοκα βιολογικά συστήματα. Μετά την ολοκλήρωση του Προγράμματος Ανθρώπινου Γονιδιώματος, η σύγχρονη επιστήμη αναπτύχθηκε πέρα ​​από τη γονιδιοκεντρική άποψη της προηγούμενης γονιδιωματικής εποχής. Αυτή η περίοδος που χαρακτηρίζεται ως μεταγενετική εποχή χαρακτηρίζεται από σημαντικές αλλαγές στην διεξαγωγή της επιστημονικής έρευνας και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων και σύμφωνα με τον Bloom αυτό είναι το τέλος του «αφελούς αναγωγισμού». Παρ ‘όλα αυτά, το γεγονός πως αυτές οι κλασικές μέθοδοι από μόνες τους δεν μπορούν να παρέχουν πλήρη κατανόηση των ζωντανών οργανισμών, θα συνεχίσουν να αποτελούν ουσιαστικό στοιχείο κάθε βιολογικής έρευνας. Σε αυτό το πλαίσιο, η βιολογία των συστημάτων προκάλεσε τη θεμελιώδη αλλαγή στις παραδοσιακές προσεγγίσεις. Χρησιμοποιεί μια νέα ολιστική προσέγγιση που δημιουργεί υποθέσεις, εστιάζει στη μελέτη των υποσυστημάτων, η οποία επιτρέπει βαθύτερη κατανόηση της όλης διαδικασίας. Η πορεία χρήσης γαλακτόζης (GAL) του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae είναι ένα παράδειγμα της εφαρμογής της προσέγγισης Systems biology για την ανάγνωση και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων που προκύπτουν από την αναγωγική προσέγγιση (ένα γονίδιο/μία πρωτεΐνη κάθε φορά). Με βάση πειραματικά δεδομένα που ελήφθησαν από αναλύσεις πρωτεΐνης και RNA, καθώς και αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης -πρωτεΐνης και πρωτεΐνης -DNA και την ενσωμάτωσή τους σε ένα ενιαίο μοντέλο, δόθηκε νέα υπόθεση για τη ρύθμιση της οδού GAL, η οποία επαληθεύτηκε πειραματικά στη συνέχεια.

Με τη χρήση υπολογιστικών και μαθηματικών εργαλείων συλλέγεται και ενσωματώνεται μεγάλη ποσότητα πειραματικών δεδομένων από τη βιολογία των συστημάτων για την αποκάλυψη άγνωστων προτύπων και δημιουργίας υποθέσεων. Αυτή είναι μια σημαντική στρατηγική για να αποκτηθούν νέες ιδέες για τα βιολογικά συστήματα και επίσης να βοηθηθεί ο πειραματικό σχεδιασμό.

Η προσέγγιση των βιολογικών συστημάτων σε επίπεδο συστημάτων αποσκοπεί στην αποσαφήνιση των ακόλουθων τριών θεμάτων στο πλαίσιο του μοριακού δικτύου: i) ποια είναι τα επιμέρους συστατικά του συστήματος. ii) πώς λειτουργούν χωριστά και iii) πώς συνεργάζονται αυτά τα στοιχεία για να ολοκληρώσουν μια εργασία (3). Στο πλαίσιο των μοριακών δικτύων, ο βασικός σκοπός της βιολογίας των συστημάτων μπορεί να συνοψιστεί ως εξής: (i) κατανόηση της δομής όλων των συστατικών ενός κυττάρου / οργανισμού μέχρι μοριακού επιπέδου, (ii) ικανότητα πρόβλεψης μελλοντική κατάσταση του κυττάρου / οργανισμού κάτω από ένα φυσιολογικό περιβάλλον, iii) την ικανότητα πρόβλεψης των αποκρίσεων εξόδου για ένα δεδομένο ερέθισμα εισόδου, και iv) την ικανότητα εκτίμησης των αλλαγών στη συμπεριφορά του συστήματος μετά από διαταραχή των συστατικών ή του περιβάλλοντος.

Ο όρος «συστήματα» στη βιολογία των συστημάτων ορίζει διαφορετικό εύρος πολυπλοκότητας που κυμαίνεται από δύο μακρομόρια που αλληλεπιδρούν για την εκτέλεση μιας συγκεκριμένης εργασίας σε ολόκληρους οργανισμούς (Εικ.1).

Εικόνα 1. Κύριοι τύποι βιολογικών δικτύων. A. Αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών- πρωτεϊνών, B. Ρυθμιστικό δίκτυο γονιδίων, C. Μεταβολικά δίκτυα, D. Διαφορετικού τύποι δικτύων στο κύτταρο (9).

Έτσι, η βιολογία των συστημάτων μοιράζεται έναν κοινό επιστημονικό στόχο με την επιστήμη της φυσιολογίας που είναι αφιερωμένη στη μελέτη της ολοκληρωμένης λειτουργίας ολόκληρου του πολύπλοκου βιολογικού συστήματος. Οι οργανισμοί είναι πολύ περισσότεροι από το άθροισμα των μερών τους και η πολυπλοκότητα των φυσιολογικών διεργασιών δεν μπορεί να γίνει κατανοητή απλώς μελετώντας πώς λειτουργούν τα συστατικά μεμονωμένα. Για παράδειγμα, τα γονίδια κωδικοποιούν την κύρια δομή των κυτταρικών πρωτεϊνών που με τη σειρά τους εκτελούν συγκεκριμένες λειτουργίες που υποστηρίζουν τον μεταβολισμό των κυττάρων και τη φυσιολογία και την ανάπτυξη του οργανισμού. Ταυτόχρονα, οι πρωτεΐνες σε κάθε κύτταρο δεν δρουν μεμονωμένα αλλά σε ένα πολύπλοκο δίκτυο του οποίου είναι σημαντικό να προσδιοριστούν οι φαινότυποι. Οι περισσότερες βιολογικές διεργασίες είναι πολύ δυναμικές και συχνά περιλαμβάνουν περισσότερους από έναν τύπους μορίων. Ταυτόχρονα, ένας φαινότυπος μπορεί να εξαρτάται από διάφορους μοριακούς και επιγενετικούς μηχανισμούς και ένας τύπος μορίου μπορεί να εμπλέκεται σε διαφορετικούς φαινότυπους. Στην πραγματικότητα, ακόμη και στον ίδιο οργανισμό, μια πρωτεΐνη μπορεί να παίζει διαφορετικούς ρόλους σε διαφορετικά κύτταρα. Οι παράγοντες που επηρεάζουν τη διαδρομή του σήματος μπορεί να προκαλέσουν διάφορες διαφοροποιήσεις σε διαφορετικές κυτταρικές γενεές. Επιπλέον, σε πολυκύτταρους οργανισμούς, τα μεμονωμένα κύτταρα δεν έχουν ύπαρξη ανεξάρτητη από ολόκληρο τον οργανισμό, είναι οντογενετικά συνδεδεμένα.

Ανεξάρτητα από τον κοινό στόχο τους, η βιολογία και η φυσιολογία των συστημάτων χρησιμοποιούν διαφορετικά εργαλεία και πειραματικές προσεγγίσεις, γεγονός που οδηγεί στην απόκτηση διαφορετικού συνόλου πειραματικών δεδομένων. Η διεπιστημονική βιολογία των συστημάτων είναι μια σύγχρονη ταχέως εξελισσόμενη επιστήμη λόγω του ότι χρησιμοποιεί μια ποικιλία μεθόδων και εργαλείων, συμπεριλαμβανομένης της μεγάλης κλίμακας λειτουργικής γονιδιωματικής και άλλων τεχνολογιών omics, βιοπληροφορικής και μοντελοποίησης υπολογιστών, τα οποία δεν αξιοποιούνται από τους φυσιολόγους. Ο ρόλος της υπολογιστικής βιολογίας στη βιολογία των συστημάτων είναι να επεξεργάζεται και να αναλύει τεράστιες ποσότητες εμπειρικών δεδομένων που παράγονται από διαφορετικά επίπεδα omics, τα οποία με τη σειρά τους οδηγούν στην ανακάλυψη βιολογικής γνώσης και στη δημιουργία ερευνητικής υπόθεσης. Η εφαρμογή αναλύσεων πυριτίου και προσομοίωσης δίνει ευκαιρίες για προβλέψεις οι οποίες επιβεβαιώνονται περαιτέρω με πειραματικές δοκιμασίες. Η ταχεία πρόοδος των τεχνολογιών της πληροφορικής, συμπεριλαμβανομένης και της βελτίωσης των δημόσιων βάσεων δεδομένων βιολογικών πληροφοριών, υποστηρίζει επίσης την ανάπτυξη μελετών omics και οδηγεί αντίστοιχα στην πρόοδο της βιολογίας συστημάτων.

Προκειμένου να μελετηθούν συνολικά οι βιολογικές διεργασίες, είναι κρίσιμο να κατανοηθεί πώς τα ξεχωριστά βιολογικά στρώματα (γονιδίωμα, επιγονιδίωμα, μεταγράφημα, πρωτεώμα, μεταβολόμα και ιονώμα) αλληλοσυνδέονται μεταξύ τους σε ένα κυτταρικό σύστημα και πώς λαμβάνει χώρα η ροή των βιολογικών πληροφοριών. Ο συνδυασμός διαφορετικών αναλύσεων omics που χρησιμοποιούν προσέγγιση πολλαπλών omics απαιτούνται για τον σχεδιασμό μιας ακριβούς εικόνας των ζωντανών οργανισμών. Τα δεδομένα μεταγραφικής, πρωτεομικής και μεταβολικής μπορούν να απαντήσουν σε βασικά βιολογικά ερωτήματα σχετικά με την έκφραση μεταγραφών, πρωτεϊνών και μεταβολιτών, ανεξάρτητα, αλλά μια συστηματική πολυ-omics ολοκλήρωση μπορεί να αφομοιώσει, να σχολιάσει και να μοντελοποιήσει αυτά τα μεγάλα σύνολα δεδομένων.

Διάφορα σκέλη των omics – Προκλήσεις στον συνδιασμό βιολογικής πληροφορίας

Η μεταφορά γενετικών πληροφοριών σε βιολογικά συστήματα πραγματοποιείται από το DNA στο mRNA στην πρωτεΐνη και αυτό δηλώνεται ως το κεντρικό δόγμα στη μοριακή βιολογία. Οι τρεις κύριες διαδικασίες σε κάθε κύτταρο είναι η αντιγραφή, η μεταγραφή και η μετάφραση. Η συνεχής ροή τους εξασφαλίζει τη διατήρηση και μετατροπή των γενετικών πληροφοριών, που κωδικοποιούνται στο DNA σε γονιδιακά προϊόντα, τα οποία είναι είτε RNA είτε πρωτεΐνες, ανάλογα με το γονίδιο. Η αντιγραφή είναι μια διαδικασία αντιγραφής του DNA ενός κυττάρου και αποτελεί τη βάση για τη βιολογική κληρονομικότητα. Διεξάγεται από το ένζυμο της DNA πολυμεράση που αντιγράφει ένα μόνο γονικό δίκλωνο μόριο DNA σε δύο θυγατρικά δίκλωνα μόρια DNA. Το ένζυμο RNA πολυμεράση δημιουργεί ένα μόριο RNA από το DNA και αυτή η διαδικασία είναι γνωστή ως μεταγραφή. Το νεοσυντιθέμενο μόριο RNA είναι συμπληρωματικό σε ένα τμήμα DNA που κωδικοποιεί γονίδιο. Η μετάφραση παράγει πρωτεΐνη από mRNA. Το ριβόσωμα παράγει μια πολυπεπτιδική αλυσίδα αμινοξέων χρησιμοποιώντας mRNA ως πρότυπο. Η πολυπεπτιδική αλυσίδα διπλώνεται για να γίνει πρωτεΐνη. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, ή εκείνα τα κύτταρα που έχουν πυρήνα, η αντιγραφή και η μεταγραφή λαμβάνουν χώρα εντός του πυρήνα ενώ η μετάφραση πραγματοποιείται έξω από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Στα προκαρυωτικά κύτταρα, ή εκείνα τα κύτταρα που δεν έχουν πυρήνα, και οι τρεις διαδικασίες συμβαίνουν στο κυτταρόπλασμα. Ο φαινότυπος των οργανισμών καθορίζεται από αυτό το παράδειγμα μεταφοράς πληροφοριών. Οι βιολόγοι έχουν τα έχουν μελετήσει για χρόνια με τη μορφή γονιδιωματικών, μεταγραφικών και πρωτεϊνομικών. Τα δεδομένα από αυτές τις πειραματικές προσεγγίσεις συμπληρώνονται από επιγονιδιωματική και μεταβολική που χρησιμοποιούνται πρόσφατα για την επίλυση συγκεκριμένων προβλημάτων που αφορούν πολλές λειτουργίες ενός οργανισμού. Η ταχεία ανάπτυξη και πρόοδος στις τεχνολογίες omics καθορίζουν την προοδευτική επέκταση του όγκου των πληροφοριών που μπορούν να συγκεντρωθούν σε μεμονωμένες μελέτες. Επιπλέον, η τρέχουσα φύση υψηλής απόδοσης αυτών των τεχνικών έχει αυξήσει την προσβασιμότητα σε αυτές τις πληροφορίες από άποψη χρόνου και κόστους. Πολλοί ερευνητές βρίσκονται σε μια κατάσταση όπου μπορούν να συλλέξουν πολλά σύνολα δεδομένων omics στα ίδια πειραματικά δείγματα. Προκειμένου να ληφθούν πιο ολοκληρωμένα συμπεράσματα σχετικά με τις βιολογικές διεργασίες, αυτά τα σύνολα δεδομένων πρέπει να ενσωματωθούν με την προσέγγιση πολλαπλών omics και να αναλυθούν ως ένα ολιστικό σύστημα (Εικ. 2).

Εικόνα 2. Ολοκληρωμένες προσεγγίσεις omics της βιολογίας συστημάτων

Ο όρος «Omics» που προέρχεται από ελληνική λέξη και η προσθήκη του επιθήματος -ome στα κυτταρικά μόρια, όπως γονίδιο, μεταγραφή, πρωτεΐνη, μεταβολίτης, δίνει νόημα σε «ολόκληρο», «όλα» ή «πλήρη». Τα διαφορετικά στρώματα του κυττάρου, που αποτελούνται από DNA και τροποποιήσεις (γονιδίωμα, επιγενώμα), περιεκτικότητα σε RNA και πρωτεΐνη (Transcriptome, Proteome), μικρά μόρια (μεταβολόμη, λιπιδώμα) και στοιχειακή σύνθεση (μετρημένη ως «ιονόμα»), μπορούν να αναλυθούν με τεχνολογίες omics. Ο συνδυασμός των στρωμάτων omics σε ένα σύνολο δεδομένων πολλαπλών omics ενσωματώνεται μέσω ισχυρής βιολογίας συστημάτων που είναι σε θέση να αποκαλύψει μηχανισμούς και αλληλεπιδράσεις μεταξύ των στρωμάτων καθώς και τη λειτουργία των ιστών, των οργάνων και ολόκληρου του οργανισμού των κυτταρικών πληθυσμών. Οι προσεγγίσεις Omics περιλαμβάνουν μεγαλύτερο αριθμό μετρήσεων ανά τελικό σημείο και παρόλο που ο αριθμός των παραμέτρων που μετρούνται ανά ανάλυση αυξάνεται, ο αριθμός των επαναλήψεων μειώνεται. Αυτό αφενός οφείλεται στην υπερεκτίμηση των μεθόδων αφού θεωρείται ότι περισσότερες μετρήσεις θα αντισταθμίσουν έναν μικρό αριθμό δειγμάτων και αφετέρου οφείλεται στο κόστος και το χρόνο των πειραμάτων omics.

Οι μονό-omics κλάδοι στοχεύουν στη μελέτη συγκεκριμένων βιολογικών θεμάτων χωρίς να απαιτείται προηγούμενη κατανόηση των βιολογικών βάσεων που εμπλέκονται. Ανάλογα με τον τύπο του βιομορίου στο οποίο επικεντρώνονται κυρίως σε ένα συγκεκριμένο βιολογικό δείγμα, οι τεχνολογίες omics χωρίζονται σε: γονιδιωματικά (γονιδίωμα / γονίδιο), μεταγονιδιωματικά (γονιδιώματα που ανακτήθηκαν απευθείας από περιβαλλοντικά δείγματα), επιγενωμικά (υποστηρικτική δομή του γονιδιώματος, συμπεριλαμβανομένων πρωτεϊνών και RNA συνδετικά, εναλλακτικές δομές DNA και χημικές τροποποιήσεις στο DNA), μεταγραφικά (mRNA), πρωτεομικά (πεπτίδια / πρωτεΐνες), μεταβολικά (μεταβολίτες), λιπιδωμικά (λιπίδια) γλυκόζες (υδατάνθρακες και σάκχαρα), ιονομικά (ιόντα).

Αν και καμία από τις τρέχουσες τεχνολογίες omics δεν είναι τέλεια, μερικές από αυτές καταφέρνουν να παρέχουν μια πιο ολοκληρωμένη εικόνα του βιολογικού στρώματος που σκοπεύουν να μελετήσουν από άλλες. Αυτό το γεγονός οφείλεται όχι μόνο στις διαφορές στην κατάσταση των τεχνολογικών εξελίξεων, αλλά μάλλον στις διαφορές στη χημική και φυσική πολυπλοκότητα κάθε βιολογικού επιπέδου.

Γονιδιωματικά

Η γονιδιωματική είναι η συστηματική μελέτη όλων των γονιδίων ενός οργανισμού (το γονιδίωμα), συμπεριλαμβανομένων των αλληλεπιδράσεων αυτών των γονιδίων μεταξύ τους και με το περιβάλλον του οργανισμού. Το γονιδίωμα είναι το βασικό βιολογικό στρώμα στο κύτταρο και αντιπροσωπεύει το συνολικό DNA ενός κυττάρου ή οργανισμού. Το δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA) είναι η χημική ένωση που περιέχει όλες τις απαραίτητες γενετικές πληροφορίες που απαιτούνται για την ανάπτυξη και την κατεύθυνση των δραστηριοτήτων σχεδόν όλων των ζωντανών οργανισμών. Τα μόρια του DNA αποτελούνται από δύο περιστρεφόμενους, συζευγμένους κλώνους, που συχνά αναφέρονται ως διπλή έλικα. Κάθε κλώνος DNA αποτελείται από τέσσερις νουκλεοτιδικές βάσεις – αδενίνη (Α), θυμίνη (Τ), γουανίνη (G) και κυτοσίνη (C) που ζευγαρώνουν ειδικά σε αντίθετα σκέλη: Το Α ζευγαρώνεται πάντα με ένα Τ. Το C ζευγαρώνεται πάντα με ένα G. Μια αλληλουχία τριών παρακείμενων νουκλεοτιδίων (κωδικόνιο) κωδικοποιεί ένα συγκεκριμένο αμινοξύ κατά τη σύνθεση ή τη μετάφραση της πρωτεΐνης. Η σειρά των νουκλεοτιδίων κατά μήκος των μορίων του DNA καθορίζει τον γενετικό κώδικα. Ο γενετικός κώδικας είναι καθολικός επειδή είναι ο ίδιος μεταξύ όλων των οργανισμών και είναι επίσης εκφυλισμένος επειδή 64 κωδικόνια κωδικοποιούν μόνο 22 αμινοξέα. Με τη γλώσσα των τεσσάρων γραμμάτων, το DNA περιέχει τις πληροφορίες που απαιτούνται για τη δημιουργία ενός ολόκληρου οργανισμού. Ένα γονίδιο αντιπροσωπεύει τη μονάδα του DNA που φέρει κωδικούς για την παραγωγή μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης ή ενός συνόλου πρωτεϊνών. Με βάση την εγγενή συμπληρωματικότητα των νουκλεοτιδικών βάσεων στο DNA, κατέστη δυνατή η ταχεία αλληλουχία ενός τεράστιου αριθμού γονιδιωμάτων με σχετικά χαμηλό κόστος. Από την αποτελεσματικά προσδιορισμένη αλληλουχία γονιδιωμάτων θα μπορούσαν να γίνουν προβλέψεις για αλληλουχίες RNA και πρωτεϊνών οι οποίες συνδυάζονται στις πολυ-ομικές προσεγγίσεις. Η ψηφιακή μορφή των αλληλουχιών DNA ως ένα είδος βιολογικής πληροφορίας omics θα μπορούσε εύκολα να αποθηκευτεί σε βιολογικές βάσεις δεδομένων και να μοιραστεί μεταξύ επιστημόνων σε όλο τον κόσμο. Η αλληλουχία του πρώτου ολόκληρου γονιδιώματος του βακτηρίου Haemophilus influenza το 1995 έκανε μια επανάσταση στη μοριακή βιολογία. Παρήχθη ο μεγάλος όγκος δεδομένων ακολουθιών που ήταν πέρα ​​από το να ερμηνευτεί πλήρως. Η αποκρυπτογράφηση σχετικών γενετικών πληροφοριών από το γενετικό υλικό υπόβαθρο ήταν σχεδόν αδύνατη εργασία. Για να ξεπεραστεί αυτό, απαιτούνταν πιο λεπτομερείς βιολογικές πληροφορίες. Οι πληροφορίες σχετικά με τη μεταγραφή του γενετικού υλικού και την επακόλουθη παραγωγή πρωτεϊνών ήταν απαραίτητες.

Μια βασική ερευνητική κατεύθυνση στον τομέα της βιολογίας συστημάτων είναι η λειτουργική γονιδιωματική. Αυτή η πειθαρχία αναπτύσσει και εκμεταλλεύεται μεθοδολογίες μεγάλης κλίμακας και υψηλής απόδοσης με στόχο τον καθορισμό και την ανάλυση της γονιδιακής λειτουργίας σε παγκόσμιο επίπεδο. Είναι πολύ σημαντικό για την ανάπτυξη μιας συστημικής κατανόησης μιας βιολογικής διαδικασίας για τον προσδιορισμό των γονιδίων και των πρωτεϊνών που κωδικοποιούν και οι οποίες συνεργάζονται για να δημιουργήσουν αυτή τη διαδικασία. Η λειτουργική γονιδιωματική είναι ένα ενσωματωμένο επιστημονικό πεδίο που συνδυάζει πολλαπλά σύνολα δεδομένων μεγάλης κλίμακας σε προσπάθειες δημιουργίας πληροφοριών για τη γονιδιακή λειτουργία. Στην αρχή, τα γονίδια αναλύθηκαν μεμονωμένα, αλλά η πρόοδος των τεχνολογιών τα τελευταία χρόνια καθιστά δυνατή την ταυτόχρονη ανάλυση χιλιάδων γονιδίων. Αυτή η μεγάλης κλίμακας ανάλυση της γονιδιακής λειτουργίας ονομάζεται τεχνολογία μικροσυστοιχιών DNA (Εικ. 3).

Εικόνα 3. Σχέδιο ανάλυσης μικροσυστοιχιών DNA

Οι μικροσυστοιχίες DNA μετρούν τις διαφορές στην αλληλουχία DNA μεταξύ ατόμων και αυτή η τεχνολογία μπορεί να παρέχει πληροφορίες για τη λειτουργία μη χαρακτηρισμένων γονιδίων και μπορεί επίσης να αποκαλύψει ομάδες αλληλεπιδρώντων γονιδίων που προκαλούν μια βιολογική διαδικασία ενδιαφέροντος. Οι αναλύσεις μικροσυστοιχιών μπορούν επίσης να παρέχουν πληροφορίες για τους μηχανισμούς ρύθμισης των γονιδίων, την εξέλιξη και την αιτιολογία της νόσου. Για παράδειγμα, η ανάλυση δεδομένων μικροσυστοιχίας θα μπορούσε να αποκαλύψει ανωμαλίες όπως χρωμοσωμικές εισαγωγές και διαγραφές ή μη φυσιολογικούς χρωμοσωμικούς αριθμούς σε μια διαδικασία που ονομάζεται συγκριτική γονιδιωματική υβριδοποίηση. Οι πιο συνηθισμένες παραλλαγές στις αλληλουχίες του DNA μεταξύ των ανθρώπων είναι οι πολυμορφισμοί μεμονωμένων νουκλεοτιδίων (SNPs), στους οποίους ένα νουκλεοτίδιο αντικαθίσταται από ένα άλλο. Αυτό μπορεί να έχει λειτουργική σημασία εάν η αλλαγή καταλήξει σε κωδικόνιο για ένα διαφορετικό αμινοξύ. Έχουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον όταν συνδέονται με ασθένειες με γενετικό προσδιορισμό. Ο σχηματισμός πολυμορφισμού μεμονωμένων νουκλεοτιδίων έχει επίσης ρόλο στη φαρμακογονιδιωματική στην διερεύνηση των επιμέρους αποκρίσεων των ασθενών στα φάρμακα.

Επιγενωμική

Οι επιγενετικές τροποποιήσεις όπως η μεθυλίωση του DNA, τοι ροποποιήσεις της ιστόνης, η ανάλυση 2D και 3D της δομής της χρωματίνης και του μη κωδικοποιητικού RNA μελετώνται με τις μεθόδους της επιγενωμικής. Αυτή επικεντρώνεται στην ανάλυση των συνολικών επιγενετικών αλλαγών που παρέχει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τους μηχανισμούς και τη λειτουργία της γονιδιακής ρύθμισης σε πολλά γονίδια σε ένα κύτταρο ή οργανισμό. Οι επιστήμονες έχουν καταλάβει ότι ο φαινότυπος του ατόμου δεν ελέγχεται μόνο από το γονιδίωμα αλλά και από τις αλλαγές στη ρύθμιση των γονιδιακών δραστηριοτήτων. Γενετικά πειράματα σε ανθρώπους και ζώα απέδειξαν ότι, εκτός από την αλληλουχία του DNA, επιγενετικά σημάδια μπορεί να μεταδοθούν από τον γονέα στους απογόνους μέσω των γαμετών και να επηρεάσουν τον φαινότυπο των απογόνων.

Η επιγενωμική ορίζει τις τροποποιήσεις στη ρύθμιση των γονιδιακών δραστηριοτήτων που δρουν χωρίς, ή ανεξάρτητα από, αλλαγές στις γονιδιακές αλληλουχίες. Ορισμένοι ορισμοί περιορίζουν την επιγενετική/επιγενεμική σε τροποποιήσεις του φαινοτύπου χωρίς αλλαγές στην αλληλουχία του DNA που μεταδίδονται στις επόμενες γενιές. Οι επιγενετικές τροποποιήσεις είναι χημικές τροποποιήσεις, οι οποίες δεν κωδικοποιούνται από το γονιδίωμα και συντονίζουν τον τρόπο και το πότε τα γονίδια εκφράζονται. Η επιγενωμική διερευνά κληρονομικές, αναστρέψιμες τροποποιήσεις του DNA και της χρωματίνης που δεν επηρεάζουν τις πρωτογενείς νουκλεοτιδικές αλληλουχίες. Ενώ ο όρος επιγενεμική θα περιγράψει την ανάλυση των επιγενετικών αλλαγών σε πολλά γονίδια σε ένα κύτταρο ή σε ολόκληρο τον οργανισμό, η επιγενετική επικεντρώνεται σε διαδικασίες που ρυθμίζουν τον τρόπο και τον τρόπο ενεργοποίησης και απενεργοποίησης συγκεκριμένων γονιδίων. Διάφοροι παράγοντες είναι γνωστό ότι επηρεάζουν την επιγενετική ρύθμιση: 1) Διατροφή (διαιτητικοί παράγοντες), 2) Περιβαλλοντικοί παράγοντες, 3) Έκθεση σε ακτινοβολία, 4) Μολυσματικοί παράγοντες, 5) Ανοσολογικοί παράγοντες, 6) Γενετικοί παράγοντες, 7) Τοξικοί παράγοντες, και 8) Μεταλλαξιογόνα.

Ευέλικτες μέθοδοι ανίχνευσης μπορούν να εφαρμοσθούν για την ανάλυση επιγενετικών τροποποιήσεων στο κύτταρο. Η μεθυλίωση του DNA αναλύεται με δοκιμασίες πέψης και αλληλουχία διθειώδους DNA. Στις δοκιμασίες πέψης, το γονιδιωματικό DNA κατακερματίζεται με ευαίσθητες σε μεθυλίωση και μη ευαίσθητες σε μεθυλίωση ενδονουκλεάσες. Τα ευαίσθητα στη μεθυλίωση περιοριστικά ένζυμα διασπούν μόνο το μη μεθυλιωμένο DNA και αφήνουν τα μεθυλιωμένα θραύσματα DNA άπεπτα. Το κατακερματισμένο DNA μπορεί να αναλυθεί με προσδιορισμό αλληλουχίας ή μικροσυστοιχία, και έτσι χαρτογραφούνται οι θέσεις μεθυλίωσης. Το μειονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι μελετά μόνο τις αλληλουχίες DNA κοντά στους στόχους των επιλεγμένων ενζύμων περιορισμού και συνήθως χρησιμοποιείται για τον χαρακτηρισμό μόνο των παγκόσμιων επιπέδων μεθυλίωσης του DNA αντί για την ταυτοποίηση του μεθυλιωμένου DNA στο επίπεδο ενός υπολείμματος. Η ανάλυση βελτιώνεται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο αλληλουχίας διθειώδους. Αυτή η συγκεκριμένη μέθοδος για το σκέλος χρησιμοποιείται για τη μετατροπή της μη μεθυλιωμένης κυτοσίνης σε ουρακίλη, ενώ τα υπολείμματα μεθυλιωμένης κυτοσίνης παραμένουν ανεπηρέαστα. Το προκύπτον DNA ενισχύεται σε PCR και μπορεί να αναλυθεί με προσδιορισμό αλληλουχίας των περιοχών ενδιαφέροντος. Η ανάλυση μπορεί επίσης να γίνει χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας MALDI-TOF ή μικροσυστοιχίες. Η μεθυλίωση του DNA μπορεί επίσης να μελετηθεί μέσω μεθόδων που βασίζονται στην αρχή της χρωματογραφίας συγγένειας. Το δείγμα που περιέχει κατακερματισμένο DNA φορτώνεται σε μια στήλη με δεσμευμένη περιοχή σύνδεσης μεθυλίου (MBD) του MeCP2, ειδικά για μεθυλιωμένο DNA. Τα μεθυλιωμένα κλάσματα DNA εκλούονται και αναλύονται με τεχνικές σε όλο το γονιδίωμα όπως MBDCap-seq/MethylCap-seq. Μια άλλη προσέγγιση είναι η ανοσοκαταβύθιση μεθυλιωμένου DNA (MeDIP), η οποία βασίζεται στη ειδική σύνδεση αντισωμάτων με τη μεθυλιωμένη κυτοσίνη (5mC) στο DNA. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται επίσης για την ανάλυση υδροξυλιωμένης μεθυλοκυτοσίνης (5hmC). Τα καθαρισμένα θραύσματα αναλύονται με PCR, προσδιορισμό αλληλουχίας ή μικροσυστοιχία.

Μια ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική για τον εντοπισμό τροποποιήσεων ιστόνης είναι η ανοσοκαταβύθιση της χρωματίνης (ChIP). Χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό τοπικών μετα -μεταφραστικών τροποποιήσεων των ουρών ιστόνης και για την παρακολούθηση των αλλαγών στις τροποποιήσεις ως απόκριση σε διαφορετικά ερεθίσματα. Αντισώματα έναντι συγκεκριμένων τροποποιήσεων ιστόνης (όπως τριμεθυλίωση ιστόνης Η3 λυσίνης Κ27) χρησιμοποιούνται για ανοσοκαταβύθιση αυτών των περιοχών χρωματίνης που έχουν αυτές τις τροποποιήσεις. Το ChIP μπορεί επίσης να εφαρμοστεί για τη μελέτη της σύνδεσης παραγόντων μεταγραφής και ενζύμων στη χρωματίνη, χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα κατά του παράγοντα που μας ενδιαφέρει. Οι σχετικές περιοχές χρωματίνης μπορούν να αναλυθούν είτε με PCR για τον εντοπισμό συγκεκριμένων θέσεων είτε για βαθιά αλληλουχία για μια πιο σφαιρική εικόνα, καθώς και με τη χρήση μικροσυστοιχιών (ChIP-chip), αλλά στην τελευταία περίπτωση η ανάλυση των δεδομένων είναι ασθενέστερη σε σύγκριση με την αλληλουχία. Κατά τη διάρκεια της τελευταίας δεκαετίας αναπτύχθηκε η βασική μέθοδος ChIP που οδηγεί στην εμφάνιση άλλων διαφορετικών μεθόδων ChIP όπως μChIP-seq για χαμηλή, μικροκλίμακα ανάλυση ποσότητας δείγματος και τη σύγχρονη αλληλουχία σε πραγματικό χρόνο ενός μορίου (SMRT; ” αλληλουχία τρίτης γενιάς ») δειγμάτων ChIP.

Οι επιγενετικές τροποποιήσεις μπορούν επίσης να μελετηθούν με μεθόδους ταυτοποίησης των ενεργών περιοχών της χρωματίνης. Στη μέθοδο DNase-seq, το ένζυμο DNase Ι χρησιμοποιείται για την πέψη του DNA που δεν προστατεύεται από δομή νουκλεοσωμάτων, οπότε οι περιοχές που είναι ευαίσθητες στη DNase σχετίζονται με ενεργά γονίδια. Για την ανάλυση και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων μπορούν να χρησιμοποιηθούν τεχνικές αλληλουχίας, μικροσυστοιχίας ή Southern Blot. Η ανοικτή χρωματίνη μπορεί να ανιχνευθεί επίσης με απομόνωση ρυθμιστικών στοιχείων με τη βοήθεια φορμαλδεhyδης (FAIRE), η οποία έχει ως αποτέλεσμα την απομόνωση ανοικτών περιοχών χρωματίνης που έχουν εξαντληθεί από νουκλεοσώματα. Η μέθοδος FAIRE βασίζεται στη διασταύρωση μεταξύ φορμαλδεhyδης και DNA, ιστονών και άλλων πρωτεϊνών που σχετίζονται με αυτήν. Το DNA υποβάλλεται σε υπερήχους για να κατακερματιστεί και μετά απομονωθεί με εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμίου. Μόνο το DNA που δεν δεσμεύεται από τα νουκλεοσώματα και τις σχετικές πρωτεΐνες παραμένει στην υδατική φάση κατά την εξαγωγή, με αποτέλεσμα να απομονώνεται η ανοικτή και ενεργή περιοχή του γονιδιώματος. Τα απομονωμένα θραύσματα μπορούν να αναλυθούν ξανά με διαφορετικές μεθόδους, όπως PCR, μικροσυστοιχία και αλληλουχία. Η χρωματίνη μπορεί επίσης να μελετηθεί με τεχνική σύλληψης διαμόρφωσης χρωματίνης (3C) που προσδιορίζει τις περιοχές χρωματίνης που συνδέονται σωματικά μαζί, όπως προαγωγείς με ενισχυτές. Το 3C συχνά αναλύεται με PCR, αλλά στις μέρες μας επίσης με βαθιά αλληλουχία των αλληλεπιδράσεων παγκοσμίως (Hi-C).

Τα μη κωδικοποιητικά RNA (ncRNA) δρουν ως επιγενετικοί τροποποιητές για να ρυθμίσουν έντονα την γονιδιακή έκφραση. Η παρεκκλίνουσα έκφραση τους κυρίως με τη μορφή microRNA (miRNA) και μακρών μη κωδικοποιητικών RNA, μπορεί να τροποποιήσει την γονιδιακή έκφραση και να προκαλέσει περίπλοκες ανοσολογικές διαταραχές. Η ανάλυση του συστατικού RNA της επιγενετικής γίνεται συχνότερα σε κλίμακα γενωμικού σχήματος χρησιμοποιώντας μεθόδους αλληλουχίας επόμενης γενιάς. Οι αλλαγές στο ncRNA και mRNA μπορούν να χαρακτηριστούν με βαθιά αλληλουχία. Η έκφραση των RNAs μπορεί να αναλυθεί επίσης με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR). Η ποσοτική PCR επίσης γνωστή ως PCR πραγματικού χρόνου είναι μια εργαστηριακή τεχνική στη μοριακή βιολογία, με την οποία η ποσότητα του προϊόντος PCR μπορεί να προσδιοριστεί σε πραγματικό χρόνο και είναι πολύ χρήσιμη για τη διερεύνηση της γονιδιακής έκφρασης.

Μεταγραφική

Όταν τα γονίδια εκφράζονται, οι γενετικές πληροφορίες που αποθηκεύονται στο DNA μεταφέρονται στο RNA (ριβονουκλεϊκό οξύ). Τα RNA είναι σημαντικά μακρομόρια, που αποτελούνται από γραμμικές αλυσίδες νουκλεοτιδίων (Εικ. 4), τα οποία παράγονται από την κυτταρική διαδικασία μεταγραφής. Τα RNA εκτελούν ποικίλες κυτταρικές και βιολογικές λειτουργίες είτε χρησιμεύουν ως πρότυπα για τη σύνθεση πρωτεϊνών είτε παίζουν κρίσιμους καταλυτικούς και ρυθμιστικούς ρόλους. Κατά τη μεταγραφή, οι γενετικές πληροφορίες μεταφέρονται από το DNA στο mRNA. Αυτή η διαδικασία διεξάγεται από ένα ένζυμο RNA πολυμεράση. Υπάρχουν αρκετές κατηγορίες RNA σε κύτταρα (αγγελιοφόρα RNA (mRNA), RNA μεταφοράς (tRNA), ριβοσωμικό RNA (rRNA), μικρό πυρηνικό RNA (snRNA), μικρό πυρηνικό RNA (snoRNA), σύντομο παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA), μικρο RNA ( miRNAs), μακρό μη κωδικοποιητικό RNA και ψευδογόνα), αλλά αυτά που συμμετέχουν στη σύνθεση πρωτεϊνών είναι το αγγελιοφόρο RNA (mRNA), το RNA μεταφοράς (tRNA) και το ριβοσωμικό RNA. Το RNA αγγελιοφόρου (mRNA) είναι ένα μονόκλωνο μόριο που μεσολαβεί στη μεταφορά γενετικών πληροφοριών στα ριβοσώματα όπου συντίθενται οι πρωτεΐνες. Στα ευκαρυωτικά, κάθε γονίδιο μεταγράφεται για να δώσει ένα μόνο mRNA, ενώ στα προκαρυωτικά, ένα μόριο mRNA μπορεί να μεταφέρει τη γενετική πληροφορία από πολλά γονίδια, δηλαδή αρκετές περιοχές κωδικοποίησης πρωτεϊνών. Υπάρχει μια γραμμική αντιστοιχία μεταξύ της βασικής αλληλουχίας ενός γονιδίου και της αλληλουχίας αμινοξέων ενός πολυπεπτιδίου. Κάθε ομάδα τριών διαδοχικών νουκλεοτιδίων κωδικοποιεί τη θέση ενός συγκεκριμένου αμινοξέος σε ένα μόριο πρωτεΐνης και κάθε τέτοια τριπλή βάση ονομάζεται κωδικόνιο. Τα κωδικόνια μεταφράζονται σε αλληλουχίες αμινοξέων από ριβοσώματα (τα οποία αποτελούνται από πρωτεΐνες και rRNA), tRNA και βοηθητικές πρωτεΐνες που ονομάζονται παράγοντες μετάφρασης.

Εικόνα 4. Μονόκλωνη δομή του RNA με τις τέσσερις νουκλεοτιδικές βάσεις – αδενίνη, ουρακίλη, γουανίνη, κυτοσίνη.

Ο όρος «μεταγράφημα» χρησιμοποιείται ευρέως για να ορίσει το πλήρες σύνολο όλων των μορίων του ριβονουκλεϊκού οξέος (RNA) σε ένα κύτταρο, ιστό ή οργανισμό. Το μεταγράφημα αντανακλά τη μοριακή δραστηριότητα στα κύτταρα, τα γονίδια που εκφράζονται ενεργά κάθε δεδομένη στιγμή. Περιλαμβάνει όλες τις μορφές μορίων RNA συμπεριλαμβανομένης της κωδικοποίησης πρωτεΐνης, της μη πρωτεϊνικής κωδικοποίησης, εναλλακτικά συνδεδεμένων, εναλλακτικά πολυαδενυλιωμένων, εναλλακτικά εκκινούμενων, αίσθησης, αντινόημα και μεταγραφής με επεξεργασία RNA. Αντίστοιχα, η μεταγραφική μελέτη μελετά όλους τους τύπους μεταγραφών εντός ενός κυττάρου ή ενός οργανισμού, συμπεριλαμβανομένων των mRNA, των miRNA και διαφορετικών τύπων μακρών μη κωδικοποιητικών RNA (lncRNA). Η μεταγραφική καλύπτει τα πάντα που σχετίζονται με τα RNA όπως τα επίπεδα μεταγραφής και έκφρασης, οι λειτουργίες, οι τοποθεσίες, η διακίνηση και η υποβάθμιση. Περιλαμβάνει επίσης τις δομές των μεταγραφών και τα γονικά γονίδια τους σε σχέση με τις θέσεις έναρξης, τις ακολουθίες 5 ′ και 3 ′, τα μοτίβα συγκόλλησης και τις μετα -μεταγραφικές τροποποιήσεις.

Οι κυριότερες μελέτες μεταγραφικής στοχεύουν:

  • Στον χαρακτηρισμός διαφορετικών καταστάσεων κυττάρων (δηλαδή στάδια ανάπτυξης), ιστών ή φάσεων κυτταρικού κύκλου με μοτίβα έκφρασης.
  • Στην διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τον φαινότυπο.
  • Στις ταυτοποιήσεις βιοδεικτών που εκφράζονται διαφορετικά μεταξύ της ασθενούς και της υγιούς κατάστασης.
  • Στη διαφοροποίηση σταδίων ή υποτύπων της νόσου (π.χ. στάδια καρκίνου).
  • Στη δημιουργία της αιτιολογικής σχέσης μεταξύ γενετικών παραλλαγών και μοτίβων γονιδιακής έκφρασης για να φωτιστεί η αιτιολογία των ασθενειών.

Κατά τη διάρκεια των τελευταίων τριών δεκαετιών, η τεχνολογική πρόοδος έχει φέρει επανάσταση στη μεταγραφή προφίλ και επαναπροσδιορίζει τι είναι δυνατό να διερευνηθεί. Η ενσωμάτωση μεταγραφικών δεδομένων με άλλα ομόλογα δίνει μια ολοένα και πιο ολοκληρωμένη εικόνα των κυτταρικών περιπλοκών διευκολύνοντας τις ολιστικές προσεγγίσεις στη βιοϊατρική έρευνα.

Οι κυριότερες τεχνικές που εφαρμόζονται για τη μελέτη μεταγραφής είναι:

  • Methods Μέθοδοι βασισμένες στην ετικέτα ακολουθίας (EST)
  • SAGE
  • Micro Μικροσυστοιχία με βάση τον υβριδισμό
  • PC PCR σε πραγματικό χρόνο
  • Methods Μέθοδοι αλληλουχίας RNA (RNA-seq) που βασίζονται σε NGS,
  • Inter Παρεμβολή RNA
  • Εργαλεία βιοπληροφορικής για ανάλυση μεταγραφών.

Η επιλογή της τεχνικής εξαρτάται από την αποδοτικότητα κόστους, την ευαισθησία, την υψηλή απόδοση και την ελάχιστη συγκέντρωση του αρχικού RNA. Η μεθοδολογία περιλαμβάνει απομόνωση RNA, καθαρισμό, ποσοτικοποίηση, κατασκευή βιβλιοθήκης cDNA και αλληλουχία υψηλής απόδοσης.

  • Μέθοδοι εκφραζόμενης αλληλουχίας (EST): παρουσία της συγκεκριμένης αλληλουχίας κωδικοποίησης στο γονιδιωματικό DNA. Η αλληλουχία των EST δίνει μια επισκόπηση του επιπέδου έκφρασης του γονιδίου. Καθώς όλο και περισσότερα στοιχεία EST έχουν γίνει δημόσια διαθέσιμα, η χρήση των ESTs έχει επεκταθεί σε άλλους τομείς, όπως στην ανακάλυψη γενετικών δεικτών πυριτίου, στην ανακάλυψη γονιδίων πυριτίου, στην κατασκευή γενετικών μοντέλων, στην εναλλακτική πρόβλεψη συγκόλλησης, στον σχολιασμό του γονιδιώματος, στο προφίλ έκφρασης και συγκριτική γονιδιωματική. Σε σύγκριση με τον προσδιορισμό ολόκληρου του γονιδιώματος, η τεχνολογία EST είναι απλούστερη και λιγότερο δαπανηρή, ειδικά στην περίπτωση μεγάλων γονιδιωμάτων. Υπάρχουν βάσεις δεδομένων EST όπως το dbEST (NCBI EST) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/dbest/) που περιέχουν δεδομένα αλληλουχίας και άλλες πληροφορίες για αλληλουχίες cDNA “μονής διέλευσης” ή “Expressed Ετικέτες ακολουθίας “, από έναν αριθμό οργανισμών και έτσι χρησιμεύουν ως αναφορά για το προφίλ έκφρασης ενός οργανισμού.
  • Η σειριακή ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης (SAGE) είναι μια μεταγραφική τεχνική που χρησιμοποιείται από τους επιστήμονες για να δημιουργήσει ένα στιγμιότυπο του πληθυσμού του αγγελιοφόρου RNA σε ένα δείγμα ενδιαφέροντος με τη μορφή μικρών ετικετών που αντιστοιχούν σε θραύσματα αυτών των μεταγραφών. Αυτή η τεχνική είναι πλεονεκτική έναντι του EST επειδή ακολουθούνται μόνο σύντομες “ετικέτες” περίπου 15 βάσεων. Τα σύντομα θραύσματα που δημιουργούνται στη συνέχεια ενώνονται και αλληλουχούνται. Μια δεξαμενή cDNA μπορεί να υποβληθεί σε NGS υψηλής απόδοσης γνωστό ως RNA-seq για ποσοτικοποίηση, ανακάλυψη νέων EST και προφίλ RNA.
  • Το τσιπ DNA, το τσιπ γονιδίων, το βιοτσίπ ή η μικροσυστοιχία είναι μια συλλογή κηλίδων DNA, cDNA, ολιγονουκλεοτιδίων προσαρτημένων σε ένα στερεό υπόστρωμα όπως γυαλί ή τσιπ πυριτίου. Μέσω αυτής της μεθόδου που βασίζεται σε υβριδισμό, τα επίπεδα έκφρασης χιλιάδων γονιδίων παρακολουθούνται ταυτόχρονα. Ο κυριότερος περιορισμός αυτής της τεχνολογίας είναι ότι οι πληροφορίες αλληλουχίας του γονιδιώματος αποτελούν προϋπόθεση και επίσης απαιτείται υψηλότερο υπόβαθρο της τεχνικής υβριδοποίησης.
  • Η ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο (qRT-PCR) είναι ένας τύπος PCR για αξιόπιστη ποσοτικοποίηση mRNA χαμηλής αφθονίας ή μεταγραφών χαμηλής αντιγραφής. Τα κυριότερα πλεονεκτήματα αυτής της τεχνικής είναι η υψηλή ευαισθησία, η καλύτερη αναπαραγωγιμότητα και το μεγάλο δυναμικό εύρος ποσοτικοποίησης. Διευκολύνει τις γονιδιακές εκφράσεις και τις μελέτες ρύθμισης ακόμη και σε ένα μόνο κύτταρο με βάση την ικανότητα εκθετικής ενίσχυσης. Η διαθεσιμότητα διαφόρων τύπων συστήματος παρακολούθησης φθορισμού που συνδέονται με την PCR οδήγησε στη δημοτικότητά του για μελέτες γονιδιακής έκφρασης. Τα προβλήματα της μη ειδικής ενίσχυσης, του σχηματισμού διμερών εκκινητών είναι μερικοί από τους περιορισμούς της qRT-PCR.
  • Ο προσδιορισμός αλληλουχίας RNA είναι μία από τις προηγμένες τεχνολογίες υψηλής απόδοσης για μεταγραφικά. Το RNA-seq, επίσης γνωστό ως αλληλουχία κυνηγετικών όπλων ολόκληρου-μεταγραφικού, χρησιμοποιεί εργαλεία NGS. Τα πλεονεκτήματα του RNA-seq είναι ότι δεν βασίζεται στη διαθεσιμότητα της αλληλουχίας γονιδιώματος, δεν έχει ανώτερα ποσοτικά όρια, δείχνει υψηλή αναπαραγωγιμότητα και διαθέτει μεγάλο εύρος δυναμικής ανίχνευσης.

Η πρόοδος της μεταγραφικής οδήγησε σε μια σειρά βιολογικών ανακαλύψεων. Αυτή η τεχνολογία omics έθεσε τα θεμέλια των πρώτων πραγματικών πολυ-omics μελετών, βασισμένες στις συγκρίσεις μεταξύ αλληλουχίας DNA και έκφρασης mRNA. Σήμερα, η μεταγραφική ανάλυση εξακολουθεί να χρησιμοποιείται συχνότερα από τους περισσότερους βιολόγους, δεδομένου ότι τα δεδομένα που λαμβάνονται είναι ακόμη πιο εύκολα αναλύσιμα από άλλες τεχνικές όπως η πρωτεομική και η μεταβολική. Πιο πρόσφατα, η μεταγραφική απολαμβάνει μια δεύτερη αναβίωση, καθώς σε πολλές περιπτώσεις εφαρμόζεται σε μεμονωμένα κύτταρα.

Πρωτεομική

Οι πρωτεΐνες διοικούν την κυτταρική δομή και δραστηριότητα, παρέχουν τους μηχανισμούς σηματοδότησης μεταξύ κυττάρων και ιστών και καταλύουν χημικές αντιδράσεις που υποστηρίζουν τον μεταβολισμό. Η πρωτεϊνική δομή υπαγορεύει τη λειτουργία (ή τη δυσλειτουργία). Οι πρωτεΐνες μπορεί να είναι η βασική αιτία ασθενειών (όπως η νόσος του Αλτσχάιμερ ή του Χάντινγκτον) και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη θεραπεία της (π.χ., τα αντισώματα χρησιμοποιούνται ως θεραπευτικά ενάντια σε ιογενείς και βακτηριακές λοιμώξεις). Το σύνολο όλων των εκφρασμένων πρωτεϊνών σε ένα βιολογικό σύστημα υπό συγκεκριμένες, καθορισμένες συνθήκες είναι γνωστό ως πρωτεόμη. Η λέξη «πρωτεόμη» είναι ένας συνδυασμός πρωτεΐνης και γονιδιώματος και επινοήθηκε από τον Mark Wilkins το 1994.

Ο κύριος στόχος της πρωτεομικής είναι η πειραματική ανάλυση μεγάλης κλίμακας της δομής και της λειτουργίας ολόκληρου του συνόλου πρωτεϊνών που παράγονται από έναν ζωντανό οργανισμό. Ο όρος «πρωτεομικά» εμφανίστηκε για πρώτη φορά το 1997 και αναφέρεται σε μια βασική τεχνολογία στις προσεγγίσεις της βιολογίας συστημάτων που μελετά το πρωτέωμα. Η λειτουργία των κυττάρων εξαρτάται από τις πρωτεΐνες που υπάρχουν στον ενδο- και μεσοκυττάριο χώρο και την αφθονία τους. Η σύνθεση πρωτεϊνών στο κύτταρο βασίζεται σε πρόδρομους mRNA αλλά είναι αδύνατο να προβλεφθεί η αφθονία συγκεκριμένων πρωτεϊνών μόνο με βάση την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης. Ο λόγος για αυτό είναι ότι οι φυσικές πρωτεΐνες υφίστανται μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις (PTM) ή αλλοιώσεις ως απόκριση των αλλαγών στο περιβάλλον. Το πρωτεόμη είναι μια δυναμική αντανάκλαση τόσο των γονιδίων όσο και του περιβάλλοντος και είναι μια πολύτιμη πηγή για την ανακάλυψη των βιοδεικτών, επειδή οι πρωτεΐνες πιθανότατα επηρεάζονται στις ασθένειες και την ανταπόκριση της νόσου. Ο πλήρης χαρακτηρισμός όλων των πρωτεϊνών ήταν ο στόχος της πρωτεομικής από την έναρξή της πριν από σχεδόν 25 χρόνια. Τείνει να κάνει περισσότερα από την απλή ταυτοποίηση πρωτεϊνών που ενδέχεται να υπάρχουν σε ένα δείγμα, αλλά και την αξιολόγηση της αφθονίας της πρωτεΐνης, του εντοπισμού, των μεταφραστικών τροποποιήσεων, των ισομορφών και των μοριακών αλληλεπιδράσεων. Η πρωτεομική στοχεύει στη μελέτη της ροής βιολογικών πληροφοριών μέσω μονοπατιών και δικτύων πρωτεϊνών, με τελικό στόχο την κατανόηση της λειτουργικής συνάφειας των πρωτεϊνών. Αυτό απαιτεί την ανάπτυξη τεχνολογιών που μπορούν να ανιχνεύσουν ένα ευρύ φάσμα πρωτεϊνών σε δείγματα διαφορετικής προέλευσης. Διάφορες τεχνολογίες χρησιμοποιούνται στην πρωτεϊνομετρική και τις περισσότερες φορές εφαρμόζονται συνδυαστικά,  όπως για παράδειγμα η ηλεκτροφόρηση τρισδιάστατης ή δισδιάστατης γέλης με φασματομετρία μάζας (MS) ή η υγρή χρωματογραφία και MS.

Οι συμβατικές τεχνικές για την απομόνωση και τον καθαρισμό των πρωτεϊνών βασίζονται στη χρωματογραφία όπως η χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων (IEC), η υδροξυαπατίτη, χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (SEC) και η χρωματογραφία συνάφειας. Για ανάλυση εκλεκτικών πρωτεϊνών, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ενζυμικά ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA) και στύπωμα Western. Αυτές οι τεχνικές μπορούν να εφαρμοστούν για ανάλυση μεμονωμένων πρωτεϊνών αλλά δεν μπορούν να καθορίσουν το επίπεδο της έκφρασης πρωτεΐνης. Χρησιμοποιούνται η ηλεκτροφόρηση πηκτής νατρίου δωδεκυλ θειικού-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE), η ηλεκτροφόρηση τρισδιάστατης γέλης (2-DE) και η ηλεκτροδιάταξη διαφορικής τρισδιάστατης γέλης (2D-DIGE) για τον διαχωρισμό πολύπλοκων δειγμάτων πρωτεΐνης.

  • Η φασματομετρία μάζας (MS) επιτρέπει την ανάλυση πρωτεωμάτων και συνήθως είναι η προτιμώμενη μέθοδος για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνών που υπάρχουν στα βιολογικά συστήματα. Οι τρεις κύριες εφαρμογές του MS στην πρωτεϊνομετρική είναι: η καταλογογράφηση της πρωτεϊνικής έκφρασης, ο ορισμός των αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών και ο εντοπισμός θέσεων τροποποίησης της πρωτεΐνης. Η φασματομετρία μάζας μετρά την αναλογία μάζας προς φορτίο (m/z) των ιόντων αερίου φάσης. Τα φασματόμετρα μάζας αποτελούνται από μια πηγή ιόντων που μετατρέπει τα μόρια της αναλυόμενης ουσίας σε ιόντα αερίου φάσης, έναν αναλυτή μάζας που διαχωρίζει ιονισμένες αναλύσεις με βάση την αναλογία m/z και έναν ανιχνευτή που καταγράφει τον αριθμό των ιόντων σε κάθε τιμή m/z. Η ανάπτυξη του ιονισμού με ηλεκτροψεκασμό (ESI) και την εκρόφηση/ιονισμό λέιζερ με τη βοήθεια μήτρας (MALDI), οι δύο τεχνικές μαλακού ιοντισμού ικανές να ιονίζουν πεπτίδια ή πρωτεΐνες, έφεραν επανάσταση στην πρωτεϊνική ανάλυση χρησιμοποιώντας MS. Ο αναλυτής μάζας είναι κεντρικός για την τεχνολογία MS. Για την έρευνα πρωτεομικής, χρησιμοποιούνται συνήθως τέσσερις τύποι αναλυτών μάζας: τετράπολο (Q), παγίδα ιόντων (τετραπολική παγίδα ιόντων, QIT; γραμμική παγίδα ιόντων, LIT ή LTQ), αναλυτής μάζας χρόνου πτήσης (TOF) και Fourier- αναλυτής μάζας μετασχηματισμού συντονισμού ιόντων κυκλοτρόνιο (FTICR). Διαφέρουν ως προς τις φυσικές αρχές και την αναλυτική τους απόδοση. Τα “υβριδικά” όργανα έχουν σχεδιαστεί για να συνδυάζουν τις δυνατότητες διαφορετικών αναλυτών μάζας και περιλαμβάνουν τα Q-Q-Q, Q-Q-LIT, Q-TOF, TOF-TOF και LTQ-FTICR.
  • Η διαδοχική φασματομετρία μάζας είναι μια πρόσθετη πειραματική διαδικασία που είναι επίσης γνωστή ως MS/MS ή MS2. Αυτή είναι μια βασική τεχνική για τον προσδιορισμό αλληλουχίας πρωτεϊνών ή πεπτιδίων και ανάλυση PTM όπου δύο ή περισσότεροι αναλυτές μάζας συνδέονται. Τα μόρια ενός δεδομένου δείγματος ιονίζονται και το πρώτο φασματόμετρο (που ορίζεται ως MS1) διαχωρίζει αυτά τα ιόντα με την αναλογία μάζας προς φορτίο (συχνά δίνεται ως m/z ή m/Q). Επιλέγονται ιόντα συγκεκριμένης αναλογίας m/z που προέρχονται από MS1 και στη συνέχεια διαχωρίζονται σε μικρότερα ιόντα θραύσματος, π.χ. με διάσπαση που προκαλείται από σύγκρουση (CID), διάσπαση ηλεκτρονίων (ECD), διάσπαση μεταφοράς ηλεκτρονίων (ETD), αντίδραση μορίου ιόντων ή διάσπαση φωτογραφιών. Αυτά τα θραύσματα στη συνέχεια εισάγονται στο δεύτερο φασματόμετρο μάζας (MS2), το οποίο με τη σειρά του διαχωρίζει τα θραύσματα με την αναλογία m/z και τα εντοπίζει. Το βήμα κατακερματισμού καθιστά δυνατή την αναγνώριση και τον διαχωρισμό ιόντων που έχουν πολύ παρόμοιες αναλογίες m/z σε κανονικά φασματόμετρα μάζας.
    Η πολυπλοκότητα των βιολογικών συστημάτων απαιτεί τον διαχωρισμό του πρωτεώματος πριν από την ανάλυση. Τόσο οι διαχωρισμοί με βάση τη χρωματογραφία γέλης όσο και η υγρή χρωματογραφία έχουν αποδειχθεί χρήσιμοι από αυτή την άποψη. Τυπικά, μετά από αυτούς τους εκτεταμένους διαχωρισμούς, οι πρωτεΐνες χαρακτηρίζονται από ανάλυση MS είτε άθικτης πρωτεΐνης (από πάνω προς τα κάτω) είτε από πεπτίδια πρωτεΐνης με ενζυματική πέψη (από κάτω προς τα πάνω). Οι ταυτοποιήσεις πρωτεϊνών γίνονται συγκρίνοντας μετρημένες μάζες άθικτων πρωτεϊνών (από πάνω προς τα κάτω) ή πεπτιδίων πρωτεΐνης που έχουν υποστεί πέψη (από κάτω προς τα πάνω) με υπολογιζόμενες μάζες που λαμβάνονται από δεδομένα γονιδιώματος.
  • Η Isobaric Taq Labeling (ITL) είναι μια κοινώς χρησιμοποιούμενη μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό των πρωτεϊνών. Στην πρωτεϊονική η ποσοτικοποίηση της αφθονίας των πρωτεϊνών είναι μια σημαντική εστίαση. Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών αντιπροσωπεύουν την ισορροπία μεταξύ της μετάφρασης και της αποδόμησης των πρωτεϊνών στα κύτταρα. Συνεπώς, θεωρείται ότι η αφθονία μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης σχετίζεται με το ρόλο της στη λειτουργία των κυττάρων. Η ITL παρέχει την ευκαιρία ταυτόχρονης ταυτοποίησης και ποσοτικοποίησης των πρωτεϊνών από πολλαπλά δείγματα σε μία μόνο ανάλυση. Για να μετρηθεί η ποσότητα των πρωτεϊνών σε ένα δεδομένο δείγμα, τα πεπτίδια επισημαίνονται με χημικές ετικέτες που έχουν την ίδια δομή και την ονομαστική μάζα, αλλά διαφέρουν στην κατανομή των βαρέων ισοτόπων στη δομή τους. Αυτές οι ετικέτες, κοινώς αναφερόμενες ως διαδοχικές ετικέτες μάζας, έχουν σχεδιαστεί έτσι ώστε η ετικέτα μάζας να διασπάται σε μια συγκεκριμένη περιοχή συνδέσμου σε υψηλότερη ενέργεια που προκαλείται από σύγκρουση που προκαλείται από σύγκρουση (HCD) κατά τη διάρκεια της φασματομετρίας μάζας παράλληλα, αποδίδοντας ιόντα αναφοράς διαφορετικών μαζών. Η ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης επιτυγχάνεται συγκρίνοντας τις εντάσεις των ιόντων αναφοράς στα φάσματα MS/MS. Άλλες ποσοτικές τεχνικές είναι η επισήμανση ICAT και η σταθερή ισοτοπική επισήμανση με αμινοξέα σε κυτταρική καλλιέργεια (SILAC). Το ICAT έχει επίσης διευρύνει το φάσμα των πρωτεϊνών που μπορούν να αναλυθούν και επιτρέπει την ακριβή ποσοτικοποίηση και ταυτοποίηση αλληλουχιών των πρωτεϊνών από πολύπλοκα μίγματα. Το SILAC είναι μια προσέγγιση βασισμένη στο MS για την ποσοτική πρωτεϊνομετρία που εξαρτάται από τη μεταβολική επισήμανση ολόκληρου του κυτταρικού πρωτεώματος. Τα πρωτεώματα των διαφορετικών κυττάρων που καλλιεργούνται σε κυτταρική καλλιέργεια επισημαίνονται με “ελαφριά” ή “βαριά” μορφή αμινοξέων και διαφοροποιούνται μέσω MS.
  • Η κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ και η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) είναι δύο κύριες τεχνικές υψηλής απόδοσης που παρέχουν τρισδιάστατη (τρισδιάστατη) δομή πρωτεΐνης που μπορεί να είναι χρήσιμη για την κατανόηση της βιολογικής λειτουργίας της. Με την υποστήριξη τεχνολογιών υψηλής απόδοσης, συλλέγεται ένας τεράστιος όγκος δεδομένων πρωτεομικής. Δημιουργούνται βάσεις δεδομένων βιοπληροφορικής για τον χειρισμό τεράστιου όγκου δεδομένων και την αποθήκευσή τους. Διάφορα εργαλεία βιοπληροφορικής έχουν αναπτυχθεί για την πρόβλεψη της τρισδιάστατης δομής, την ανάλυση του πρωτεϊνικού πεδίου και μοτίβου, την γρήγορη ανάλυση αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης -πρωτεΐνης και την ανάλυση δεδομένων MS. Τα εργαλεία ευθυγράμμισης είναι χρήσιμα για την ευθυγράμμιση ακολουθίας και δομής για να ανακαλυφθεί η εξελικτική σχέση. Η ανάλυση πρωτεϊνών παρέχει την πλήρη απεικόνιση των δομικών και λειτουργικών πληροφοριών του κυττάρου, καθώς και τον μηχανισμό απόκρισης του κυττάρου έναντι διαφόρων τύπων στρες και φαρμάκων χρησιμοποιώντας μεμονωμένες ή πολλαπλές τεχνικές πρωτεομικής. Οι κύριες τεχνικές που χρησιμοποιούνται στην έρευνα πρωτεομικής δίνονται στο Εικ 5.

Εικόνα 5. Μέθοδοι που εφαρμόζονται στον τομέα της Πρωτεομικής για έρευνες μεγάλης κλίμακας πρωτεϊνών

Μεταβολική

Το μεταβόλωμα περιεγράφηκε για πρώτη φορά από τον Oliver και τους συνεργάτες του το 1998, κατά τη διάρκεια της πρωτοποριακής εργασίας τους στον μεταβολισμό της ζύμης, ως το πλήρες συμπλήρωμα μικρών μορίων σε ένα βιολογικό σύστημα ή υγρό. Περιλαμβάνει όλα τα μικρά μόρια όπως λιπίδια, αμινοξέα, λιπαρά οξέα, υδατάνθρακες και βιταμίνες τα οποία είναι γνωστά ως μεταβολίτες και παράγονται ως αποτέλεσμα του κυτταρικού μεταβολισμού. Συμμετέχουν στις μεταβολικές διεργασίες στα κύτταρα αλληλεπιδρώντας με άλλα βιολογικά μόρια ακολουθώντας μεταβολικές οδούς. Η κατάσταση των μεταβολιτών στα βιολογικά συστήματα είναι πολύ μεταβλητή και εξαρτάται από το χρόνο και παρατηρούνται αλλαγές στα επίπεδα των βασικών μεταβολιτών λόγω γενετικών, περιβαλλοντικών, διατροφικών και άλλων παραγόντων.
Η μεταβολική (ανάλυση μεταβολωμάτων) είναι η πιο πρόσφατη στρατηγική μεταξύ των omics που συστηματικά προσδιορίζει και ποσοτικοποιεί τους μεταβολίτες που υπάρχουν σε ένα κύτταρο, ιστό, όργανο, βιορευστά ή οργανισμό σε μια συγκεκριμένη χρονική στιγμή. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στη μεταβολική αποσκοπούν στη μέτρηση ενώσεων χαμηλού μοριακού βάρους (μεταβολίτες) με διαφορετικά φυσικά χαρακτηριστικά όπως πολικότητα ενώσεων, λειτουργικές ομάδες και δομική ομοιότητα. Με βάση αυτές τις ιδιότητες, το μεταβόλωμα χωρίζεται σε υποσύνολα διαφόρων μεταβολιτών και για τη διερεύνησή τους εφαρμόζονται αναλυτικές διαδικασίες βελτιστοποιημένες για κάθε τύπο μορίου στη μεταβολική.
Οι μεταβολίτες είναι προϊόντα βιοχημικών αντιδράσεων που πραγματοποιούνται με τη συμμετοχή πρωτεϊνών του πρωτεώματος (Εικ. 6). Οι συγκεντρώσεις τους εξαρτώνται από τις αλληλεπιδράσεις άλλων διαδικασιών (μεταγραφή, μετάφραση, κυτταρική σηματοδότηση κ.λπ.), έχουν ερευνηθεί ως ανταποκριτές για τον μεταβολισμό στην PD. Αυτό με τη σειρά του καθορίζει τη βιολογική δομή και λειτουργία του τελικού φαινοτύπου του οργανισμού. Επομένως, οι αλλαγές στην έκφραση γονιδίων, στη λειτουργία των πρωτεϊνών και στο περιβάλλον επηρεάζουν άμεσα τη συγκέντρωση των μεταβολιτών σε ένα βιολογικό σύστημα. Το μεταβόλωμα αποτελείται από έναν σχετικά μικρό αριθμό (περίπου 5000), αλλά διαφορετικούς τύπους μεταβολιτών που καθιστούν το μεταβόλωμα πιο πολύπλοκο από φυσική και χημική άποψη από το γονιδίωμα, το μεταγράφημα και το πρωτέομα. Επιπλέον, το γονιδίωμα, το μεταγράφημα και το πρωτέομα αποτελούνται από ενώσεις που αποτελούν μέρος του μεταβολισμού. Επιπλέον, τα συστατικά του μεταβολώματος διατηρούνται σε υψηλό βαθμό μεταξύ οργανισμών σε σύγκριση με το γονιδίωμα, το μεταγράφημα και το πρωτέομα και για αυτό θεωρείται ότι το μεταβόλωμα είναι εξελικτικά το παλαιότερο τμήμα του κυττάρου.

Fig.6. Προσεγγίσεις ενσωμάτωσης στα βιολογικά συστήματα

Η μεταβολική είναι η καταλληλότερη στρατηγική για τον προσδιορισμό των βιοδεικτών που σχετίζονται με τη νόσο. Η ολοκληρωμένη μελέτη των μεταβολιτών είναι ένα επιθυμητό εργαλείο για τη διάγνωση της νόσου, τον εντοπισμό νέων θεραπευτικών στόχων και την καθιέρωση κατάλληλων θεραπειών. Οι αναλύσεις μικρού αριθμού μεταβολιτών χρησιμοποιούνται στη διάγνωση ασθενειών για δεκαετίες, για παράδειγμα, η ανάπτυξη ταινιών δοκιμής γλυκόζης αίματος στη δεκαετία του 1950 για τον έλεγχο του διαβήτη ή ποσοτικοποίησης της φαινυλαλανίνης σε νεογέννητα για τον έλεγχο της φαινυλκετονουρίας.

Οι μεταβολικές αναλύσεις μπορούν να ομαδοποιηθούν σε δύο κύριες προσεγγίσεις: στοχευμένη και μη στοχευμένη μεταβολική. Σε στοχευμένη ανάλυση, οι μεταβολίτες που προσδιορίζονται είναι γνωστοί και αντιπροσωπεύουν συγκεκριμένη διαδρομή ή τάξη μορίων. Αντίθετα, η μη στοχευμένη μεταβολιμική στοχεύει στον ποσοτικό προσδιορισμό και τον προσδιορισμό όσο το δυνατόν περισσότερων μεταβολιτών. Η στοχευμένη μεταβολική αναφέρεται στην απόλυτη ποσοτικοποίηση (nΜ ή mg/ml) και χρησιμοποιεί ένα εσωτερικό πρότυπο και ημι ποσοτική ή ποσοτική ανάλυση για τον εντοπισμό γνωστών ενώσεων που σχετίζονται με συγκεκριμένες οδούς. Η μη στοχευμένη προσέγγιση μετρά όλους τους παρόντες μεταβολίτες σε ένα δείγμα και εφαρμόζει σχετική ποσοτικοποίηση (αλλαγή πτυχών) και σύγκριση μεταξύ των δειγμάτων. Ο βασικός ρόλος που διαδραματίζει η μεταβολική στην ολοκλήρωση πολυ-omics και στη μοντελοποίηση του συστήματος οφείλεται στο γεγονός ότι μπορεί να είναι ποσοτικός. Η μοντελοποίηση συστημάτων δεν μπορεί να πραγματοποιηθεί χωρίς ακριβείς τιμές ή ακριβείς συγκεντρώσεις ως εισόδους και, ομοίως, τα μοντέλα συστημάτων δεν μπορούν να επαληθευτούν εύκολα χωρίς ακριβείς, ποσοτικές συγκεντρώσεις ως εκροές. Η μεταβολική μπορεί να προσφέρει και τα δύο (ποσοτικά δεδομένα εισόδου και εξόδου), καθιστώντας τα εξαιρετικά πολύτιμα για τους μοντελιστές συστημάτων.

Λόγω της τεράστιας χημικής πολυπλοκότητας του μεταβολώματος, δεν μπορεί να μελετηθεί ολοκληρωμένα με μια μόνο τεχνολογία. Η παλαιότερη εφαρμογή της μεταβολικής χρονολογίας χρονολογείται από τη δεκαετία του 1970, όταν η αέρια χρωματογραφία -φασματομετρία μάζας χρησιμοποιήθηκε για τον σχηματισμό μεταβολιτών κλινικών δειγμάτων ούρων. Ο Nicholson και άλλοι στη δεκαετία του 1980 έκαναν ένα προφίλ κλινικών δειγμάτων με την εφαρμογή φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού. Η φασματομετρία μάζας σε συνδυασμό τόσο με υγρή χρωματογραφία όσο και με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση εφαρμόζονται επίσης στη μεταβολική για να συμπληρώσουν τις διαθέσιμες αναλυτικές τεχνικές. Ορισμένα από τα αναλυτικά εργαλεία που χρησιμοποιούνται για τους σκοπούς της μεταβολικής έρευνας εφαρμόζονται συχνά και τακτικά, ενώ άλλα έχουν συγκεκριμένους ρόλους και εφαρμόζονται λιγότερο συχνά.

  • Αεριοχρωματογραφία- Φασματομετρία μάζας (GC-MS)- Μεταξύ των συνηθέστερα χρησιμοποιούμενων μεθόδων στη μεταβολική είναι η GC-MS. Όπως υποδηλώνει το όνομα, το GC-MS ενοποιεί δύο τεχνικές για να σχηματίσει μια ενιαία μέθοδο για την ανάλυση μιγμάτων χημικών. Η αέρια χρωματογραφία διαχωρίζει τα συστατικά ενός μίγματος και η φασματοσκοπία μάζας χαρακτηρίζει καθένα από τα συστατικά ξεχωριστά. Συνδυάζοντας τις δύο τεχνικές, κάθε μεταβολίτης σε ένα δείγμα μπορεί να αξιολογηθεί τόσο ποιοτικά όσο και ποσοτικά. Αυτή η χρωματογραφική τεχνική χρησιμοποιείται για τη μελέτη μεταβολιτών που έχουν χαμηλό σημείο βρασμού και οι οποίοι θα υπάρχουν στην αέρια φάση στο εύρος θερμοκρασιών 50-350 ° C. Αυτοί οι μεταβολίτες μπορεί να έχουν χαμηλό σημείο βρασμού στη βιολογικά φυσική τους μορφή ή το σημείο βρασμού ενός μεταβολίτη μπορεί να μειωθεί μέσω χημικής αλλοίωσης, γνωστής και ως χημική παραγοντοποίηση. Το δείγμα που περιέχει μεταβολίτες εισάγεται (εγχέεται) σε μια κινητή φάση, η οποία στην αέρια χρωματογραφία είναι ένα αδρανές αέριο όπως το ήλιο. Η κινητή φάση μεταφέρει το μίγμα δείγματος μέσω αυτής που αναφέρεται ως στάσιμη φάση. Οι μεταβολίτες διαχωρίζονται με βάση την προσρόφησή τους στη στατική φάση. Η στατική φάση περιέχεται συνήθως σε γυάλινη ή ανοξείδωτη στήλη και αντιπροσωπεύει μια χημική ουσία που μπορεί να προσροφήσει επιλεκτικά συστατικά σε ένα μείγμα δείγματος. Αλλάζοντας τα χαρακτηριστικά της κινητής φάσης και της στατικής φάσης, μπορούν να διαχωριστούν διαφορετικά μίγματα χημικών. Καθώς οι μεμονωμένοι μεταβολίτες εκλούονται από τη στήλη GC, εισέρχονται στον ανιχνευτή ιοντισμού ηλεκτρονίων (spec spec of mass). Εκεί, βομβαρδίζονται με ένα ρεύμα ηλεκτρονίων υψηλής ενέργειας (70 eV) που τους κάνουν να διασπώνται σε θραύσματα. Αυτά τα θραύσματα μπορεί να είναι μεγάλα ή μικρά κομμάτια των αρχικών μορίων. Το φάσμα μάζας που λαμβάνεται για μια δεδομένη χημική ένωση είναι βασικά το ίδιο κάθε φορά. Επομένως, το φάσμα μάζας είναι ένα δακτυλικό αποτύπωμα για το μόριο. Αυτό το δακτυλικό αποτύπωμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την οδοντοστοιχία της ένωσης.
  • Υγρή χρωματογραφία-Φασματομετρία μάζας (LC-MS)-Η κύρια διαφορά μεταξύ GC-MS και LC-MS είναι ότι στην υγρή χρωματογραφία (LC), η κινητή φάση είναι ένας διαλύτης. Το LC διαχωρίζει μίγμα μεταβολιτών που είναι σε υγρή μορφή, συνήθως περιέχει μεθανόλη, ακετονιτρίλιο και νερό. Με τη χρήση διαφορετικών στηλών (διαφορετική στατική φάση) με υψηλή απόδοση μπορεί να διαχωριστεί μικρή ποσότητα σύνθετου μίγματος. Οι στήλες που χρησιμοποιούνται στο HPLC αποτελούνται από συσκευασίες Octadecyl (C18), Octyl (C8), Cyano, Amino, Phenyl και γενικά το μήκος τους είναι περίπου 50mm έως 300mm. Οι στήλες χρησιμοποιούνται με βάση τη φύση των ενώσεων που πρόκειται να διαχωριστούν. Αυτό το μείγμα συστατικών που περιέχει υγρό μεταφέρεται στην πηγή ιόντων φασματομέτρου μάζας όπου λαμβάνει χώρα η διαδικασία ιοντισμού και σχηματίζονται σταγονίδια που περιέχουν περίσσεια θετικού ή αρνητικού ηλεκτρικού φορτίου. Ο ιονισμός θα μπορούσε να επιτευχθεί με τη χρήση διαφορετικών τύπων πηγών ιονισμού και διεπαφών. Μετά τον ιονισμό τα ιόντα μεταφέρονται στον Αναλυτή μάζας όπου ο διαχωρισμός των ιόντων γίνεται σύμφωνα με την αναλογία μάζας προς φορτίο (m/z).
  • Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση-φασματομετρία μάζας (CE-MS)-αυτή η αναλυτική τεχνική ονομάζεται επίσης ηλεκτροφόρηση τριχοειδούς ζώνης-φασματομετρία μάζας. Το CE-MS περιλαμβάνει τον διαχωρισμό ιοντικών ειδών στην υγρή φάση μέσω της εφαρμογής υψηλών τάσεων και συνήθως συνδέεται με φασματομετρία μάζας ηλεκτροψεκασμού. Η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση διαχωρίζει τους μεταβολίτες με βάση την ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα σε ένα υγρό διάλυμα ηλεκτρολυτών που λειτουργεί σε ηλεκτρικό πεδίο. Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα εξαρτάται από το φορτίο και το μέγεθος του μεταβολίτη και έτσι είναι δυνατός ο διαχωρισμός μεταβολιτών με διαφορετικά μεγέθη και/ή φορτία. Όλοι οι μεταβολίτες πρέπει να φορτιστούν για να επιτραπεί οποιαδήποτε κινητικότητα.
    Στα GC-MS, LC-MS και CE-MS υπάρχει διαχωρισμός των μεταβολιτών πριν από την ανίχνευσή τους με φασματομετρία μάζας. Αυτή η ιδιαιτερότητα παρέχει την ικανότητα ανίχνευσης μεταβολιτών σε χαμηλές συγκεντρώσεις, συνήθως νανομόρια/λίτρο (nM/L) ή μικρομόρια/λίτρο (μM/L).
  • Η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) είναι τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα αναλυτικά όργανα στη μεταβολική έρευνα μαζί με τη φασματομετρία μάζας. Η φασματοσκοπία NMR εφαρμόζει τις μαγνητικές ιδιότητες των ατομικών πυρήνων σε έναν μεταβολίτη. Μόνο μερικά άτομα είναι NMR ενεργά και περιλαμβάνουν 1Η, 13C και 31P. πρωτόνιο (1 Η). Η τεχνική λειτουργεί με την τοποθέτηση υγρού δείγματος σε σωλήνα μικρής εσωτερικής διαμέτρου (για παράδειγμα σωλήνα 5 mm), ή περιστασιακά μελετάται ένα κομμάτι ιστού απευθείας με τη χρήση ειδικής υποδοχής δείγματος. Το δείγμα είναι παλλόμενο με μια σειρά ραδιοσυχνοτήτων που καλύπτουν όλες τις πιθανές ενέργειες που απαιτούνται για τη διέγερση του επιλεγμένου τύπου πυρήνων. Οι πυρήνες απορροφούν ενέργεια σε διαφορετικές ραδιοσυχνότητες ανάλογα με το χημικό τους περιβάλλον και στη συνέχεια μετριέται η απελευθέρωση αυτής της ενέργειας, σχηματίζοντας μια ελεύθερη σήψη επαγωγής (FID). Αυτό το FID μετατρέπεται από ένα σύνολο δεδομένων χρονικού πεδίου σε ένα πεδίο συχνοτήτων – χρησιμοποιώντας έναν μετασχηματισμό Fourier – και ένα φάσμα NMR κατασκευάζεται καθώς η χημική μετατόπιση (ουσιαστικά η ενέργεια απορρόφησης) σχεδιάζεται σε σχέση με την ένταση αιχμής.
  • Τεχνικές δόνησης φασματοσκοπίας όπως η φασματοσκοπία μετασχηματισμού-υπέρυθρης ακτινοβολίας Fourier (FT-IR) και η φασματοσκοπία Raman εφαρμόζονται για την ανάλυση των μεταβολικών μεταβολών στα βιολογικά δείγματα. Η αρχή της τεχνικής βασίζεται στη μετάδοση υπεριώδους ή υπέρυθρου φωτός μέσω ενός δείγματος, ή μερικές φορές ανάκλαση του φωτός από το δείγμα, πριν από την ανίχνευσή του. Οι προσεγγίσεις μετρούν κυρίως τις δονήσεις και τις περιστροφές των δεσμών που σχετίζονται με διαφορετικές χημικές λειτουργικές ομάδες που προκύπτουν από την αλληλεπίδραση του δείγματος με το υπεριώδες ή το υπέρυθρο φως. Αυτές οι τεχνικές συνήθως στερούνται της ειδικότητας για την ανίχνευση κάθε μεταβολίτη ξεχωριστά, αλλά αντίθετα συγκεκριμένα μέρη του μορίου απορροφούν το υπεριώδες ή υπέρυθρο φως σε συγκεκριμένα μήκη κύματος. Για παράδειγμα, στο FT-IR, παρατηρούνται δονήσεις τεντώματος CH χαρακτηριστικές των αλυσίδων λιπαρών οξέων μεταξύ του εύρους του αριθμού κυμάτων 3100-2800 cm-1 και η περιοχή μεταξύ 1800 και 1500 cm-1 κυριαρχείται από ζώνες αμιδίου Ι και αμιδίου II που υποδεικνύουν την υπεροχή είτε δομές άλφα έλικας είτε βήτα φύλλων.

Στον τομέα της μεταβολικής, πολλές εκατοντάδες δείγματα αναλύονται τακτικά και συνήθως ανιχνεύονται τουλάχιστον μερικές εκατοντάδες μεταβολίτες. Τα δεδομένα που λαμβάνονται από την ανίχνευση μεταβολιτών σε δεδομένα βιολογικά δείγματα ακολουθούνται από περαιτέρω ανάλυση χρησιμοποιώντας στατιστικές μεθόδους πολλαπλών μεταβλητών (χημειομετρικά) για την εξαγωγή βιολογικών, φυσιολογικών και κλινικά σχετικών πληροφοριών.

Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα των τεχνολογιών omics

Η εφαρμογή των τεχνολογιών omics και η ενσωμάτωση δεδομένων omics έχει πραγματοποιηθεί για ένα ευρύ φάσμα ερευνητικών τομέων, συμπεριλαμβανομένων των επιστημών τροφίμων και διατροφής, μικροβιολογίας συστημάτων, ανάλυσης μικροβιωμάτων, αλληλεπιδράσεων γονότυπου -φαινοτύπου, βιολογίας συστημάτων, ανακάλυψης φυσικών προϊόντων και βιολογίας ασθενειών. Πρόσφατα οι προσεγγίσεις βασισμένες σε omics βελτιώθηκαν σημαντικά με την προσθήκη νέων εννοιών όπως η έκθεση σε έκθεμα/εκθεματολογία (ο ρόλος του περιβάλλοντος στις ασθένειες του ανθρώπου), η επαγωγική (μελέτη ενώσεων που δεσμεύουν το DNA και προκαλούν βλάβες και μεταλλάξεις), πτητική (μελέτη πτητικών οργανικών ενώσεων στη μεταβολική/λιπιδωμική ανάλυση), nutrigenomics (μελέτη του τρόπου με τον οποίο τα τρόφιμα επηρεάζουν τα γονίδιά μας), κλπ. Ωστόσο, οι τεχνολογίες omics απευθύνονται κυρίως σε τέσσερα ερευνητικά πεδία omics – γονιδιωματικά, μεταγραφικά, πρωτεομικά και μεταβολικά. Τα παραδοσιακά ερευνητικά πεδία όπως η γενετική, η φαρμακογενετική και η τοξικογενετική που δεν εφαρμόζουν την έννοια της omics, παρέχουν τις στατικές ακολουθίες γονιδίων και πρωτεϊνών. Αντίθετα, οι τεχνολογίες omics παρέχουν ταυτόχρονη μέτρηση του αριθμού των πρωτεϊνών, των γονιδίων, των μεταβολιτών και καθιστούν δυνατή τη λήψη δεδομένων μεγάλης κλίμακας σε σύντομο χρονικό διάστημα. Η συλλογική ανάλυση των βιολογικών διεργασιών σε ένα βιολογικό σύστημα που παρέχεται από όλα τα ομόλογα είναι ένα πλεονέκτημα για τις προηγούμενες παραδοσιακές μεθόδους για την καλύτερη κατανόηση της συνολικής εικόνας του βιολογικού συστήματος. Αν και τα μεγάλης κλίμακας δεδομένα omics γίνονται πιο προσιτά, η ενσωμάτωση πραγματικών δεδομένων πολυ-omics εξακολουθεί να είναι πολύ δύσκολη. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι πολλά από τα συγκεκριμένα αναλυτικά εργαλεία και πειραματικά σχέδια που χρησιμοποιούνται συμβατικά για μεμονωμένους κλάδους omics (γονιδιωματική, μεταγραφική και πρωτεομική) δεν είναι επαρκώς κατάλληλα για να επιτρέψουν αξιόπιστες συγκρίσεις και ενσωμάτωση σε πολλαπλούς κλάδους omics. Για παράδειγμα, οι μέθοδοι συλλογής και αποθήκευσης δειγμάτων και η ποσότητα και ο τύπος των βιολογικών δειγμάτων που απαιτούνται σε μελέτες γονιδιωματικής, συχνά δεν είναι συμβατές με μεταβολικά, πρωτεομικά ή μεταγραφικά. Κατά τη συλλογή δεδομένων, υπάρχουν πολλά προβλήματα όπως η ετερογένεια των δεδομένων, το μικρό μέγεθος δείγματος σε σύγκριση με πολλές παραμέτρους, η επιβεβαίωση και η ερμηνεία των δεδομένων λόγω πολλών αλληλεπιδράσεων στο βιολογικό σύστημα και ελλιπών πληροφοριών για αυτά τα συστήματα. Σχεδόν σε όλα τα πειράματα omics μετρούνται εκατοντάδες έως χιλιάδες μόρια και μεταβλητές στόχοι (μεταβολίτες, πρωτεΐνες, γονίδια, μεταγραφές και SNPs). Αυτό απαιτεί τη διερεύνηση επαρκούς αριθμού βιολογικών δειγμάτων με στόχο την παροχή στατιστικά αξιόπιστων αποτελεσμάτων. Επιπλέον, τα δεδομένα πολυ-omics πρέπει να δημιουργηθούν από το ίδιο σύνολο δειγμάτων για να επιτρέψουν την άμεση σύγκριση υπό τις ίδιες συνθήκες. Ωστόσο, αυτό δεν είναι πάντα δυνατό λόγω περιορισμών στη βιομάζα δειγμάτων, στην πρόσβαση δείγματος ή στους οικονομικούς πόρους. Σε πειράματα μεμονωμένων omics, συχνά απαιτούνται μεγαλύτερα μεγέθη δειγμάτων για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα. Επιπλέον, τα ενσωματωμένα δεδομένα πολλαπλών omics πρέπει να αναλυθούν ως ενιαία σύνολα δεδομένων πριν από την κατάθεσή τους σε συγκεκριμένες βάσεις δεδομένων omics, προκειμένου να είναι διαθέσιμα στο κοινό. Αυτά τα ζητήματα τονίζουν ότι για τις υψηλής ποιότητας μελέτες μεγάλης κλίμακας είναι απαραίτητο: 1) να σχεδιαστεί σωστά ένα πείραμα, 2) να συλλεχθούν, να προετοιμαστούν και να αποθηκευτούν τα βιολογικά δείγματα με προσοχή, 3) να συλλεχθούν ποσοτικά δεδομένα πολύ-omics και συναφή μετα-δεδομένα 4) va χρησιμοποιηθούν κατάλληλα εργαλεία για την ενσωμάτωση και την ερμηνεία των δεδομένων.

Ορισμένα από τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα των κύριων τεχνολογιών omics συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Πίνακας 1. Πλεονεκτήματά και μειονεκτήματα των κυριότερων τεχνολογιών έρευνας omics

Τεχνολογία omics Πλεονέκτημα Μειονέκτημα
Γονιδιωματική • Ανάλυση ολόκληρου του γονιδιώματος
• Μελέτη πολυμορφισμού γονιδίων μεταξύ ατόμων
• Μέσω της αναγνώρισης των SNP παρέχεται μια πολύτιμη πληροφορία για την έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία της νόσου
• Εύκολη εφαρμογή τεχνικών εργαστηρίου		 • Η πραγματοποιημένη ανάλυση γονιδιώματος δεν είναι αρκετή για να προβλέψει το τελικό βιολογικό αποτέλεσμα του DNA λόγω επιγενετικών, μετα-μεταγραφικών και μετα-μεταφραστικών αλλαγών.
• Απαιτείται συγκεκριμένος και ακριβός εργαστηριακός εξοπλισμός
Επιγενωμική Παροχή γνώσεων σχετικά με τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης • Είναι δύσκολο να συσχετιστούν τα ληφθέντα επιγενετικά δεδομένα με γονιδιακή έκφραση, επειδή η μεταγραφή μπορεί να επηρεαστεί από πολλαπλές διεργασίες
• Δεν είναι δυνατή η ανίχνευση κάθε μεθυλιωμένης περιοχής με τις εφαρμοζόμενες τεχνικές.
Μεταγραφική • Μελέτη του πλήρους συνόλου του mRNA (μεταγράφημα)
• Προσδιορισμός των κύριων οδών που εμπλέκονται στην απόκριση και την τοξικότητα στα φάρμακα.
• Εύκολη εφαρμογή τεχνικών εργαστηρίου		 • Η έκφραση πρωτεϊνών επηρεάζεται από μετα-μεταφραστικές αλλαγές που οδηγούν σε λανθασμένα δεδομένα
• Απαιτούν ακριβό και συγκεκριμένο εξοπλισμό
Πρωτεομική • Μελέτη του πλήρους συνόλου πρωτεϊνών σε ένα βιολογικό σύστημα
• Ανίχνευση άγνωστων και απροσδόκητων πρωτεϊνών		 • Ακριβός εξοπλισμός και χρονοβόρες διαδικασίες που δεν ισχύουν για ολόκληρο το πρωτεώμα
• Ορισμένες πρωτεΐνες δύσκολα διαχωρίζονται και καθαρίζονται
• Η εφαρμογή MS και η ερμηνεία δεδομένων απαιτούν ειδικά εκπαιδευμένο προσωπικό
Μεταβολικη • Παρέχει επαρκή δεδομένα σχετικά με τροποποιήσεις των μεταβολικών διεργασιών στο κύτταρο
• Οι ενδογενείς μεταβολίτες είναι λιγότεροι από γονίδια, μεταγραφές και πρωτεΐνες, οπότε λιγότερα δεδομένα πρέπει να ερμηνευτούν
• Ανίχνευση βιοδεικτών ασθενειών		 • Σχετικά χαμηλός αριθμός μεταβολιτών (μερικές χιλιάδες), όπως μπορεί να μετρηθεί
• Συγκεκριμένος, ακριβός εξοπλισμός
• Η χρήση MS και NMR απαιτεί ειδικά εκπαιδευμένο προσωπικό

Τα σύνολα δεδομένων πολλαπλών omics μπορούν να παρέχουν μεγαλύτερο βάθος κατανόησης σε ορισμένα σενάρια, αλλά αυτό δεν είναι χωρίς κόστος. Αυτές οι μελέτες βασίζονται συχνά σε μεγάλο αριθμό συγκρίσεων, σωστού τύπου δεδομένων, σχετικών στατιστικών αναλύσεων, ειδικού εξοπλισμού και εξειδικευμένου προσωπικού και σημαντικής επένδυσης χρόνου και χρημάτων. Κατά τον σχεδιασμό ενός πειράματος πρέπει να ληφθούν υπόψη οι τύποι των δεδομένων omics που μπορούν και πρέπει να ενσωματωθούν για να αποκτήσουν ισχυρές βιολογικές γνώσεις του συστήματος που μελετάται. Η εφαρμογή πλατφορμών omics υψηλής απόδοσης δεν είναι πάντα απαραίτητη για να απαντήσει το ερευνητικό ερώτημα. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από τις παραδοσιακές τεχνικές, όπως η ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR), η ενζυματική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA), η ανοσοϊστοχημεία (IHC), μερικές φορές μπορεί να είναι αρκετά για να κατανοηθούν οι βιολογικοί μηχανισμοί. Αυτές οι τεχνικές συχνά συμπληρώνουν τα ευρήματα από μια μεγαλύτερη μελέτη omics καθώς εφαρμόζονται για να επαληθεύσουν ότι το σημαντικό μόριο που εντοπίστηκε από δεδομένα omics είναι ένα πραγματικό θετικό αποτέλεσμα.

Test: LO1- Αρχάριο επίπεδο

Βιβλιογραφικές αναφορές:

  • Altaf-Ul-Amin M, Afendi FM, Kiboi SK, Kanaya S. 2014. Systems Biology in the Context of Big Data and Networks, BioMed Res Int, 1:11.
  • Aslam B, Basit M, Nisar MA, Khurshid M, Rasool MH. 2017. Proteomics: Technologies and Their Applications. J Chromatogr Sci, 55(2).
  • Benavente L, Goldberg A, Myburg H, Chiera J, Zapata M & van Zyl L. 2015. The application of systems biology to biomanufacturing. Pharm. Bioprocess, 3(4):341–355.
  • Bertolaso M, Giuliani A, de Gara L. 2010. Systems Biology Reveals Biology of systems. Wiley Periodicals, Inc., 16 (6).
  • Bloom FE. 2001. What does it all mean to you? J Neurosci, 21:8304–8305.
  • Clish CB. 2015. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harb Mol Case Stud, 1: a000588
  • Coorssen JR. 2013. Proteomics. Brenner’s Encyclopedia of Genetics (Second Edition), p. 508-510.
  • Dos Santos EAF, Santa Cruz EC, Ribeiro HC, Barbosa LD, Zandonadi FS, Sussulini A. 2020. Multi-omics: An Opportunity to Dive into Systems Biology. Braz J Anal Chem, 7(29): 18-44.
  • Haas R, Zelezniak A, Iacovacci J, Kamrad S, Townsend S, Ralser M. 2017. Designing and interpreting ‘multi-omic’ experiments that may change our understanding of biology. Curr Opin Syst Biol, 6:37–45.
  • Han X, Aslanian A, Yates JR. 2008. Mass Spectrometry for Proteomics. Curr Opin Chem Biol, 12(5): 483–490.
  • Horgan RP, Kenny LC. 2011. SAC review ‘Omic’technologies: genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Obstet Gynecol, 13:189–195
  • Ideker T, Thorsson V, Ranish JA, ChristmasR, Buhler J, Eng R, Bumgarner JK, Goodlett DR, Aebersold R, Hood L. 2001. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science, 292:929–934.
  • Ishii N, Tomita M. 2009. Multi-Omics Data-Driven Systems Biology of E. coli. In: Lee S.Y. (eds) Systems Biology and Biotechnology of Escherichia coli. Springer, Dordrecht.
  • Kalavacharla V, (Kal), Subramani M, Ayyappan V, et al. 2017. Plant Epigenomics. Handbook of Epigenetics, 245–258.
  • Karahalil B. 2016. Overview of Systems Biology and Omics Technologies. Curr Med Chem, 23:1-10.
  • Karamperis K, Wadge S, Koromina M. 2020. Genetic testing. Applied Genomics and Public Health (Translational and Applied Genomics), Elsevier, 189-207.
  • Laurence P. 2015. The case of the gene: Postgenomics between modernity and postmodernity. EMBO Reports, 16 (7): 777–781.
  • Liang KH. 2013. Transcriptomics. Bioinformatics for Biomedical Science and Clinical Applications. Woodhead Publishing, p. 49-82.
  • Lin, S., Fang, L., Li, C., Liu, G. 2019. Epigenetics and heritable phenotypic variations in livestock. In: Tollefsbol T. (editor). Transgenerational Epigenetics. 2nd edition. Amsterdam, Netherlands: Elsevier, p. 283-313
  • Milward EA, Shahandeh A, Heidari M, Johnstone DM, Daneshi N, Hondermarck H. 2016. Transcriptomics. Encyclopedia of Cell Biology. Elsevier, The Netherland, 4: 160-165.
  • O’Donnell ST, Ross RP, Stanton C. 2020. The Progress of Multi-Omics Technologies: Determining Function in Lactic Acid Bacteria Using a Systems Level Approach. Front. Microbiol, 10: 1-17.
  • Pereira C, Adamec BJ. 2019. Metabolome Analysis. Encyclopedia of Bioinformatics and Computational Biology, 3:463-475
  • Pinu FR, Beale DJ, Paten AM, Kouremenos K, et al. 2019. Systems Biology and Multi-Omics Integration: Viewpoints from the Metabolomics Research Community. Metabolites, 9(76).
  • Potters, G. 2010. Systems Biology of the Cell. Nature Education, 3(9):33.
  • Pratima NA, Gadikar R. 2018. Liquid Chromatography-Mass Spectrometry and Its Applications: A Brief Review. Arc Org Inorg Chem Sci, 1(1): 26-34.
  • Shah TR, Ambikanandan M. 2011. Proteomics. Challenges in Delivery of Therapeutic Genomics and Proteomics. Elsevier, p. 387-427.
  • Strange K. 2005. The end of “naïve reductionism”: rise of systems biology or renaissance of physiology? Am J Physiol Cell Physiol, 288: C968–C974.
  • Turunen TA, … Ylä-Herttuala S. 2018. Epigenomics. Encyclopedia of Cardiovascular Research and Medicine, p. 258-265.
  • Vlaanderen J, Moore LE, Smith MT, et al. 2010. Application of omics technologies in occupational and environmental health research: current status and projections. Occup Environ Med, 67: 136-143.
  • Yadav D, Tanveer A, Malviya N, Yadav S. 2018. Overview and Principles of Bioengineering: The Drivers of Omics Technologies and Bio-Engineering Towards Improving Quality of Life, p.3-23
  • Yang X. 2020. Multitissue Multiomics Systems Biology to Dissect Complex Diseases. Trends Mol Med, 26 (8).
  • A brief guide to genomics. https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/A-Brief-Guide-to-Genomics
  • Analytical Techniques applied in Metabolomics. https://www.futurelearn.com/info/courses/metabolomics/0/steps/10710
  • Boundless biology. https://courses.lumenlearning.com/boundless-biology/chapter/the-genetic-code/
  • Altaf-Ul-Amin M, Afendi FM, Kiboi SK, Kanaya S. 2014. Systems Biology in the Context of Big Data and Networks, BioMed Res Int, 1:11.
  • Aslam B, Basit M, Nisar MA, Khurshid M, Rasool MH. 2017. Proteomics: Technologies and Their Applications. J Chromatogr Sci, 55(2).
  • Benavente L, Goldberg A, Myburg H, Chiera J, Zapata M & van Zyl L. 2015. The application of systems biology to biomanufacturing. Pharm. Bioprocess, 3(4):341–355.
  • Bertolaso M, Giuliani A, de Gara L. 2010. Systems Biology Reveals Biology of systems. Wiley Periodicals, Inc., 16 (6).
  • Bloom FE. 2001. What does it all mean to you? J Neurosci, 21:8304–8305.
  • Clish CB. 2015. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harb Mol Case Stud, 1: a000588
  • Coorssen JR. 2013. Proteomics. Brenner’s Encyclopedia of Genetics (Second Edition), p. 508-510.
  • Dos Santos EAF, Santa Cruz EC, Ribeiro HC, Barbosa LD, Zandonadi FS, Sussulini A. 2020. Multi-omics: An Opportunity to Dive into Systems Biology. Braz J Anal Chem, 7(29): 18-44.
  • Haas R, Zelezniak A, Iacovacci J, Kamrad S, Townsend S, Ralser M. 2017. Designing and interpreting ‘multi-omic’ experiments that may change our understanding of biology. Curr Opin Syst Biol, 6:37–45.
  • Han X, Aslanian A, Yates JR. 2008. Mass Spectrometry for Proteomics. Curr Opin Chem Biol, 12(5): 483–490.
  • Horgan RP, Kenny LC. 2011. SAC review ‘Omic’technologies: genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Obstet Gynecol, 13:189–195
  • Ideker T, Thorsson V, Ranish JA, ChristmasR, Buhler J, Eng R, Bumgarner JK, Goodlett DR, Aebersold R, Hood L. 2001. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science, 292:929–934.
  • Ishii N, Tomita M. 2009. Multi-Omics Data-Driven Systems Biology of E. coli. In: Lee S.Y. (eds) Systems Biology and Biotechnology of Escherichia coli. Springer, Dordrecht.
  • Kalavacharla V, (Kal), Subramani M, Ayyappan V, et al. 2017. Plant Epigenomics. Handbook of Epigenetics, 245–258.
  • Karahalil B. 2016. Overview of Systems Biology and Omics Technologies. Curr Med Chem, 23:1-10.
  • Karamperis K, Wadge S, Koromina M. 2020. Genetic testing. Applied Genomics and Public Health (Translational and Applied Genomics), Elsevier, 189-207.
  • Laurence P. 2015. The case of the gene: Postgenomics between modernity and postmodernity. EMBO Reports, 16 (7): 777–781.
  • Liang KH. 2013. Transcriptomics. Bioinformatics for Biomedical Science and Clinical Applications. Woodhead Publishing, p. 49-82.
  • Lin, S., Fang, L., Li, C., Liu, G. 2019. Epigenetics and heritable phenotypic variations in livestock. In: Tollefsbol T. (editor). Transgenerational Epigenetics. 2nd edition. Amsterdam, Netherlands: Elsevier, p. 283-313
  • Milward EA, Shahandeh A, Heidari M, Johnstone DM, Daneshi N, Hondermarck H. 2016. Transcriptomics. Encyclopedia of Cell Biology. Elsevier, The Netherland, 4: 160-165.
  • O’Donnell ST, Ross RP, Stanton C. 2020. The Progress of Multi-Omics Technologies: Determining Function in Lactic Acid Bacteria Using a Systems Level Approach. Front. Microbiol, 10: 1-17.
  • Pereira C, Adamec BJ. 2019. Metabolome Analysis. Encyclopedia of Bioinformatics and Computational Biology, 3:463-475
  • Pinu FR, Beale DJ, Paten AM, Kouremenos K, et al. 2019. Systems Biology and Multi-Omics Integration: Viewpoints from the Metabolomics Research Community. Metabolites, 9(76).
  • Potters, G. 2010. Systems Biology of the Cell. Nature Education, 3(9):33.
  • Pratima NA, Gadikar R. 2018. Liquid Chromatography-Mass Spectrometry and Its Applications: A Brief Review. Arc Org Inorg Chem Sci, 1(1): 26-34.
  • Shah TR, Ambikanandan M. 2011. Proteomics. Challenges in Delivery of Therapeutic Genomics and Proteomics. Elsevier, p. 387-427.
  • Strange K. 2005. The end of “naïve reductionism”: rise of systems biology or renaissance of physiology? Am J Physiol Cell Physiol, 288: C968–C974.
  • Turunen TA, … Ylä-Herttuala S. 2018. Epigenomics. Encyclopedia of Cardiovascular Research and Medicine, p. 258-265.
  • Vlaanderen J, Moore LE, Smith MT, et al. 2010. Application of omics technologies in occupational and environmental health research: current status and projections. Occup Environ Med, 67: 136-143.
  • Yadav D, Tanveer A, Malviya N, Yadav S. 2018. Overview and Principles of Bioengineering: The Drivers of Omics Technologies and Bio-Engineering Towards Improving Quality of Life, p.3-23
  • Yang X. 2020. Multitissue Multiomics Systems Biology to Dissect Complex Diseases. Trends Mol Med, 26 (8).
  • A brief guide to genomics. https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/A-Brief-Guide-to-Genomics
  • Analytical Techniques applied in Metabolomics. https://www.futurelearn.com/info/courses/metabolomics/0/steps/10710
  • Boundless biology. https://courses.lumenlearning.com/boundless-biology/chapter/the-genetic-code/

„Βιολογικά συστήματα και τεχνολογία Οmics“

Προχωρημένο επίπεδο

Οι εξελίξεις στις τεχνολογίες omics – όπως η γονιδιωματική, η μεταγραφική, η πρωτεϊνομική και η μεταβολική – έχουν αρχίσει να επιτρέπουν την ιατρική σε εξαιρετικά λεπτομερή μοριακό επίπεδο. Το ταχέως μειούμενο κόστος της αλληλουχίας υψηλής απόδοσης και άλλων μαζικά παράλληλων τεχνολογιών, όπως η φασματομετρία μάζας, καθιστά δυνατή τη χρήση τους στην κλινική έρευνα και την κλινική πρακτική.

Περιεχόμενα

Τεχνολογία OMICS και Μοριακή Ιατρική

Εφαρμογή της τεχνολογίας OMICS στην Τοξικολογία

Περιβαλλοντική τεχνολογία OMICS και Βιοποικιλότητα

Προσεγγίσεις Omics στην βιομηχανική Βιοτεχνολογία και Μηχανική Βιοεπεξεργασίας

Διατροφική έρευνα βασιζόμενη στην τεχνολογία Οmics

Test: LO1-Προχωρημένο επίπεδο

Βιβλιογραφικές αναφορές

Τεχνολογία OMICS και Μοριακή Ιατρική

Εφαρμογή της τεχνολογίας OMICS στην Τοξικολογία

Περιβαλλοντική τεχνολογία OMICS και Βιοποικιλότητα

Προσεγγίσεις Omics στην βιομηχανική Βιοτεχνολογία και Μηχανική Βιοεπεξεργασίας

Διατροφική έρευνα βασιζόμενη στην τεχνολογία Οmics

Test: LO1-Προχωρημένο επίπεδο

Βιβλιογραφικές αναφορές

 

Τεχνολογία OMICS στην καλυτέρευση της ποιότητας ζωής

Τεχνολογίες OMICS και Μοριακή Ιατρική

Οι εξελίξεις στις τεχνολογίες omics – όπως η γονιδιωματική, η μεταγραφική, η πρωτεϊνομική και η μεταβολική – έχουν αρχίσει να επιτρέπουν την ιατρική σε εξαιρετικά λεπτομερή μοριακό επίπεδο. Το ταχέως μειούμενο κόστος της αλληλουχίας υψηλής απόδοσης και άλλων μαζικά παράλληλων τεχνολογιών, όπως η φασματομετρία μάζας, καθιστά δυνατή τη χρήση τους στην κλινική έρευνα και την κλινική πρακτική. Η αλληλουχία εξωμίου και του γονιδιώματος χρησιμοποιείται ήδη για να βοηθήσει στη διάγνωση, ιδιαίτερα σε σπάνιες ασθένειες, για να ενημερώσει τη θεραπεία και την εξέλιξη του καρκίνου και, στις πρώτες προσπάθειες, να δημιουργήσει προγνωστικά μοντέλα ασθενειών σε υγιή άτομα. Πολυάριθμες ερευνητικές προσπάθειες και εταιρείες επικεντρώνονται σε γενετικά προφίλ γενετικών, γονιδιακών εκφράσεων και άλλων δεδομένων omics, όπως το μικροβίωμα, ως βιοδείκτες για ασθένειες. Αυτές οι τεχνικές έχουν επίσης εφαρμοστεί για τον εντοπισμό των θέσεων κινδύνου για ασθένειες, τον καθορισμό ακριβούς παθοφυσιολογίας της νόσου, καθώς και την εκτέλεση έρευνας για την Υγεία του Επαγγελματικού Περιβάλλοντος (ΥΕΠ).

Ιδανικά, διαφορετικές τεχνολογίες θα συνδυάζονταν τόσο για τη διάγνωση ασθενειών όσο και για τη δημιουργία μιας ολιστικής εικόνας των ανθρώπινων φαινοτύπων και ασθενειών. Ωστόσο, η εφαρμογή των δεδομένων πολλαπλών γνώσεων εισάγει νέες προκλήσεις πληροφορικής και ερμηνείας. Ποιοι είναι οι τρόποι με τους οποίους τα ενσωματωμένα omics μπορούν να επηρεάσουν την ιατρική βοηθώντας στη διαχείριση της υγείας, καθώς και στη διάγνωση και τη θεραπεία ασθενειών; Στην πραγματικότητα, για τη βελτίωση των αποτελεσμάτων της θεραπείας και τη μείωση των ανεπιθύμητων ενεργειών που έχουν σημασία τόσο για τον ιατρό όσο και για τον ασθενή, μία από τις προοπτικές λύσεις είναι η ανάπτυξη της εξατομικευμένης ιατρικής – εξατομικευμένης ιατρικής θεραπείας που δημιουργήθηκε για να ταιριάζει στα χαρακτηριστικά, τις ανάγκες και το μοναδικό μοριακό και γενετικό προφίλ των ατόμων ( Σχ. 1).

Σχήμα 1. Προσωποποιημένη ιατρική σε όλο το φάσμα ζωής

Τεχνολογία OMICs στην διάγνωση

Προγεννητική διάγνωση

Σχεδόν το 10% των παιδιατρικών παθήσεων και το 20% των βρεφικών θανάτων οφείλονται σε μεντελικές ασθένειες. Τα γενετικά ελαττώματα μπορεί να είναι μια σημαντική απειλή για την υγεία του μωρού. Για να ξεπεραστεί αυτό το ζήτημα, οι τελευταίες εξελίξεις στις τεχνολογίες omics χρησιμοποιούνται στη ζωή ενός ατόμου ακόμη και πριν από τη γέννηση. Ο προγεννητικός έλεγχος έχει γίνει ευρέως διαδεδομένος σε πολλές χώρες για την εξέταση όχι μόνο των ανωμαλιών ενός εμβρύου αλλά και των πιθανών κινδύνων ασθενειών ή παθολογικών καταστάσεων μετά τη γέννηση. Όταν υπάρχει γενετική προδιάθεση, όπως κυστική ίνωση ή μυϊκή δυστροφία, η συμβουλή του ειδικού ιατρού ή της εταιρείας γενετικής διάγνωσης αποκτά μεγάλη σημασία. Οι τελευταίες καινοτομίες στη μοριακή και κυτταρική βιολογία επέτρεψαν διάφορες γενετικές διαγνώσεις για τα έμβρυα. Μέχρι πρόσφατα, εφαρμόστηκαν διαφορετικές επεμβατικές τεχνολογίες όπως η αμνιοπαρακέντηση και η δειγματοληψία χοριακών λαχνών. Αν και οι διαδικασίες έχουν βελτιωθεί, εξακολουθεί να υπάρχει κίνδυνος αποβολής και σοβαρών παρενεργειών. Μία από τις καινοτόμες προσπάθειες για την αποφυγή των παρενεργειών των συμβατικών επεμβατικών τεχνολογιών είναι η απομόνωση και η ανάλυση των εμβρυϊκών πυρηνικών κυττάρων από το μητρικό αίμα. Δυστυχώς, ο αριθμός των εμβρυϊκών κυττάρων που μπορούν να απομονωθούν είναι περίπου 3-5 κύτταρα ανά 30 ml μητρικού αίματος. Το τεράστιο άλμα στον τομέα των μη επεμβατικών προγεννητικών δοκιμών (ΜΕΠΔ) έγινε μετά την πρόοδο των τεχνολογιών omics και τον συνδυασμό τους με διάφορες πειραματικές προσεγγίσεις. Η χρήση τεχνολογίας ενίσχυσης του DNA σε συνδυασμό με την NGS επέτρεψε την άμεση ανίχνευση του εμβρυϊκού DNA στο μητρικό αίμα. Επί του παρόντος, μια τέτοια προσέγγιση χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του φύλου και του Rh τύπου αίματος και για την ανάλυση χρωμοσωμικών ανωμαλιών. Το απαλλαγμένο από κύτταρα εμβρυϊκό DNA τυπικά απελευθερώνεται στο μητρικό αίμα κατά τη διαδικασία της απόπτωσης των κυττάρων του πλακούντα. Το κατακερματισμένο εμβρυϊκό DNA χωρίς κύτταρα έχει μήκος ∼200 bp και έχει χρόνο ημιζωής ∼16 min και μπορεί να ανιχνευθεί στο πλάσμα της μητέρας από την αρχή της εγκυμοσύνης (5-7 εβδομάδες). Εκτός από το εμβρυϊκό DNA, τα εμβρυϊκά RNA μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για τον ΜΕΠΔ. Για παράδειγμα, η εμβρυϊκή τρισωμία 21 μπορεί να διαγνωστεί ελέγχοντας την αλληλόμορφη αναλογία του mRNA PLAC4, που παράγεται από το χρωμόσωμα 21 στον πλακούντα. Εάν ένα μωρό λαμβάνει ετερογενή αλληλόμορφα από τους γονείς, μια άνιση αλληλόμορφη αναλογία (2: 1) υποδηλώνει τρισωμία.

Η ενσωμάτωση εμβρυϊκών γονιδιωματικών, μεταγραφικών, πρωτεομικών, μεταβολικών και επιγενετικών δεδομένων θα βοηθήσει στην προώθηση της προγεννητικής γενετικής διάγνωσης. Με αυτόν τον τρόπο, οποιαδήποτε γενετική διαταραχή θα μπορούσε να εντοπιστεί στις αρχές της εγκυμοσύνης με την εφαρμογή μη επεμβατικών προσεγγίσεων. Ωστόσο, προκύπτουν ορισμένες ανησυχίες σχετικά με την αύξηση σοβαρών ηθικών θεμάτων, όταν χρησιμοποιείται προηγμένη γονιδιωματική τεχνολογία. Ως εκ τούτου, θα πρέπει να εξεταστούν περαιτέρω μελέτες σχετικά με τον αντίκτυπο των νέων τεχνολογιών στην κοινωνία, όπως πιθανή διάκριση βάσει γενετικών πληροφοριών, απροσδιόριστες επιβλαβείς επιπτώσεις των νανοτεχνολογιών στον άνθρωπο και τη φύση και παραβιάσεις πνευματικών δικαιωμάτων λόγω της ανάπτυξης της τεχνολογίας των πληροφοριών (βλ. LO8).

Τεχνολογία Lab-on-a-Chip στη διάγνωση

Γρήγορα μετά την ανάπτυξη των μικρο-ηλεκτρο-μηχανικών συστημάτων (ΜΗΜ), αποκαλύφθηκε η πιθανή χρήση αυτών των μικροσκοπικών πλατφορμών για διάφορες εφαρμογές. Τις τελευταίες δεκαετίες, το ενδιαφέρον για το βιολογικό ή βιοϊατρικό ΜΗΜ (Βίο-ΜΗΜ) έχει αυξηθεί σημαντικά και έχει βρει ευρείες εφαρμογές σε διάφορους τομείς της επιστήμης της ζωής, όπως στα διαγνωστικά, στα θεραπευτικά, στην χορήγηση φαρμάκων, στους βιοαισθητήρες και στην μηχανική των ιστών. Αυτά τα ολοκληρωμένα συστήματα είναι επίσης γνωστά ως «εργαστήριο σε τσιπ» (LOC) ή «συστήματα μικρο-ολικής ανάλυσης» (μTAS) και παρέχουν έναν σταθερό τρόπο για μικρογραφία, ολοκλήρωση, αυτοματοποίηση και παραλληλισμό χημικών διεργασιών.

Οι συσκευές Lab-on-a-chip ενσωματώνουν πολλαπλές εργαστηριακές λειτουργίες σε ένα μόνο τσιπ (από λίγα τετραγωνικά χιλιοστά έως μερικά τετραγωνικά εκατοστά σε μέγεθος). Αυτές οι πλατφόρμες παρέχουν πολύπλοκες χημικές και/ή βιολογικές αναλύσεις που μπορούν να προσφέρουν φθηνότερη, ταχύτερη, ελεγχόμενη και υψηλότερη απόδοση βιοχημικών δοκιμασιών σε πολύ μικρή κλίμακα σε σύγκριση με τις συμβατικές εργαστηριακές δοκιμές. Είναι ικανά να χειρίζονται εξαιρετικά μικρούς όγκους υγρών έως και λιγότερους από πικολίτερ (λίγα μικροσταγονίδια ολικού αίματος, πλάσματος, σάλιου, δακρύων, ούρων ή ιδρώτα). Αυτό το γεγονός είναι πολύ σημαντικό σε πολλές κλινικές δοκιμές όπου συνήθως διατίθενται πολύ μικροί όγκοι δειγμάτων ασθενών. Επιπλέον, η αυτοματοποίηση με την εξάλειψη των παραμέτρων ανθρώπινης παρεμβολής μπορεί να αυξήσει την αξιοπιστία στην ανάλυση.

Το LOC έχει χρησιμοποιηθεί σε διάφορες εφαρμογές, όπως: εξαγωγή και καθαρισμός DNA, PCR, qPCR, μοριακή ανίχνευση, ηλεκτροφόρηση κ.λπ.

Το LOC για εξαγωγή και καθαρισμό DNA: Συχνά για διαγνωστικούς προσδιορισμούς το νουκλεϊκό οξύ πρέπει να καθαριστεί από τα κύτταρα. Η διαδικασία εξαγωγής του DNA περιλαμβάνει γενικά δύο στάδια: την κυτταρική λύση με διάσπαση της κυτταρικής μεμβράνης και της μεμβράνης του πυρήνα και καθαρισμός του DNA από τα λιπίδια της μεμβράνης, πρωτεΐνες και RNA. Η κυτταρική λύση σε συσκευές LOC μπορεί να επιτευχθεί με διάφορους τύπους μεθόδων λύσης: χημική, θερμική, υπερηχητική, ηλεκτρική, μηχανική ή κάποιο άλλο είδος λύσης. Αυτές οι γνωστές μέθοδοι καθαρισμού του DNA μέσω στηλών εκχύλισης, χρησιμοποιώντας την προσρόφηση DNA σε σφαιρίδια πυριτίας υπό ορισμένες συνθήκες ρυθμιστικού υγρού, είναι επίσης προσαρμόσιμες σε μικρορευστολογικές τεχνικές.

Συσκευές LOC για PCR, qPCR και Μοριακή Ανίχνευση: Μετά την εξαγωγή DNA, η πιο συχνή ανάλυση είναι η PCR. Η σημασία της PCR στη γονιδιωματική ανάλυση οδήγησε στην ανάπτυξη πολυάριθμων συσκευών LOC. Η μικρογραφία του όγκου και η υψηλή αναλογία επιφάνειας προς όγκο καθορίζουν την ταχεία θερμική μεταφορά και την ακριβέστερη PCR. Αυτή η ανάλυση απαιτεί μετα-ανάλυση και ανίχνευση μεγέθους αμπλίκων, η οποία γενικά πραγματοποιείται με ηλεκτροφόρηση. Με την εισαγωγή των LOC, η ηλεκτροφόρηση του DNA ήταν μία από τις πρώτες μοριακές διαδικασίες που ενσωματώθηκε σε ένα τσιπ. Αυτή η μικρογραφία μειώνει ακόμη περισσότερο το συνολικό χρόνο διεργασίας και μειώνει την κατανάλωση αντιδραστηρίου.

Σχήμα 2. Συσκευή Lab-on-a-Chip

Το qPCR είναι μια άλλη τεχνική που τροποποιήθηκε σε συσκευές LOC. Χρησιμοποιώντας εξαιρετικά γρήγορο ελεγκτή πίεσης και συσκευή ανάγνωσης φθορισμού, το εξαιρετικά γρήγορο μικρορευστό σύστημα qPCR είχε αναπτυχθεί για τη μοριακή ανίχνευση ασθενειών όπως ο άνθρακας και ο Έμπολα. Η αποδοτικότητα ανίχνευσης είναι πανομοιότυπη με τα εμπορικά συστήματα και τα αποτελέσματα είναι εφικτά σε λιγότερο από 8 λεπτά και είναι 7-15 φορές ταχύτερα από τα παραδοσιακά χρησιμοποιούμενα. Ένα άλλο προηγμένο πεδίο είναι η ψηφιακή μικρορευστολογία που ασχολείται με το γαλάκτωμα και τα σταγονίδια μέσα σε συσκευές LOC. Εξαιρετικά χαμηλή ποσότητα DNA μπορεί να βρεθεί εντός σταγονιδίων και τα όρια ανίχνευσης μπορούν να ενισχυθούν με μία ανίχνευση αριθμού αντιγράφου μέσα στα σταγονίδια LOC ​​qPCR.

Γονιδιωματική Εφαρμογή: Λόγω των πολυάριθμων έργων αλληλουχίας, όπως το Πρόγραμμα Ανθρώπινου Γονιδιώματος, ο τομέας της γονιδιωματικής κέρδισε τεράστια προσοχή τα τελευταία χρόνια. Η τεχνική αλληλουχίας επόμενης γενιάς του DNA που βρίσκεται σε εξέλιξη περιλαμβάνει αλληλουχία-υβριδισμό (SBH), προσδιορισμό αλληλουχίας σε νανοπόρους και σύνθεση αλληλουχίας (SBS), εκ των οποίων η τελευταία περιλαμβάνει πολλές διαφορετικές στρατηγικές εξαρτώμενες από πολυμεράση DNA. Η χρήση της προσέγγισης LOC επιτρέπει τη δραστική μείωση του κόστους και της διάρκειας της αλληλουχίας υψηλής απόδοσης.

Κατά τη μελέτη σύνθετων δειγμάτων έκφρασης DNA απαιτείται ενσωμάτωση πολλαπλών βιοαισθητήρων σε σχέση με μικροσυστοιχίες DNA. Τα πιο ουσιαστικά χαρακτηριστικά αυτών των LOC είναι η μικρογραφία, η ταχύτητα και η ακρίβεια. Αυτή η τεχνολογία προσφέρει τεράστιες δυνατότητες για ταχεία πολλαπλή ανάλυση δειγμάτων νουκλεϊνικού οξέος, συμπεριλαμβανομένης της διάγνωσης γενετικών ασθενειών, ανίχνευσης μολυσματικών παραγόντων, μετρήσεων διαφορικής γονιδιακής έκφρασης, διαλογής φαρμάκων ή ιατροδικαστικής ανάλυσης.

Βιοχημικές Εφαρμογές: Η στρατηγική LOC είναι επίσης εφαρμόσιμη για τη σύζευξη ενζυματικών και ανοσολογικών δοκιμασιών σε συσκευή μικροκαυσίμου ενός καναλιού. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η ταυτόχρονη μέτρηση γλυκόζης και ινσουλίνης. Το κλειδί για την αποτελεσματική υλοποίηση μιας τέτοιας παρακολούθησης γλυκόζης/ινσουλίνης είναι η ενσωμάτωση των σχετικών διαδικασιών προεπεξεργασίας/καθαρισμού του δείγματος που είναι απαραίτητες για την ολική ανάλυση αίματος. Αυτή η καινοτόμος προσέγγιση LOC μπορεί να εφαρμοστεί στην ενσωμάτωση άλλων αναλύσεων και πρόσθετων βημάτων χειρισμού δειγμάτων, όπως είναι επιθυμητό για τη δημιουργία μικροσκοπικών κλινικών οργάνων.

Πρωτεομικά: Η πρωτεϊονική είναι μία από τις μεγάλες επιστημονικές προκλήσεις στη μετά-γονιδιωματική εποχή. Οι συσκευές LOC είναι χρήσιμες για τη δημιουργία προηγμένων τεχνικών για την απάντηση σύνθετων αναλυτικών προβλημάτων, όπως η δημιουργία προφίλ πρωτεϊνών. Οι συσκευές LOC θα μπορούσαν να εφαρμοστούν σε τέσσερις βασικούς τομείς της πρωτεομικής: τη χημική επεξεργασία, την προεκέντρωση και τον καθαρισμό δειγμάτων, οι διαχωρισμοί χημικών και οι διεπαφές με μάζα MS. Το LOC που είναι μια μικροσκοπική συσκευή θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για διαχωρισμό και ανίχνευση πρωτεϊνών. Αυτή η διαδικασία χαρακτηρίζεται από λιγότερη κατανάλωση αντιδραστηρίου, εύκολη λειτουργία και πολύ γρήγορη ανάλυση. Ένα άλλο πλεονέκτημα είναι ότι τα δεδομένα από τις συσκευές LOC μπορούν εύκολα να συγκριθούν με αυτά που λαμβάνονται με τη χρήση 2D-PAGE. Προκειμένου να ποσοτικοποιηθούν οι πρωτεΐνες, αναπτύσσεται μια συσκευή σχηματισμού προφίλ LOC MS. Μερικοί συγγραφείς περιγράφουν συσκευές LOC που χρησιμοποιούνται για άμεση έγχυση στο φασματόμετρο μάζας, συμπεριλαμβανομένου του διαχωρισμού της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης (CE), της πέψης του δείγματος στο τσιπ και της έγχυσης ή CE πριν από την ανάλυση MS. Οι ερευνητές χρησιμοποιούν ιονισμό MS με ηλεκτροψεκασμό και επικεντρώνονται στο σχεδιασμό της διεπαφής μεταξύ του LOC και του φασματόμετρου μάζας.

Βιοαισθητήρες: Για την ανίχνευση αναλυτών στόχων αναπτύσσονται επίσης βιοαισθητήρες LOC. Τέτοιες συσκευές συνδέουν περίπλοκα ένα στοιχείο βιολογικής αναγνώρισης με έναν φυσικό μετατροπέα που μετατρέπει το συμβάν βιοανάγνωσης σε ηλεκτρικό σήμα. Υπάρχουν δύο τύποι βιοαισθητήρων LOC: η βιοσυγγένειας και οι βιοκαταλυτικές συσκευές. Οι συσκευές βιοσυγγένειας βασίζονται στην εκλεκτική δέσμευση του αναλύτη-στόχου σε έναν επιφανειακά κλειστό εταίρο συνδέτη (π.χ., αντίσωμα, ολιγονουκλεοτίδιο). Για παράδειγμα, στους βιοαισθητήρες υβριδισμού, υπάρχουν ακινητοποιημένοι μονόκλωνοι (ss) ανιχνευτές DNA στην επιφάνεια του μορφοτροπέα. Όταν σχηματίζεται ένα διπλό μπορεί να ανιχνευθεί μετά από τη συσχέτιση ενός κατάλληλου δείκτη υβριδισμού. Από την άλλη πλευρά, στις βιοκαταλυτικές συσκευές, χρησιμοποιείται ένα ακινητοποιημένο ένζυμο για την αναγνώριση του υποστρώματος στόχου. Ένα παράδειγμα είναι οι ταινίες αισθητήρα με ακινητοποιημένη οξειδάση γλυκόζης για παρακολούθηση του διαβήτη (για περισσότερες πληροφορίες βλέπε LO3).

Κυταρρική Έρευνα: Χρησιμοποιώντας συσκευές LOC, θα μπορούσε επίσης να πραγματοποιηθεί ένα πείραμα μικρής κλίμακας με κύτταρα. Το μεμονωμένο κελί τοποθετείται εντός του μικροκαναλιού σε μια προκαθορισμένη θέση, καθιστώντας εύκολο τον χειρισμό και την αλλαγή του. Το μικροσύστημα επιτρέπει τον χειρισμό μικρών όγκων ρευστού που περιέχουν μικρές ποσότητες αναλύτη. Τα συστήματα LOC ​​παρέχουν επίσης ακριβή έλεγχο του τοπικού περιβάλλοντος γύρω από το κύτταρο, παρακολουθώντας τη φυσική ή χημική φύση της επιφάνειας στην οποία προσκολλάται το κύτταρο, το τοπικό pH και τη θερμοκρασία. Όταν το κύτταρο πρόκειται να εκτεθεί σε διαφορετικό τύπο ερεθισμάτων, μπορούν να χρησιμοποιηθούν πολυάριθμα και συχνά πολύπλοκα συστατικά χειρισμού υγρών. Εάν το κύτταρο αποτελεί αντικείμενο περαιτέρω ανάλυσης, η λύση και οι απαραίτητες αναλυτικές μέθοδοι θα μπορούσαν επίσης να εισαχθούν στην ίδια πλατφόρμα. Έτσι, αποφεύγεται η απώλεια ή η αραίωση του δείγματος, η οποία θα γινόταν αναπόφευκτα εάν χρησιμοποιούνταν πολλές συσκευές.

Ανάπτυξη φαρμάκων: Η βιομηχανία χρειάζεται ανάπτυξη νέων φαρμάκων και πρόβλεψη της πιθανής συμπεριφοράς τους σε ζώα και κύτταρα που ενεργοποιούν άλλες αναλυτικές εφαρμογές συστημάτων LOC: π.χ., αναλυτικά συστήματα για την παρακολούθηση και βελτιστοποίηση της παραγωγής πρωτεϊνικών φαρμάκων, όπως θεραπευτικά αντισώματα, δοκιμασίες βασισμένες σε πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα που θα μπορούσαν να προβλέψουν την απόδοση σε ανθρώπινες κλινικές δοκιμές και αναστατωτές. Αυτά τα συστήματα LOC ​​είναι αποδεδειγμένα εξαιρετικά αναπαραγώγιμα, χειρίζονται εύκολα και θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν τακτικά.

Ανάλυση OMICs για την διάγνωση της γενετικής αρχιτεκτονικής σπάνιων ασθενειών

Ο εντοπισμός γενετικών δεικτών που σχετίζονται με ένα συγκεκριμένο χαρακτηριστικό της νόσου είναι βασικό ζήτημα κατά την εκτίμηση του κινδύνου της νόσου. Καθώς οι γενετικές πληροφορίες ενός ατόμου παραμένουν ως επί το πλείστον αμετάβλητες, οι μεταλλαγμένες αλληλουχίες μπορούν να είναι αξιόπιστοι δείκτες για ορισμένες ασθένειες. Από αυτή την άποψη, μια από τις σημαντικές εφαρμογές της τεχνολογίας omics είναι οι μελέτες συσχέτισης σε όλο το γονιδίωμα (GWAS). Μπορούν να εντοπίσουν κοινές γενετικές παραλλαγές, γενικά μεμονωμένους νουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς (SNPs), που σχετίζονται με ορισμένα χαρακτηριστικά της νόσου. Γενικά, οι πληροφορίες SNP συλλέγονται από δύο ομάδες, μια ομάδα ασθενών και μια ομάδα υγιούς ελέγχου. Στη συνέχεια αναλύεται στατιστικά και τα SNP που σχετίζονται με τα συγκεκριμένα χαρακτηριστικά της νόσου της αντίστοιχης ομάδας ασθενών επαναπροσδιορίζονται.

Για παράδειγμα, οι παραλλαγές στο γονίδιο απολιποπρωτεΐνης Ε (APOE) είναι ένας γνωστός γενετικός παράγοντας που συσχετίζεται με τη νόσο Αλτσχάιμερ (LOAD). Μετά την αξιολόγηση 502.627 SNPs σε 1086 ασθενείς με Αλτσχάιμερ., αποδείχθηκε ότι το rs4420638 στο χρωμόσωμα 19 είναι ο ισχυρότερος δείκτης που διαφοροποιεί τους ασθενείς με νόσο Αλτσχάιμερ από την ομάδα ελέγχου. Άλλη σημαντική επιτυχία επιτυγχάνεται κατά τη διερεύνηση κληρονομικών καρκίνων. Τα γονίδια BRCA1 και BRCA2 είναι ένας από τους σημαντικότερους γενετικούς δείκτες για κληρονομικούς καρκίνους του μαστού και των ωοθηκών. Αυτά τα γονίδια κωδικοποιούν πρωτεΐνες καταστολείς όγκων, οι οποίες βοηθούν στην επιδιόρθωση του κατεστραμμένου DNA μέσω κατευθυνόμενης επισκευής ομολογίας. Ορισμένες μεταλλάξεις στο BRCA1 και/ή BRCA2 αυξάνουν σημαντικά τον κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του μαστού και/ή των ωοθηκών. Για το BRCA1, ανιχνεύθηκαν δύο μεταλλάξεις: 185delAG και 5382insC. Περίπου το 55-65% των γυναικών που κληρονομούν μία από τις επιβλαβείς μεταλλάξεις BRCA1 και περίπου το 45% των γυναικών που φέρουν τη μετάλλαξη BRCA2 έχουν αναπτύξει καρκίνο του μαστού μέχρι την ηλικία των 70 ετών. Πολλοί άλλοι δείκτες ασθενειών όπως ο αυτοσωματικός κυρίαρχος καρκίνος του παχέος εντέρου, Li – Το σύνδρομο πολλαπλού καρκίνου Fraumeni, η βλεννολιπίδωση IV και η υπερτροφική μυοκαρδιοπάθεια, έχουν επίσης ταυτοποιηθεί με επιτυχία χρησιμοποιώντας NGS.

Ωστόσο, για τις πιο κοινές ασθένειες όπως ο διαβήτης, την παχυσαρκία, τη σχιζοφρένεια και τον αυτισμός, ευθύνεται ένας συνδυασμός πολλαπλών γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων. Ένας αυξανόμενος αριθμός στοιχείων υποδεικνύει ότι οι γενετικοί δείκτες συνήθως εξηγούν μόνο ένα μέρος της συνολικής διακύμανσης των χαρακτηριστικών. Ένας από τους σημαντικούς παράγοντες που λείπουν είναι οι επιγενετικές παραλλαγές. Διάφορες επιγενετικές τροποποιήσεις έχουν αναφερθεί ότι σχετίζονται με το αρχικό στάδιο διαφορετικών καρκίνων (ανώμαλη ανάπτυξη ενός όγκου). Επιπλέον, είναι γνωστό ότι ο καρκίνος του παχέος εντέρου εντοπίζεται συχνότερα στους άνδρες παρά στις γυναίκες. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο έχει προταθεί ότι τα οιστρογόνα μπορούν να βοηθήσουν στην καταστολή του καρκίνου του παχέος εντέρου. Επιπλέον, τα επιγενετικά προφίλ του παρακείμενου βλεννογόνου και δείγματα μη γειτονικών βλεννογόνων 95 ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου αποκάλυψαν ότι ο προαγωγέας του MGMT, ενός γονιδίου επιδιόρθωσης του DNA, ήταν συχνά μεθυλιωμένος. Μέχρι τώρα, χιλιάδες γονιδιωματικοί τόποι έχουν εντοπιστεί και σχετίζονται με διάφορες ανθρώπινες ασθένειες. Ωστόσο, οι δυσκολίες προκύπτουν όταν αυτά τα γονίδια πρέπει να χαρακτηριστούν στο πλαίσιο της μοριακής παθοφυσιολογίας και των αντίστοιχων αλληλεπιδρώντων γονιδίων και οδών.

Εφαρμογή της τεχνολογίας OMICs στην θεραπεία ασθενειών

Ο κύριος στόχος της εξατομικευμένης ιατρικής είναι να αποφασίσει για την πιο αποτελεσματική θεραπευτική επιλογή για ένα άτομο. Από αυτή την άποψη, η ταυτόχρονη ποσοτικοποίηση πολλαπλών δεικτών πρωτεΐνης μπορεί να παίξει σημαντικό ρόλο στην υποτύπωση των όγκων και στην επιλογή βελτιστοποιημένων θεραπειών για κάθε υποτύπο. Τεχνικές ποσοτικοποίησης πρωτεϊνών με υψηλή απόδοση, μεμονωμένα κύτταρα, όπως το CyTOF, μπορούν να είναι εξαιρετικές εναλλακτικές για μεθόδους που βασίζονται σε ανοσοϊστοχημεία.

Για παράδειγμα, την τελευταία δεκαετία εμφανίστηκε μια νέα προσέγγιση για τη θεραπεία καρκίνων – επιτρέποντας στο ανοσοποιητικό σύστημα του ασθενούς να καταπολεμήσει τον καρκίνο του, που ονομάζεται υιοθετική μεταφορά κυττάρων (ACT). Το πολύμορφο γλοιοβλάστωμα (GBM) είναι ο πιο συχνός και επιθετικός τύπος κακοήθους όγκου στον εγκέφαλο. Αν και το GBM έχει αντιμετωπιστεί με χειρουργική αφαίρεση, ακτινοθεραπεία και μεθόδους χημειοθεραπείας, δεν υπήρξαν αξιοσημείωτα αποτελέσματα. Τα τελευταία 20 χρόνια, έχουν πραγματοποιηθεί πολυάριθμες κλινικές δοκιμές για τη χρήση του ανοσοποιητικού συστήματος για τη θεραπεία καρκίνων όπως η GBM. Μεταξύ των πολυάριθμων προσεγγίσεων ACT, έχει δοθεί ιδιαίτερη προσοχή στα εμβόλια με βάση τα δενδριτικά κύτταρα (DC) και τα Τ -λεμφοκύτταρα. Μπορούν να διεισδύσουν και να προκαλέσουν αντικαρκινική αντίδραση στον εγκέφαλο και να δείξουν μεγάλες δυνατότητες για αποτελεσματική εξόντωση διαφόρων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων των κακοήθων και προχωρημένων τύπων. Τα αυτόλογα DCs, που λαμβάνονται από ιστό όγκου ή με τη μορφή λύματος όγκου ασθενούς, μπορούν να αναπτυχθούν in vitro παρουσία αντιγόνων που σχετίζονται με τον όγκο (TAAs), μια μέθοδος που ονομάζεται «παλμός». Τα παλμικά, αυτόλογα DC επανεισάγονται στον ασθενή για να διεγείρουν ειδική, κυτταρική, αντικαρκινική κυτταροτοξικότητα έναντι GBM και άλλων κακοήθων καρκίνων. Υπάρχουν και πιο επαναστατικές προσεγγίσεις, π.χ. έχουν επίσης επιχειρηθεί μηχανικά ειδικά ανοσοκύτταρα χρησιμοποιώντας νουκλεάσες δακτύλου ψευδαργύρου (ZFNs) και τεχνολογία CRISPR.

Κάθε χρόνο, χιλιάδες ασθενείς υποβάλλονται σε μεταμόσχευση οργάνων ή αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων. Ωστόσο, η θνησιμότητα μεταξύ αυτών των ασθενών παραμένει πολύ υψηλή. Μια τυπική διαδικασία αντιστοίχισης των δοτών με τους παραλήπτες περιλαμβάνει την αντιστοίχιση του ανθρώπινου λευκοκυττάρου αντιγόνου (HLA). Ωστόσο, γίνεται σαφές ότι οι παράγοντες μη-HLA μπορούν επίσης να επηρεάσουν σημαντικά την πρόγνωση και την ανάπτυξη της νόσου του μοσχεύματος έναντι του ξενιστή (GVHD). Για να ξεπεραστεί αυτό, πολλές εφαρμογές omics μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον προσδιορισμό των βέλτιστων αγώνων του δότη -παραλήπτη, καθώς και για την εξέταση διαφορετικών δεικτών απόρριψης. Για παράδειγμα, η αλληλουχία DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση της σοβαρότητας της απόρριψης οργάνου καθώς και για ταυτόχρονη ανίχνευση της ενδεχόμενης παρουσίας ιικού DNA ως δείκτη μόλυνσης. Πρόσθετα στοιχεία omics, όπως έκφραση RNA ή πρωτεΐνης, μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για την αξιολόγηση της συμβατότητας δότη -λήπτη. Έτσι, η ενσωμάτωση μεταξύ πολλών τεχνολογιών omics μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως χρήσιμο εργαλείο για τη βιολογία μεταμοσχεύσεων.

Επιπλέον, το μικροβίωμα έχει συσχετιστεί με πολλές κοινές ανθρώπινες ασθένειες. Ενώ η αιτιότητα είναι απλή στα γονιδιωματικά δεδομένα, όπου το DNA επηρεάζει τους φαινότυπους, είναι πιο δύσκολο να αποκαλυφθεί εάν η σύνθεση του μικροβιώματος είναι αιτία ή αποτέλεσμα ασθένειας. Παρ ‘όλα αυτά, είναι προφανές ότι οι ασθενείς με φλεγμονώδη νόσο του εντέρου, διαβήτη τύπου 2 και παχυσαρκία, έχουν διαφορετικά προφίλ μικροβιώματος από αυτά των υγιών ανθρώπων. Επιπλέον, το μικροβίωμα έχει μεγάλη επιρροή στη λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος, η οποία σε ορισμένες περιπτώσεις έχει υποθετική αιτιώδη σχέση με ασθένειες σε ζωικά μοντέλα. Καθώς προχωρά η κατανόησή μας για το μικροβίωμα, η ολοκληρωμένη αξιολόγηση αυτών και άλλων δεδομένων τεχνολογιών omics θα βοηθήσει στην καλύτερη κατανόηση των ανθρώπινων ασθενειών. Πρόσφατα, έχει αποδειχθεί ότι τα ανθρώπινα γενετικά προφίλ επηρεάζουν τη συνολική σύνθεση των μικροβίων του εντέρου. Επιπλέον, οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ της ανθρώπινης γενετικής και των μικροβιωμάτων έχουν αποδειχθεί ότι επηρεάζουν την εκδήλωση της νόσου. Ομοίως, η μεταβολική σηματοδότηση μεταξύ των ξενιστών και των μικροβιωμάτων τους έχει γίνει τομέας ενεργού έρευνας και υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι ένας αριθμός μεταβολιτών που εκκρίνονται από τα βακτήρια του εντέρου μπορεί να διαδραματίσουν ρόλο στις ανθρώπινες ασθένειες. Ως εκ τούτου, είναι προφανές ότι η ολοκληρωμένη ανάλυση μεταξύ προφίλ του γονιδιώματος, του μεταβολώματος και του μικροβιώματος θα παρέχει τα μέσα για τη διαχείριση της υγείας και την καταπολέμηση των ασθενειών.

Τεχνολογία OMICs στην πρόληψη ασθενειών- μελλοντικές προοπτικές

Ένας άλλος σημαντικός στόχος της εξατομικευμένης ιατρικής είναι να αποτρέψει την ανάπτυξη διαφόρων ασθενειών πριν από την εμφάνισή τους. Οι τρέχουσες προληπτικές θεραπείες περιορίζονται στη χειρουργική επέμβαση – αφαίρεση ιστού ή οργάνου εάν ένα άτομο διαθέτει σχετικούς δείκτες καρκίνου. Ωστόσο, αυτή η προσέγγιση δεν ισχύει για ασθένειες όπως το Αλτσχάιμερ, η νόσος του Χάντινγκτον και η συγγενής μυϊκή δυστροφία. Μία από τις πρόσφατες προσεγγίσεις για την αντιμετώπιση τέτοιων ζητημάτων είναι η θεραπεία διατροφής που βασίζεται στη θρεπτογονιδιωματική. Η διαμόρφωση του προφίλ μέσω τεχνολογίας Omics μπορεί να είναι μια αποτελεσματική προσέγγιση στην ανίχνευση αλλαγών μεγάλης κλίμακας ή επιπέδου πορείας, μπορεί να δείξει τάσεις για τον ασθενή και να προσθέσει στατιστική υποστήριξη μέσω επαναλαμβανόμενων μετρήσεων.

Εφαρμογές της τεχνολογίας OMICS στην Τοξικολογία

Η χρήση των εργαλείων omics για την αξιολόγηση της κατάστασης της περιβαλλοντικής υγείας γίνεται όλο και πιο σημαντική στη διαχείριση του περιβάλλοντος και την εκτίμηση κινδύνων. Η τεχνολογία Omics επιτρέπει τη σύνδεση μοριακών συμβάντων και δυσμενών επιπτώσεων με βιολογικά επίπεδα οργάνωσης που σχετίζονται με τα συστήματα εκτίμησης του κινδύνου. Η ανάλυση του επιπέδου των μεταγραφών RNA ή της κυτταρικής πρωτεομικής έχει ήδη αποκτήσει ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Αυτές οι μελέτες βοήθησαν στην καλύτερη κατανόηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των παραγόντων στρες και του οργανισμού, αλλά και στην αποκάλυψη των τρόπων δράσης (ΜΟΑ) διαφόρων τοξικών ουσιών. Επομένως, από τοξικολογικής άποψης, οι τεχνικές omics επιτρέπουν την αποτελεσματική και ακριβή παραγωγή σημαντικών πληροφοριών σχετικά με μοριακές διαταραχές που προκαλούνται από ουσίες σε κύτταρα και ιστούς και που σχετίζονται με δυσμενείς συνέπειες.

Οι κυτταρικές ρυθμιστικές διαδρομές περιλαμβάνουν μια σειρά διαφορετικών (βιο) μορίων, τα οποία χαρακτηρίζονται με διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες και εμφανίζουν περίπλοκες μη γραμμικές αλληλεπιδράσεις. Μια τεχνική μονής ομολογίας μπορεί να μετρήσει βιομόρια ενός συγκεκριμένου τύπου, RNA ή πρωτεΐνες, και συχνά αυτά δεν είναι ούτε το σύνολο των βιομορίων ενός τύπου, αλλά ένα μικρότερο υποσύνολο αυτών. Για παράδειγμα, η ανίχνευση βραχέων και μακρών RNAs, ή βραχυπεπτιδίων και πρωτεϊνών απαιτεί διαφορετικές μεταγραφικές ή πρωτεομικές προσεγγίσεις. Μόνο η χρήση πολυομικών, γνωστών και ως προσεγγίσεις διασταυρώσεων, επιτρέπει τον άμεσο προσδιορισμό ενός σημαντικού κλάσματος της απόκρισης των οδών στη χημική έκθεση. Ως εκ τούτου, η χρησιμοποίηση στρατηγικών πολλαπλών γνώσεων για τοξικολογικά ερευνητικά ερωτήματα έχει μεγαλύτερη σημασία.

Μια τέτοια τοξικολογική προσέγγιση συστήματος, που ενσωματώνει την κλασική τοξικολογία με την ποσοτική ανάλυση μεγάλων μοριακών δικτύων και τις λειτουργικές αλλαγές που συμβαίνουν σε πολλαπλά επίπεδα βιολογικής οργάνωσης, είναι ελπιδοφόρα στην ανάλυση του πλήρους φάσματος τοξικότητας των ξενοβιοτικών. Μια τοξικολογική προσέγγιση συστημάτων περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία:

  • Απορρόφηση και κατανομή των ξενοβιοτικών στο βιολογικό σύστημα.
  • Μετασχηματισμός του ξενοβιοτικού και δημιουργία τοξικών και/ή μη τοξικών ενδιάμεσων.
  • Αλληλεπίδραση του ξενοβιοτικού και/ή των προϊόντων του με τους κυτταρικούς στόχους.
  • Τροποποιήσεις στα κυτταρικά μόρια συμπεριλαμβανομένων γονιδίων, πρωτεϊνών και λιπιδίων.
  • Δομικές εκδηλώσεις τοξικότητας των οργάνων -στόχων.
  • Λειτουργικές εκδηλώσεις τοξικότητας, και
  • Εξάλειψη του ξενοβιοτικού ή/και των ενδιάμεσων του από το βιολογικό σύστημα.

Τοξικολογικές μελέτες μέσω ανάλυσης OMICs

Για καλύτερη κατανόηση της κυτταρικής απόκρισης στη χημική έκθεση, οι μελέτες θα πρέπει να επικεντρωθούν σε διαφορετικά επίπεδα: μεταγραφικά, πρωτεομικά, φωσφοπρωτεομικά και μεταβολικά. Η επιγονιδιωματική θα πρέπει επίσης να λαμβάνεται υπόψη για συγκεκριμένες περιπτώσεις.

Μεταγραφική. Ο κύριος στόχος της μεταγραφικής είναι η ολοκληρωμένη ανίχνευση RNAa στο κύτταρο. Μια απόκριση μονοπατιού στη μεταγραφική ανιχνεύεται κυρίως μέσω ενός γνωστού συνόλου γονιδίων στόχων που βρίσκονται διαφορετικά εκφρασμένα. Οι τεχνικές που εφαρμόζονται για τον προσδιορισμό των αλλαγών στην γονιδιακή έκφραση ως απάντηση στην έκθεση σε ξενοβιοτικά περιλαμβάνουν: τον υβριδισμό, τον ποσοτικό PCR σε πραγματικό χρόνο (QRT-PCR), τον αφαιρετικό υβριδισμό, τη σειριακή ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης, την ανάλυση μικροσυστοιχιών και την αλληλουχία επόμενης γενιάς. Ανάλογα με τον σκοπό της μελέτης, μία ή περισσότερες από αυτές τις τεχνικές μπορούν να εφαρμοστούν για τον καθορισμό είτε μερικών είτε σφαιρικών προφίλ έκφρασης στο δοκιμαζόμενο βιολογικό δείγμα. Ωστόσο, οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες τεχνικές κατάρτισης γονιδιακής έκφρασης είναι η QRT-PCR, η ανάλυση μικροσυστοιχιών και το NGS. Εάν ο στόχος είναι να διερευνηθεί το προφίλ έκφρασης ενός μόνο ή περιορισμένου αριθμού μεταγραφών, η ανάλυση QRT-PCR είναι η μέθοδος εκλογής. Η ανάλυση QRT-PCR είναι μια σχετικά απλή τεχνική που περιλαμβάνει την αντίστροφη μεταγραφή των mRNAs ακολουθούμενη από ενίσχυση PCR των cDNA που προκύπτουν χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για το στοχευόμενο γονίδιο καθώς και για ένα ή περισσότερα γονίδια που διατηρούν το σπίτι. Η ποσότητα των ενισχυμένων με PCR γονιδιακών προϊόντων υπερβαίνει την ποσότητα. Καθώς το QRT-PCR μπορεί να προσδιορίσει με ακρίβεια την έκφραση ενός μεμονωμένου ή περιορισμένου αριθμού μεταγραφών, έχει κάποιους περιορισμούς από την άποψη της τοξικολογίας του συστήματος. Προκειμένου να μελετηθεί η τοξικότητα σε επίπεδο συστήματος ενός δεδομένου ξενοβιοτικού, είναι απαραίτητο να χρησιμοποιηθούν τεχνικές υψηλής απόδοσης που είναι ικανές να καθορίσουν τα επίπεδα έκφρασης ολόκληρου του μεταγραφικού. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο η μικροσυστοιχία και η αλληλουχία επόμενης γενιάς είναι οι πιο δημοφιλείς παγκόσμιες τεχνικές ανάλυσης μεταγραφής που εφαρμόζονται στην έρευνα τοξικολογίας.

Η τεχνική της μικροσυστοιχίας αντιπροσωπεύει μια σημαντική ανακάλυψη στην εποχή της αλληλουχίας του ανθρώπινου γονιδιώματος. Όπως και η τεχνική υβριδισμού Southern, η προσέγγιση μικροσυστοιχιών βασίζεται στην ικανότητα των μορίων DNA να δεσμεύονται ή να υβριδοποιούνται με συγκεκριμένο τρόπο νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Η μικροσυστοιχία μπορεί να θεωρηθεί ως υβριδισμός υψηλής απόδοσης κηλίδας Northern, στον οποίο σχεδόν όλα τα γονίδια που εκφράζονται σε βιολογικό δείγμα σε δεδομένη στιγμή μπορούν να ανιχνευθούν ταυτόχρονα. Ως εκ τούτου, επιτρέπει την ανίχνευση μικρών διαφορών στα συνολικά προφίλ γονιδιακής έκφρασης σε ένα δεδομένο βιολογικό δείγμα ως απάντηση στην έκθεση των ξενοβιοτικών. Η τεχνική της μικροσυστοιχίας περιλαμβάνει την απομόνωση υψηλής ποιότητας RNA, την αντίστροφη μεταγραφή του mRNA για τη σύνθεση του cDNA, τη σύνθεση του cRNA και την επισήμανση για τη δημιουργία «ανιχνευτών», τον υβριδισμό των «ανιχνευτών» με τους «στόχους» που υπάρχουν στη μικροσυστοιχία, την ανίχνευση της έντασης του σήματος του υβριδοποιημένου συμπλέγματος ανιχνευτή-στόχου και ανάλυση των δεδομένων που προκύπτουν για τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων που μας ενδιαφέρουν. Η ανάλυση με βάση τη μικροσυστοιχία έχει χρησιμοποιηθεί σε διάφορους τομείς όπως η τοξικολογία του περιβάλλοντος, η ανάπτυξη φαρμάκων και η επαγγελματική τοξικολογία. Τα δεδομένα που λαμβάνονται παρέχουν ένα στιγμιότυπο όλων των γονιδίων των οποίων τα επίπεδα έκφρασης επηρεάζονται ως απόκριση στην ξενοβιοτική έκθεση.

Η αλληλουχία επόμενης γενιάς (NGS) είναι η πιο πρόσφατα αναπτυγμένη παγκόσμια ανάλυση μεταγραφής. Αυτή η τεχνική μπορεί να εφαρμοστεί για τον προσδιορισμό ενός γενικού προφίλ γονιδιακής έκφρασης σε RNA που λαμβάνεται από διαφορετικά βιολογικά δείγματα. Τα βασικά βήματα που εμπλέκονται στο NGS είναι η απομόνωση RNA, η απομάκρυνση άφθονων μορίων RNA όπως το ριβοσωμικό RNA και η σφαιρίνη RNA, η προετοιμασία βιβλιοθηκών αλληλουχίας, η ενίσχυση PCR και η αλληλουχία των βιβλιοθηκών. Τα δεδομένα που προκύπτουν αναλύονται και προσδιορίζεται η ποσότητα των επιμέρους μεταγραφών.

Πρωτεομικά: Η μεταγραφική μέθοδος είναι συχνά η πρώτη επιλογή για έρευνες σε επίπεδο συστήματος καθώς έχουν αναπτυχθεί πολυάριθμες καθιερωμένες μέθοδοι μέτρησης κατά τη διάρκεια των ετών. Ωστόσο, οι πρωτεϊνικές αλλαγές μπορούν να θεωρηθούν ότι είναι πιο κοντά στη σχετική λειτουργική επίδραση ενός ερεθίσματος που μελετήθηκε. Αν και η έκφραση του mRNA και της πρωτεΐνης συνδέονται στενά μέσω της μετάφρασης, ο συσχετισμός τους είναι περιορισμένος. Τα επίπεδα μεταγραφής mRNA εξηγούν μόνο περίπου το 50% της διακύμανσης των επιπέδων πρωτεΐνης. Αυτό οφείλεται στα επιπλέον επίπεδα ρύθμισης της πρωτεΐνης, συμπεριλαμβανομένου του ρυθμού μετάφρασης και αποδόμησής τους. Επιπλέον, η ρύθμιση της πρωτεϊνικής δραστηριότητας δεν σταματά στο επίπεδο έκφρασής της αλλά συχνά ελέγχεται περαιτέρω μέσω μετα -μεταφραστικών τροποποιήσεων. Από την άποψη της τοξικολογίας, τέτοια παραδείγματα για σημαντική μετα-μεταγραφική ρύθμιση περιλαμβάνουν: τη στενή ρύθμιση των επιπέδων της πρωτεΐνης ρ53 και τον επαγώγιμο σε υποξία παράγοντα (HIF) και την ταχεία μετα-μεταγραφική τους σταθεροποίηση, π.χ. τη ρύθμιση πολλών κυτταρικών αποκρίσεων στρες (π.χ. οξειδωτικό στρες) στο επίπεδο της μετάφρασης πρωτεϊνών και τη ρύθμιση της απόκρισης του κυτταρικού στρες μέσω καταρράκτη φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών. Οι πιο συχνά εφαρμοζόμενες αναλύσεις πρωτεομικής σημασίας για την τοξικολογία περιλαμβάνουν: την ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου 2D, την υγρή χρωματογραφία χωρίς γέλη, τη φασματομετρία μάζας και την ανάλυση των μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων.

Η ηλεκτροφόρηση της γέλης 2D πολυακρυλαμιδίου (2DGE) χρησιμοποιείται για τη μελέτη διαταραχών στο πρωτέωμα με βάση τις αλλαγές στην έκφραση της πρωτεΐνης. Η τεχνική 2DGE βασίζεται στον διαχωρισμό των πρωτεϊνών με βάση το pH τους (φορτίο) καθώς και το μέγεθός τους. Έχει την ικανότητα να διαχωρίζει και να απεικονίζει έως και 2000 πρωτεΐνες σε ένα τζελ. Η πρώτη διάσταση είναι γνωστή ως ισοηλεκτρική εστίαση (IEF) χωρίζει τις πρωτεΐνες από το ισοηλεκτρικό σημείο τους (pI). Η δεύτερη διάσταση διαχωρίζει περαιτέρω τις πρωτεΐνες με τη μάζα τους. Το υπερσύγχρονο λογισμικό λήψης και ανάλυσης εικόνας επιτρέπει τη σύγκριση των δειγμάτων ελέγχου και επεξεργασίας που βοηθούν στον εντοπισμό των διαφοροποιημένων πρωτεϊνών με τη σχετική τους ένταση. Μια παραλλαγή του 2DGE είναι η ηλεκτροφόρηση πηκτής διαφοράς (DIGE) η οποία βασίζεται στην επισήμανση των πρωτεϊνών με φθορίζουσες χρωστικές κυανίνης (Cy2, Cy3 και Cy5). Αν και το 2DGE είναι ένα ισχυρό εργαλείο για τον εντοπισμό πολλών πρωτεϊνών, η προσέγγιση έχει τους περιορισμούς της. Ο κύριος περιορισμός είναι ότι δεν μπορούν όλες οι πρωτεΐνες να διαχωριστούν με IEF, όπως μεμβρανικές, βασικές, μικρές (<10 kDa) και μεγάλες (> 100 kDa) πρωτεΐνες. Ο δεύτερος περιορισμός είναι ότι οι λιγότερο άφθονες πρωτεΐνες συχνά καλύπτονται από τις άφθονες πρωτεΐνες στο μείγμα.

Άλλες συχνά χρησιμοποιούμενες τεχνικές είναι η φασματομετρία μάζας υγρής χρωματογραφίας χωρίς γέλη (LC MS/MS). Η προσέγγιση LC χρησιμοποιεί τις διαφορές στις φυσιοχημικές ιδιότητες των πρωτεϊνών και των πεπτιδίων, δηλαδή, το μέγεθος, το φορτίο και την υδροφοβία. Το 2D-LC μπορεί να εφαρμοστεί για κλασμάτωση πρωτεϊνικών μιγμάτων σε δύο στήλες με διαφορετικές φυσιοχημικές ιδιότητες και μεγιστοποίηση του διαχωρισμού πρωτεϊνών και πεπτιδίων σε πολύπλοκα μίγματα. Η φασματομετρία μάζας πιστεύεται ευρέως ότι είναι η βασική τεχνολογική πλατφόρμα για τοξικοπρωτεομικά. Τα κύρια πλεονεκτήματά του περιλαμβάνουν την αξεπέραστη ευαισθησία, τη βελτιωμένη ταχύτητα και την ικανότητα παραγωγής συνόλων δεδομένων υψηλής απόδοσης. Λόγω της υψηλής ακρίβειας του MS, στους ιστούς και τις βιολογικές μήτρες μπορούν να ανιχνευθούν πεπτίδια στην περιοχή του θηλομοριακού (10−15) έως του αττομοριακού (10−18). Αυτό είναι εξαιρετικά επωφελές στη συγκριτική ανάλυση όπου πραγματοποιείται ταυτόχρονη ανάλυση των δειγμάτων ελέγχου και επεξεργασίας. Έτσι, μπορεί να επιτευχθεί ολοκληρωμένη κατανόηση του τρόπου με τον οποίο τα ερεθίσματα επηρεάζουν το πρωτείο και η επακόλουθη ταυτοποίηση πιθανών βιοδεικτών.

Καθώς η βιολογία του συστήματος απαιτεί ακριβή ποσοτικοποίηση ενός συγκεκριμένου συνόλου πεπτιδίων/πρωτεϊνών σε πολλά δείγματα, έχουν επίσης αναπτυχθεί στοχευμένες προσεγγίσεις για τον ποσοτικό προσδιορισμό των βιοδεικτών. Μια τέτοια τεχνική είναι η επιλεγμένη παρακολούθηση της αντίδρασης (SRM). Το SRM μετρά τα πεπτίδια που παράγονται από την ενζυματική πέψη του πρωτεώματος σε τριπλό τετράπολο MS. Ένα πρωτεϊμικό πείραμα βασισμένο σε SRM ξεκινά με την επιλογή μιας λίστας πρωτεϊνών στόχων, που προέρχονται από προηγούμενα πειράματα ή αναζήτηση δεδομένων, όπως χάρτη διαδρομής ή βιβλιογραφία. Αυτό το βήμα ακολουθείται από 1) επιλογή των πρωτεότυπων πεπτιδίων -στόχων που αντιπροσωπεύουν βέλτιστα και μοναδικά τον στόχο της πρωτεΐνης, 2) επιλογή ενός συνόλου κατάλληλων μεταβάσεων SRM για κάθε πεπτίδιο στόχο, 3) ανίχνευση των επιλεγμένων πεπτιδικών μεταβάσεων σε ένα δείγμα, 4 ) βελτιστοποίηση των παραμέτρων ανάλυσης SRM και 5) εφαρμογή των δοκιμασιών στην ανίχνευση και ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνών/πεπτιδίων. Τα κυριότερα πλεονεκτήματα της τεχνικής SRM είναι: 1) δυνατότητες παρακολούθησης δεκάδων έως εκατοντάδων πρωτεϊνών κατά την ίδια πορεία, 2) δυνατότητες για την απόλυτη και τη σχετική ποσοτικοποίηση, 3) υψηλή αναπαραγωγιμότητα δεδομένων και 4) απόδοση απόλυτης μοριακής ειδικότητας. Ωστόσο, υπάρχουν επίσης ορισμένοι περιορισμοί αυτής της τεχνικής: 1) μόνο ένας περιορισμένος αριθμός μετρήσιμων πρωτεϊνών μπορεί να συμπεριληφθεί στην ίδια σειρά και 2) ακόμη και με την υψηλή ευαισθησία του δεν μπορεί να ανιχνεύσει όλες τις πρωτεΐνες που υπάρχουν σε έναν οργανισμό.

Έχει επίσης χρησιμοποιηθεί μια στοχευμένη προσέγγιση βασισμένη σε MS γνωστή ως παρακολούθηση παράλληλης αντίδρασης (PRM). Επικεντρώνεται στη χρήση εργαλείων μάζας υψηλής ανάλυσης και ακριβείας νέας γενιάς, εξοπλισμένων με τετράπολο (κυρίως το σύστημα Orbitrap MS). Αυτή η τεχνική σχετίζεται στενά με το SRM αλλά επιτρέπει τη μέτρηση όλων των προϊόντων κατακερματισμού ενός δεδομένου πεπτιδίου παράλληλα.

Μια άλλη βασική προσέγγιση είναι η ανάλυση των μετα -μεταφραστικών τροποποιήσεων (PTM) που συνέβησαν λόγω της τοξικής έκθεσης. Αντιπροσωπεύουν έναν ουσιαστικό μηχανισμό ρύθμισης του κυτταρικού πρωτεώματος. Τα PTM είναι χημικές τροποποιήσεις που έχουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της δραστηριότητας, του εντοπισμού και των αλληλεπιδράσεων των κυτταρικών βιομορίων. Η ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός των πρωτεϊνών και των θέσεων PTM τους είναι πολύ σημαντικά για τη βιοχημική κατανόηση των οδών PTM. Αυτή η γνώση παρέχει βαθύτερες γνώσεις σχετικά με την πιθανή ρύθμιση της κυτταρικής φυσιολογίας που προκαλείται από το PTM. Μερικά παραδείγματα PTM περιλαμβάνουν την φωσφορυλίωση, τη γλυκοζυλίωση, την πανταχού παρουσία, τη νιτροσυλίωση, τη μεθυλίωση, την ακετυλίωση, τη λιπιδίωση και την πρωτεόλυση. Κατά την τελευταία δεκαετία, η πρωτεϊνομετρική με βάση το MS έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα ισχυρό εργαλείο για τον εντοπισμό και τη χαρτογράφηση των PTM. Επιπλέον, οι προσεγγίσεις που βασίζονται σε MS αξιοποίησαν το μεγάλο πλεονέκτημα από την πρόοδο στα όργανα MS που καθιστούν την ανάλυση πιο ευαίσθητη, ακριβή και με υψηλότερη ανάλυση για την ανίχνευση λιγότερο άφθονων πρωτεϊνών.

Μεταβολική: Η μεταβολική τεχνική είναι διαφορετική από την άλλη ανάλυση omics, καθώς ασχολείται με μια συλλογή χημικά εξαιρετικά ετερογενών μορίων. Η μεταβολική ορίζεται συνήθως ως η πλήρης ισορροπία όλων των μεταβολιτών μικρών μορίων (<1500Da) που βρίσκονται σε ένα συγκεκριμένο κύτταρο, όργανο ή οργανισμό. Χάρη σε πρωτοβουλίες όπως το Human Metabolome Project, ο ενδογενής μεταβολισμός ανθρώπινων και ζωικών μοντέλων οργανισμών έχει χαρτογραφηθεί σε μεγάλο βαθμό. Οι μετρήσεις του μεταβολώματος χρησιμοποιούν είτε ανίχνευση με βάση πυρηνικό μαγνητικό συντονισμό (NMR) είτε αέρια ή υγρή χρωματογραφία ενωμένη σε MS. Οι προσεγγίσεις που βασίζονται σε NMR έχουν την ικανότητα να ποσοτικοποιούν τους μεταβολίτες που μελετήθηκαν και αποτελούν το χρυσό πρότυπο για τη δομική διαλεύκανση άγνωστων μεταβολιτών. Οι προσεγγίσεις που βασίζονται σε MS ξεπερνούν το NMR όσον αφορά την ευαισθησία και μπορούν να εκτελεστούν με μη στοχευμένο ή στοχευμένο τρόπο.

Η μεταβολική τεχνική διαφέρει από την πρωτεϊνομετρική και τη μεταγραφική σε πολλές απόψεις:

(i) ανιχνεύει την απόκριση σε πολύ διαφορετικά επίπεδα μιας διαδρομής, και

(ii) την ταυτόχρονη σύλληψη μορίων μιας οδού που ανταποκρίνονται σε εξαιρετικά διαφορετικές χρονικές κλίμακες.

Η εξέλιξη της μεταβολικής έχει γίνει συστηματικά και είναι ιδιαίτερα χρήσιμη σε πολλές μελέτες που σχετίζονται με την τοξικολογία. Έχει αξιοσημείωτες δυνατότητες για τον έλεγχο κυτταρικής ή οργανικής τοξικότητας που προκαλείται από φάρμακα. Η ταχεία αξιολόγηση των βιολογικών δειγμάτων, μαζί με τη μαθηματική και στατιστική ανάλυση (χημειομετρία) των ληφθέντων δεδομένων χρησιμεύει ως ένα ισχυρό εργαλείο για την αξιολόγηση της ασφάλειας των φαρμάκων. Για παράδειγμα, εάν ένα φάρμακο ή χημική ουσία μπορεί να προκαλέσει ηπατική τοξικότητα προκαλώντας κυτταρικό οξειδωτικό στρες, η μεταβολική ανάλυση του βιολογικού δείγματος που εκτίθεται στο φάρμακο μπορεί να παράσχει άμεσες πληροφορίες σχετικά με τους μεταβολίτες που είναι δείκτες του οξειδωτικού στρες. Μπορεί επίσης να εντοπίσει μεταβολίτες που θεωρούνται ως γνωστοί βιοδείκτες ηπατικής βλάβης, υποδηλώνοντας έτσι ηπατική παθολογία. Επιπλέον, η μεταβολική ανάλυση μπορεί επίσης να παρέχει πληροφορίες για μεταβολίτες που σχετίζονται έμμεσα με τοξικότητα.

Η μεταβολική τεχνική έχει πολλά πλεονεκτήματα έναντι της συμβατικής κλινικής εκτίμησης παθολογίας. Για παράδειγμα, μια μελέτη που εξέτασε μια άγνωστη ένωση έδειξε ότι αυτή η ένωση αυξάνει τα επίπεδα χοληστερόλης στον ορό. Κατά τη χρήση της μεταβολικής, έχει παρατηρηθεί ότι, εκτός από τη χοληστερόλη, η ίδια ένωση αυξάνει επίσης αρκετές φυτοστερόλες, υποδεικνύοντας ότι η υψηλότερη χοληστερόλη είναι αποτέλεσμα της απορρόφησης της στερόλης στο έντερο. Τέτοια ευρήματα δείχνουν σαφώς ότι η μεταβολική έχει πολύ υψηλότερες δυνατότητες όσον αφορά τον εντοπισμό ακριβών τοξικολογικών τελικών σημείων.

Επιγονιδωματική. Κύριος στόχος της επιγονιδιωμτικής είναι η μελέτη των χημικών τροποποιήσεων του DNA και των πρωτεϊνών που οργανώνουν την τρισδιάστατη δομή του γονιδιωματικού DNA. Σήμερα, η μεθυλίωση του DNA αξιολογείται με μια τροποποιημένη προσέγγιση προσδιορισμού αλληλουχίας γονιδιώματος (μεθυλομή-seq). Ωστόσο, αυτή η προσέγγιση εξακολουθεί να απαιτεί υψηλή κάλυψη που σχετίζεται με ακόμη σημαντικό κόστος αλληλουχίας. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο οι στοχευμένες προσεγγίσεις με βάση τη μικροσυστοιχία χρησιμοποιούνται συχνότερα. Η μεθυλίωση του DNA περιλαμβάνει δύο διαφορετικές χημικές τροποποιήσεις με ξεχωριστές λειτουργικές συνέπειες-την 5-μεθυλκυτοσίνη και την 5-υδροξυ-μεθυλκυτοσίνη. Οι τροποποιήσεις ιστόνης αναλύονται χρησιμοποιώντας μέθοδο χρωματίνης-ανοσοκαταβύθισης εφαρμόζοντας αντισώματα ειδικά για τη στοχευμένη τροποποίηση ακολουθούμενη από αλληλουχία (ChIP-seq). Συνήθως, για να έχετε μια ολοκληρωμένη εικόνα, πρέπει να εντοπιστούν πολλές τροποποιήσεις. Αυτό απαιτεί ταυτόχρονη εκτέλεση πολλών αναλύσεων ChIP-seq. Καθώς το ChIP-seq χρειάζεται περισσότερο δείγμα υλικού από τις άλλες επιγενωμικές προσεγγίσεις, μια τέτοια στρατηγική μπορεί να είναι δύσκολο να εφαρμοστεί σε τοξικολογικές μελέτες. Το ATAC-seq είναι μια εναλλακτική προσέγγιση που δεν διερευνά άμεσα τις χημικές τροποποιήσεις, αλλά μάλλον μια από τις κύριες συνέπειες των τροποποιήσεων, την προσβασιμότητα στο DNA.

Ωστόσο, η γνώση σχετικά με τη συμμετοχή ρυθμιστικών οδών και συγκεκριμένων επιγονιδιωματικών τροποποιήσεων είναι ακόμη σπάνια. Η επιγονιδιωματική είναι επομένως περιορισμένης αξίας όταν χρησιμοποιείται μια προσέγγιση ενσωμάτωσης δεδομένων που βασίζεται σε μονοπάτια. Ωστόσο, τα επιγονιδιβματικά δεδομένα αποδείχθηκαν εξαιρετικά πολύτιμα για μελέτες μεταξύ γενεών ή όταν προσπαθούσαν να προβλέψουν μακροπρόθεσμες επιπτώσεις της χημικής έκθεσης με βάση τα στοιχεία omics της βραχυπρόθεσμης έκθεσης.

Εφαρμογές της OMICs για τοξικολογική εκτίμηση κινδύνου και κανονιστικές υποβολές

Τις τελευταίες δεκαετίες, οι τεχνολογίες omics έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς στην έρευνα και αποδείχθηκε ότι είναι σε θέση να παρέχουν μια βαθιά εικόνα για τη βιοχημεία και τη φυσιολογία του κυττάρου και οποιαδήποτε βλαβερή επίδραση των ξενοβιοτικών. Αυτό οδήγησε σε ενθουσιώδη έγκριση από ερευνητές τοξικολόγους. Εκφράστηκαν οι ελπίδες ότι οι τεχνολογίες omics θα παρέχουν τα εργαλεία για τον εντοπισμό ενός συνόλου βιοδεικτών δυσμενών επιπτώσεων και τους τρόπους δράσης τους. Έτσι, θα βελτιωθεί η πρόβλεψη των επιπτώσεων στον άνθρωπο κατά την εκτίμηση επικινδυνότητας ουσιών και θα συμβάλλει στην ανάπτυξη εναλλακτικών μεθόδων σε δοκιμές σε ζώα. Παρόλα αυτά, η μετάφραση των omics στον κανονιστικό τομέα παραμένει στην καλύτερη περίπτωση επιφυλακτική.

Ως εκ τούτου, το Ευρωπαϊκό Κέντρο Οικοτοξικολογίας και Τοξικολογίας των Χημικών (ECETOC) διοργάνωσε μια σειρά εργαστηρίων για την αξιολόγηση των δυνατοτήτων και των προκλήσεων των τεχνικών omics στην εκτίμηση χημικών κινδύνων. Το πιο πρόσφατο εργαστήριο κατέληξε στο συμπέρασμα ότι οι προσεγγίσεις omics συμβάλλουν στην απάντηση σχετικών ερωτήσεων στην εκτίμηση κινδύνου, όπως:

(i) την ταξινόμηση ουσιών και τον ορισμό της ομοιότητας,
(ii) την αποσαφήνιση του τρόπου δράσης των ουσιών, και
(iii) τον εντοπισμό επιπτώσεων για συγκεκριμένα είδη και την απόδειξη της συνάφειας της ανθρώπινης υγείας.

Ωστόσο, εντοπίστηκε η ανάγκη για αύξηση της αναπαραγωγιμότητας της απόκτησης δεδομένων και της ανάλυσης δεδομένων, καθώς και για τον καθορισμό των βέλτιστων πρακτικών. Επιπλέον, η κανονιστική χρήση οποιασδήποτε μεθόδου δοκιμής σχετίζεται στενά με το συγκεκριμένο νομικό πλαίσιο που σχετίζεται με την υπό διερεύνηση ουσία. Λαμβάνοντας υπόψη τον κανονισμό REACH (ΕΚ και Συμβούλιο της ΕΕ, 2006), “τα δεδομένα που βασίζονται σε ομόλογα θα μπορούσαν δυνητικά να χρησιμοποιηθούν για κανονιστικές υποβολές”. Για τη χρήση των omics σε φακέλους REACH, ο κανονισμός REACH απαριθμεί διαφορετικές απαιτήσεις: συγκεκριμένες τυπικές πληροφορίες που καλύπτουν συγκεκριμένα φυσικοχημικά, τοξικολογικά και οικοτοξικολογικά όρια. Αυτά τα δεδομένα αξιολογούνται κατά την εκτίμηση επικινδυνότητας και κινδύνου και αναλύονται για τον προσδιορισμό εναλλακτικών λύσεων διαχείρισης κινδύνου, αντίστοιχα. Η εφαρμογή και η ενσωμάτωση εργαλείων omics μπορεί να είναι χρήσιμη σε διαφορετικά επίπεδα κανονιστικής αναγνώρισης και αξιολόγησης κινδύνων συμβάλλοντας σε:

  1. Ταξινόμηση και επισήμανση (C&L) των ουσιών.
  2. Προσεγγίσεις βάρους-αποδεικτικών στοιχείων (WoE) για τη διευκρίνιση του ΜΣ της υπό διερεύνηση ουσίας.
  3. Τεκμηρίωση χημικής ομοιότητας.
  4. Προσδιορισμός των σημείων αναχώρησης (PoD) για την εκτίμηση κινδύνου.
  5. Επίδειξη επιπτώσεων για συγκεκριμένα είδη και συνάφεια με την ανθρώπινη υγεία.

Η ταχεία ανάπτυξη των τεχνολογιών omics θέτει πολλές προκλήσεις για τη διευκόλυνση της χρήσης τους για την αξιολόγηση κινδύνων, ιδιαίτερα από την άποψη της κανονιστικής υποβολής. Τα σύνολα «μεγάλων δεδομένων» πρέπει να συμπυκνωθούν εφαρμόζοντας πολύπλοκες προσεγγίσεις και εφαρμόζοντας συγκεκριμένες γνώσεις για τη λήψη πληροφοριών που είναι συναφείς για την εκτίμηση κινδύνου. Επιπλέον, η γνώση σε αυτόν τον ταχέως εξελισσόμενο τομέα δεν είναι απαραίτητα γνωστή σε πολλούς ερευνητές που εργάζονται στις ρυθμιστικές ρυθμίσεις. Κατά συνέπεια, η έλλειψη κανονιστικής έγκρισης τεχνολογιών omics δεν συνδέεται μόνο με την έλλειψη πλαισίων βέλτιστων πρακτικών και κριτηρίων ποιότητας, αλλά και με την έλλειψη εμπιστοσύνης στην ανάλυση και το επίπεδο αβεβαιότητας ως προς το τι συνιστά αρκετά δεδομένα. Οι επιστήμονες και οι ρυθμιστικές αρχές πρέπει πρώτα να αποκτήσουν εμπειρία με τα δεδομένα που λαμβάνονται από αυτή τη νέα τεχνολογία και στη συνέχεια να χτίσουν εμπιστοσύνη στην εφαρμογή της.

Περιβαλλοντική τεχνολογία OMICS και Βιοποικιλότητα

Γενικά, οι περισσότερες περιβαλλοντικές μελέτες περιλαμβάνουν καλλιέργεια απομονωμένων μικροοργανισμών ή ενίσχυση και αλληλουχία διατηρημένων γονιδίων. Ωστόσο, υπάρχουν ορισμένες δυσκολίες στην κατανόηση της πολυπλοκότητας μεγάλου αριθμού διαφόρων μικροοργανισμών σε ένα περιβάλλον. Αυτό οδήγησε στην ανάπτυξη νέων τεχνικών που επιτρέπουν τον εμπλουτισμό ειδικών μικροοργανισμών για ανάλυση, όπως απομόνωση και αναλύσεις μονοκυττάρων. Προηγμένα εργαλεία στη μεταγονιδιωματική και τη μονογονιδιακή γονιδιωματική (SCG) ανοίγουν το δρόμο σε νέες μεθόδους μελέτης και κατανόησης του περιβάλλοντός μας.

Οι πρώτες περιβαλλοντικές μελέτες της ποικιλομορφίας των οργανισμών απαιτούσαν την καλλιέργεια δειγμάτων για να αυξήσει την ποσότητα του DNA πριν από τη δημιουργία γονιδιωματικών βιβλιοθηκών. Εκείνη την εποχή, η αλληλουχία του 16R και 18S rRNA ήταν η καλύτερη διαθέσιμη επιλογή για τον καθορισμό της περιβαλλοντικής ποικιλομορφίας. Ωστόσο, κατέστη σαφές ότι η πλειοψηφία των δειγμάτων κοινοτήτων αντιπροσωπεύει ακαλλιέργητα είδη. Ευτυχώς, η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) του rRNA επιτρέπει την πρόσβαση τόσο στην καλλιεργήσιμη όσο και στην μη καλλιεργήσιμη ποικιλία δειγμάτων. Επειδή η PCR μπορεί να πραγματοποιηθεί απευθείας σε περιβαλλοντικά δείγματα χωρίς κλωνοποίηση, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ενίσχυση στοχευμένων γονιδίων απευθείας από το περιβάλλον.

Η σημασία της αλληλουχίας τόσο των μη κωδικοποιητικών rRNA όσο και των πρωτεϊνικών κωδικοποιητικών γονιδίων αυξάνεται, με ιδιαίτερο ενδιαφέρον για την ανασυγκρότηση βακτηριακών γονιδιωμάτων. Μια ολοκληρωμένη δειγματοληψία όλων των γονιδίων από όλους τους οργανισμούς που υπάρχουν σε ένα πολύπλοκο δείγμα είναι εφικτή μέσω της μεταγονιδιακής αλληλουχίας κυνηγετικού όπλου. Η χρήση αυτής της μεθόδου καθιστά δυνατή την αξιολόγηση της ποικιλίας των βακτηρίων και τον εντοπισμό της αφθονίας μικροοργανισμών σε ένα συγκεκριμένο περιβάλλον. Επιπλέον, επιτρέπει την ανασύσταση πλήρων γονιδιωμάτων μη καλλιεργήσιμων μικροοργανισμών. Εκτός από την ανακάλυψη νέων αρχαίων βακτηρίων, πρωτόζωων, φυκιών, μυκήτων και ευκαρυωτικών ειδών, αυτή η τεχνική είναι ζωτικής σημασίας για την ανασύσταση των γονιδιωμάτων ιών. Αυτή ήταν μια κρίσιμη πρόοδος λαμβάνοντας υπόψη ότι οι ιοί δεν διαθέτουν κοινό γενικό φυλογενετικό δείκτη, όπως βακτηριακό 16S rRNA ή ευκαρυωτικό 18S rRNA.

Μια άλλη προσέγγιση είναι η μετα -μεταγραφική προσέγγιση, η οποία αντί να χρησιμοποιεί γονιδιωματικό DNA (gDNA) περιλαμβάνει τη συλλογή ολόκληρου RNA. Το πιο πρόσφατο χρησιμοποιείται για την κατασκευή cDNA βιβλιοθηκών. Αν και το RNA είναι λιγότερο σταθερό από το DNA, δίνει ένα στιγμιότυπο της τρέχουσας κατάστασης της κοινότητας αποκαλύπτοντας πάνω και κάτω ρυθμιζόμενα γονίδια. Μέχρι σήμερα, μία από τις σημαντικότερες μελέτες μετα- μεταγραφής πραγματοποιείται για τις κοινότητες θαλάσσιων υδάτων.

Μονοκυτταρική γονιδιωματική

Η μεταγονιδιακή αλληλουχία είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για την κατανόηση των περιβαλλοντικών κοινοτήτων. Ωστόσο, η συναρμολόγηση καταλόγων γονιδίων και σύνθετων γονιδιωμάτων μπορεί να είναι δύσκολη. Επιπλέον, είναι δύσκολο να γίνει διάκριση μεταξύ γονιδίων που προέρχονται από τον ίδιο ή διαφορετικό οργανισμό σε γονιδιώματα που έχουν ήδη συναρμολογηθεί (Σχμ. 3). Ως εκ τούτου, υπάρχει σημαντικό ενδιαφέρον για την ανάπτυξη ενός συστήματος για την κατανόηση της οργάνωσης των ανακαλυφθέντων γονιδίων και των οδών εντός των γονιδιωμάτων.

Σχημα 3. Μεταγονιδιακή έναντι μονοκυτταρικής γονιδιακής

Η πρόκληση της ετερογένειας του δείγματος θα μπορούσε να λυθεί εν μέρει χρησιμοποιώντας δύο τεχνικές και βαθιά αλληλουχία. Απαιτούνται διαφορετικές προσεγγίσεις για τη σύγκριση μεταγονιδιακών δειγμάτων που συλλέγονται από διαφορετικά περιβάλλοντα και για την αποκάλυψη της σύνθεσης και της οργάνωσης των γονιδιωμάτων μικροοργανισμών στο περιβάλλον. Μία από τις προσεγγίσεις είναι ο εμπλουτισμός της καλλιέργειας ενός συγκεκριμένου οργανισμού με βάση τις συγκεκριμένες περιβαλλοντικές τους λειτουργίες. Αυτός ο τύπος στοχευμένης μεταγονιδιωματικής προσέγγισης επιτρέπει την ανάπτυξη σύνθετων μικροβιακών γονιδιωμάτων. Επιπλέον, λόγω της έλλειψης καλλιέργειας πολλών οργανισμών, άλλα προβλήματα εμφανίζονται όταν οι ταχύτερα αναπτυσσόμενοι μικροοργανισμοί ξεπεράσουν τους πιο αργούς, εισάγοντας στη συνέχεια πρόσθετες παραμέτρους.

Ως εκ τούτου, αντί για καλλιέργεια, ένα πολύπλοκο δείγμα μπορεί να εμπλουτιστεί για έναν πληθυσμό κυττάρων-στόχων χρησιμοποιώντας ταξινόμηση κυττάρων ενεργοποιημένου με φθορισμό (FACS). Η χρήση αυτής της προσέγγισης βοηθά στην ταξινόμηση των κυττάρων με βάση το σχήμα, το μέγεθος και την πυκνότητα τους. Εναλλακτικά, συγκεκριμένοι οργανισμοί ενδιαφέροντος μπορούν να εμπλουτιστούν χρησιμοποιώντας ένα μικρό αριθμό κυττάρων που έχουν συγκεκριμένη λειτουργία στο περιβάλλον. Με την ανάπτυξη τεχνικών ενίσχυσης ολόκληρου του γονιδιώματος (WGA) (π.χ. ενίσχυση πολλαπλής μετατόπισης (MDA) ή ενίσχυση του κυλιόμενου κύκλου (RCA)), το gDNA περιορισμένου αριθμού κυττάρων μπορεί να ενισχυθεί και να προσδιοριστεί η αλληλουχία του. Ωστόσο, οι τεχνικές WGA δημιουργούν πιθανές αποκλίσεις επειδή η αφθονία συγκεκριμένων αλληλουχιών ποικίλλει και ως εκ τούτου δεν ενισχύονται εξίσου. Ως εκ τούτου, η ενίσχυση του gDNA καθορισμένων πληθυσμών με περιορισμένο αριθμό κυττάρων θέτει σε κίνδυνο την ποσοτική ανάλυση της μεταγονιδιωματικής.

Οι τελευταίες εξελίξεις στις τεχνικές ενίσχυσης ενός γονιδιώματος επιτρέπουν την SCG χρησιμοποιώντας φυσικό διαχωρισμό κυττάρων (συνήθως με FACS σε πλάκες 96 φρεατίων), κυτταρική λύση και WGA. Ένα ενισχυμένο γονιδίωμα από ένα μόνο κύτταρο μπορεί στη συνέχεια να αναλυθεί. Ενώ η μεταγονιδιωματική επιτυγχάνεται με τη συλλογή της κοινότητας μικροοργανισμών, την εξαγωγή και τον προσδιορισμό αλληλουχίας του συνολικού DNA, η SCG διαχωρίζει και μελετά μεμονωμένα κύτταρα από την κοινότητα μικροοργανισμών. Τα ληφθέντα δεδομένα αλληλουχίας παρέχουν ποσοτικές πληροφορίες για τη γονιδιωματική μεταβλητότητα σε πληθυσμούς μικροοργανισμών. Οι εισαγωγές γονιδίων, οι διαγραφές, οι διπλές και οι ανακατατάξεις γονιδιώματος μπορούν να μελετηθούν σε μονοκύτταρικό επίπεδο. Με αυτόν τον τρόπο οι πολύπλοκες μεταβολικές οδοί μπορούν να αναλυθούν για ένα μεμονωμένο κύτταρο.

Μονοκυτταρική απομόνωση και επεξεργασία

Η μελέτη του γονιδιώματος και η ρύθμισή του σε επίπεδο πληθυσμού γίνεται με την ανάλυση εκατομμυρίων κυττάρων ταυτόχρονα. Ωστόσο, τέτοιες έρευνες δεν επιτρέπουν την προβολή της ετερογένειας στα βιολογικά συστήματα, ούτε χαρακτηρίζουν την τρέχουσα κατάσταση του πληθυσμού. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο η SCG κερδίζει όλο και περισσότερη δημοτικότητα για τη μελέτη τόσο των καλλιεργήσιμων όσο και ιδιαίτερα των μη καλλιεργήσιμων μικροοργανισμών. Η διαδικασία λήψης, πολλαπλασιασμού και αλληλουχίας γενετικού υλικού είτε από ζωντανά είτε από νεκρά κύτταρα είναι σχετικά απλή. Πρώτα πρέπει να απομονωθεί και να λυθεί το κύτταρο και στη συνέχεια να ενισχυθεί το γενετικό υλικό που απελευθερώνεται και να δημιουργηθεί η γονιδιωματική βιβλιοθήκη.

Μία από τις προσεγγίσεις για την απομόνωση ενός κυττάρου είναι η μικροεπεξεργασία. Τα κύτταρα ενδιαφέροντος προσδιορίζονται, απομονώνονται και εξετάζονται μικροσκοπικά. Τα κατάλληλα κύτταρα απομονώνονται χρησιμοποιώντας μικροπιπέτα, πηγή λέιζερ, οπτικές λαβίδες ή με μικρορευστότητα σε πραγματικό χρόνο. Με τη χρήση μικρορευστών, μπορεί να επιλεγεί ένας επιθυμητός φαινότυπος που σχετίζεται με ένα συγκεκριμένο γονιδίωμα. Επιπλέον, τα κύτταρα μπορούν εύκολα να παρατηρηθούν πριν από τη σύλληψη.

Μια άλλη προσέγγιση είναι η τυχαία ενθυλάκωση. Τα κύτταρα επιλέγονται τυχαία με σειριακή αραίωση. Το αραιωμένο δείγμα μπορεί στη συνέχεια να μεταφερθεί σε μικροκύτταρα ή τα κύτταρα μπορούν να ενθυλακωθούν με μικροσταγονίδια. Χρησιμοποιώντας αυτήν την τεχνική, μεμονωμένα κύτταρα μπορούν να διαχωριστούν, να υποβληθούν σε επεξεργασία και να υποβληθούν σε γονιδιωματική ανάλυση.

Η κυτταρομετρία ροής είναι η πιο δημοφιλής διαδικασία τυχαίας ενθυλάκωσης. Το FACS επιτρέπει την απομόνωση κυττάρων που διαθέτουν συγκεκριμένα κριτήρια, όπως το μέγεθος, το σχήμα, το χρώμα ή ακόμη και η παρουσία συγκεκριμένων νουκλεϊκών οξέων ή δραστηριοτήτων, χρησιμοποιώντας φθορίζουσες βαφές (Σχμ. 4). Ένα από τα κύρια πλεονεκτήματα του FACS είναι η υψηλή απόδοση, η υψηλή ταχύτητα ταξινόμησης και η ικανότητα διάκρισης ζωντανών κυττάρων. Επιπλέον, το FACS μπορεί να ανιχνεύσει την παρουσία κυττάρων σε ένα σταγονίδιο, να απορρίψει τα κενά σταγονίδια και να μεταφέρει τα κύτταρα με τις επιθυμητές ιδιότητες σε πλάκες πολλαπλών φρεατίων / μικροτιτλοδότησης. Στη συνέχεια, τα κύτταρα μπορούν να διαλύονται και τα γονιδιώματα μπορούν να ενισχυθούν σε μεμονωμένα φρεάτια.

Μια άλλη δυνατότητα για απομόνωση ενός κυττάρου είναι η τεχνολογία μικροσταγονιδίων (Σχμ. 4). Τα μικροσταγονίδια είναι το γαλάκτωμα που σχηματίζεται όταν τα κύτταρα στην υδατική φάση αναμειγνύονται έντονα με λάδι. Σταγονίδια λαδιού περικλείουν τα κύτταρα στην υδατική φάση. Αρχικά, η PCR που πραγματοποιήθηκε σε ένα γαλάκτωμα θεωρήθηκε ότι ήταν πολύ πιο συγκεκριμένη από την ανάλυση κυττάρων μόνο στην υδατική φάση. Προτάθηκε ότι οι αποδόσεις των προϊόντων αντίδρασης είναι μεγαλύτερες και σχηματίζονται λιγότερα χιμαιρικά υποπροϊόντα. Επιπλέον, τα σταγονίδια που σχηματίστηκαν περικλείουν περιορισμένο αριθμό προτύπων μορίων (ιδανικά μόνο ένα). Οι τελευταίες εξελίξεις στα μικρορευστά επιτρέπουν τον έλεγχο του μεγέθους των σταγονιδίων (νανολίτρο ή ακόμα και του πικολίθου), παρέχοντας υδατικά ομοιόμορφα (μονοδιάσπαρτα) σταγονίδια στο λάδι. Ένα από τα κύρια πλεονεκτήματα του διφασικού συστήματος μικροσταγονιδίων έναντι του FACS είναι η δυνατότητα χειρισμού μεμονωμένων κυττάρων ως διαχωρισμένων μονάδων. Κάθε σταγονίδιο λειτουργεί ως ανεξάρτητο φρεάτιο όπου τα κύτταρα μπορούν να αναπτυχθούν και αργότερα να υποβληθούν σε διαλογή για τα προϊόντα που εκφράζονται. Το απελευθερωμένο gDNA μπορεί να ενισχυθεί αποτελεσματικά σε μικροσταγονίδια και να χρησιμοποιηθεί για την προετοιμασία της βιβλιοθήκης αλληλουχίας. Τα κύτταρα βακτηρίων, ζυμομυκήτων, φυτών, εντόμων και θηλαστικών μπορούν εύκολα να μελετηθούν χρησιμοποιώντας την τεχνολογία μικροσταγονιδίων σε αγαρόζη ή άλλα μικροπηκτώματα. Ακόμα και πολυκύτταροι οργανισμοί μπορούν να εγκλωβιστούν και να αναπτυχθούν σε σταγονίδια. Υποθετικά, είναι δυνατόν να μετρηθεί οποιοδήποτε εκκρινόμενο μόριο για το οποίο υπάρχει ένας προσδέτης με φθορισμό επισημασμένο. Επιπλέον, οι δραστηριότητες διαφόρων κυτταρικών πρωτεϊνών μπορούν να παρακολουθούνται.

Σχήμα 4. Μονοκυτταρικές τεχνικές απομόνωσης

Προσεγγίσεις για τη μελέτη διαφόρων κυττάρων

Τα ζωντανά κύτταρα μπορούν γενικά να ταξινομηθούν σε βακτήρια, αρχαιά και ευκαρυώτες. Αν και οι ιοί δεν θεωρούνται «ζωντανοί», αποτελούν σημαντικό μέρος των μελετών της επιστήμης της ζωής. Υπάρχουν διάφορες μονοκυτταρικές αναλύσεις που είναι κατάλληλες για διαφορετικούς οργανισμούς.

Οι ιοί υπάρχουν σχεδόν σε κάθε περιβάλλον. Είναι οι πιο άφθονες και ποικίλες βιολογικές οντότητες. Ωστόσο, για την απομόνωση ενός ιού και την αλληλουχία του γονιδιώματός του, πρέπει πρώτα να δημιουργηθεί ένα κατάλληλο καλλιεργήσιμο σύστημα ξενιστή ιού. Για παράδειγμα, τα ευκαρυωτικά φύκια είναι ένας ξενιστής μιας απίστευτης ποικιλίας ιών. Ωστόσο, χρησιμοποιώντας τόσο τα συστήματα FACS όσο και τα σταγονίδια, οι ιοί θεωρητικά μπορούν να απομονωθούν χωρίς εξάρτηση από το σύστημα του ιού-ξενιστή.

Τα αρχαία και τα βακτήρια έχουν παρόμοια κυτταρική δομή. Μόνο οι διαφορές στη σύνθεση και την οργάνωση των κυττάρων διαχωρίζουν αυτούς τους δύο μικροοργανισμούς. Τα βακτηριακά κύτταρα έχουν συνήθως διάμετρο 0,5-5,0 μm, ενώ τα αρχαιά μπορεί να είναι μεγαλύτερα και να φτάνουν τα 15 μm σε διάμετρο. Βασικά, όλες οι μέθοδοι που περιγράφονται παραπάνω μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον διαχωρισμό και την επεξεργασία μεμονωμένων αρχαίων και βακτηριακών κυττάρων. Ωστόσο, κατά τη διάρκεια του FACS υψηλά ρεύματα μπορεί να επιβραδύνουν την ανάπτυξη αυτών των οργανισμών.

Οι ευκαρυώτες διαφοροποιούνται από τους άλλους τομείς ζωής από τον πυρήνα που συνδέεται με τη μεμβράνη και τα οργανίδια που συνδέονται με τη μεμβράνη. Μπορεί να είναι πολυκύτταροι ή μονοκύτταροι οργανισμοί. Το μέγεθος των κυττάρων κυμαίνεται συνήθως από περίπου 10-100 μm ή είναι δέκα φορές μεγαλύτερο από τα βακτήρια. Η αραίωση, το FACS και η διαλογή σταγονιδίων είναι όλες οι κατάλληλες μέθοδοι για την απομόνωση των ευκαρυωτικών κυττάρων.

Οι πολυκύτταροι οργανισμοί θεωρητικά μπορούν επίσης να απομονωθούν και να υποστούν επεξεργασία με διάφορες μεθόδους. Το FACS για παράδειγμα μπορεί εύκολα να ταξινομήσει πολυκύτταρους οργανισμούς. Εάν επωαστούν σε σταγονίδια για αρκετό χρονικό διάστημα, οι μονοκύτταροι οργανισμοί μπορούν να συνθέσουν μια πρωτεΐνη ή ένα πρόσδεμα και να έχουν την ευκαιρία να πολλαπλασιαστούν, δημιουργώντας δυνητικά μια πολυκυτταρική δομή.

Οι μοριακές μελέτες του περιβάλλοντος και της οικολογίας μας αποκτούν όλο και περισσότερες γνώσεις για τις ζωντανές κοινότητες. Με την ανάπτυξη μοριακών εργαλείων, ειδικά μηχανών αλληλουχίας, κατέστη δυνατή η ταξινόμηση ολόκληρων κοινοτήτων από επιλεγμένα περιβάλλοντα. Οι πρόσφατες εξελίξεις στις τεχνολογίες ενός κυττάρου διευκολύνουν την απομόνωση και την ενίσχυση του γονιδιωματικού υλικού από μεμονωμένα κύτταρα και επιτρέπουν τη δομή πολυάριθμων βιβλιοθηκών που βασίζονται σε αλληλουχίες. Επιπλέον, τα δεδομένα που λαμβάνονται από το SCG συμπληρώνουν δεδομένα που λαμβάνονται από τη μεταγονιδιωματική.

Προσεγγίσεις Omics στην βιομηχανική Βιοτεχνολογία και Μηχανική Βιοεπεξεργασίας

Η βιοτεχνολογία χρησιμοποιεί βιολογικές διαδικασίες, οργανισμούς ή συστήματα για τη δημιουργία προϊόντων και τεχνολογιών που βελτιώνουν τις ανθρώπινες ζωές. Η χρήση βιολογικών συστημάτων για την παραγωγή βιοπροϊόντων εμπορικής σημασίας αποτελεί βασικό συστατικό της βιομηχανίας βιοτεχνολογίας. Αυτή η βιοτεχνολογική προσέγγιση έχει βρει εφαρμογή σε διάφορους τομείς: βιομηχανίες ενέργειας, υλικών, φαρμάκων, τροφίμων, γεωργίας και καλλυντικών. Τα βιοπροϊόντα που παράγονται από διαδικασίες βιοκατασκευής είναι συνήθως μεταβολίτες και πρωτεΐνες, οι οποίες λαμβάνονται από κύτταρα, ιστούς και όργανα. Τα βιολογικά συστήματα που συνθέτουν αυτά τα βιοπροϊόντα μπορεί να είναι φυσικά ή να τροποποιηθούν με γενετική μηχανική, μεταβολική μηχανική, συνθετική βιολογία και μηχανική πρωτεϊνών. Οι τεχνολογίες Omics έχουν μεγάλη σημασία για τη βιοτεχνολογία και τη μεταβολική μηχανική βοηθώντας στον χαρακτηρισμό και την κατανόηση των μεταβολικών δικτύων. Ο σημαντικός όγκος της γνώσης που αποκτήθηκε από πειράματα που βασίζονται στην τεχνολογία Omics μπορεί να εφαρμοστεί στην ανάπτυξη βιοτεχνολογικών εργαλείων και στην πρόοδο της μεταβολικής μηχανικής. Αυτό επιτρέπει τη χειραγώγηση πολύπλοκων βιολογικών συστημάτων προς τη δημιουργία ισχυρών βιομηχανικών στρατηγικών βιοκατασκευής.

Βιοτεχνολογία καθοδηγούμενη από την τεχνολογία Omics

Τα εργαλεία Omics χρησιμοποιούνται όλο και περισσότερο στην ανάπτυξη βιοτεχνολογικών διαδικασιών και στην παραγωγή πολλών ζωτικών προϊόντων. Η εφαρμογή τεχνολογιών omics στον χαρακτηρισμό και την κατανόηση των βιολογικών συστημάτων επέτρεψε την επιλογή και πρόβλεψη φαινοτύπων, γεγονός που διευκολύνει τη βελτιστοποίηση των βιοτεχνολογικών διαδικασιών προς την κατεύθυνση της ενισχυμένης παραγωγής (σε ποιότητα και ποσότητα) εμπορικά συναφών προϊόντων (Σχήμα 5).

Fig. Σχήμα 5. Εργαλεία Omics στην Βιοτεχνολογία

Παραγωγή Βιοκαυσίμων και Βιοπροιόντων

Η μικροβιακή παραγωγή φυσικών ενώσεων αντιπροσωπεύει μια ελκυστική και πιο βιώσιμη εναλλακτική λύση στα παραδοσιακά πετροχημικά. Η εφαρμογή του οδήγησε σε έναν αυξανόμενο κατάλογο φυσικών προϊόντων και χημικών προϊόντων υψηλής αξίας. Αμέσως, η χρήση λιγνοκυτταρινικής βιομάζας αντιπροσωπεύει μια οικονομική προσέγγιση για την παραγωγή βιοκαυσίμων και βιοπροϊόντων. Ωστόσο, για να επιτευχθεί σταθερή μετατροπή πρώτων υλών χαμηλού κόστους σε προϊόντα προστιθέμενης αξίας σε βιομηχανικά επίπεδα χρειάζονται συστηματικά σχέδια μηχανικής. Ο κύκλος Σχεδιασμός-Δημιουργία-Δοκιμή-Μάθηση (DBTL) γίνεται μια ολοένα και περισσότερο εφαρμόσιμη προσέγγιση για πειράματα μεταβολικής μηχανικής. Αντιπροσωπεύει ένα συστηματικό και αποτελεσματικό εργαλείο για να αναγκάσει τις αναπτυξιακές προσπάθειες για βιοκαύσιμα και βιολογικά προϊόντα. Ο κύκλος DBTL χρησιμοποιεί σε προσέγγιση πυριτίου τον σχεδιασμό και την κατασκευή γενετικών κατασκευών σε μικροβιακούς ξενιστές. Στη συνέχεια, οι πληροφορίες που λαμβάνονται από τεχνολογίες omics, κατά τη φάση δοκιμής του κύκλου, μεταφέρονται στις διαδικασίες εκμάθησης (Σχήμα 6). Αυτό που μαθαίνεται στη συνέχεια επιστρέφει σε νέους κύκλους σχεδίασης για να επιτευχθεί περαιτέρω ανάπτυξη και βελτιστοποίηση. Έτσι, διευκολύνεται η ταχεία βελτιστοποίηση των μικροβιακών στελεχών που παράγουν οποιαδήποτε χημική ένωση ενδιαφέροντος. Το πιο αδύναμο σημείο στη ροή εργασιών του κύκλου DBTL είναι η διαδικασία εκμάθησης, καθώς τα μαθηματικά μοντέλα είναι τόσο καλά όσο και οι υποθέσεις τους. Ως εκ τούτου, απαιτούνται τόσο υψηλής ποιότητας όσο και μεγάλα σύνολα δεδομένων omics για τη βελτίωση των μοντέλων εκπαίδευσης, εξασφαλίζοντας αυξημένη ακρίβεια και αξιοπιστία της διαδικασίας Μάθησης.

Σχήμα 6. Κύκλος DBTL για βελτιστοποίηση των βιοκαυσίμων και των βιοπροιόντων

Συχνά στον κύκλο DBTL οι πληροφορίες γονιδιωματικής αλληλουχίας είναι η παραδοσιακή προσέγγιση που χρησιμοποιείται στα αρχικά στάδια μιας μελέτης. Για παράδειγμα, η αλληλουχία γραμμωτού κώδικα (Bar-seq) (μέθοδος που χρησιμοποιεί ένα σύντομο τμήμα DNA από συγκεκριμένο γονίδιο ή γονίδια) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη της δυναμικής του πληθυσμού των βιβλιοθηκών διαγραφής Saccharomyces cerevisiae κατά την καλλιέργεια βιοαντιδραστήρων, επιτρέποντας τον προσδιορισμό των παραγόντων που επηρεάζουν την ποικιλομορφία μιας μεταλλαγμένης δεξαμενής. Η καθοδηγούμενη προσέγγιση αλληλουχίας με ένα κύτταρο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό βασικών μεταλλαγμένων υποκινητών για τη ρύθμιση των επιπέδων έκφρασης, διευκολύνοντας έτσι τη δυναμική ρύθμιση της μικροβιακής ανάπτυξης. Εφαρμόστηκαν προσεγγίσεις καθοδηγούμενες από πρωτεομικά για να κατασκευάσουν πλατφόρμες βιοσύνθεσης πολυκετιδίου για in vitro παραγωγή αδιπικού οξέος σε ζύμη. Επιπλέον, η μεταβολική επιτρέπει την εκτίμηση της ροής των οδών, τη χρήση της πηγής άνθρακα και την ανισορροπία συμπαράγοντα, τα οποία συμβάλλουν στην ταυτοποίηση των σημείων συμφόρησης. Αυτή η κατευθυνόμενη μεταβολική προσέγγιση χρησιμοποιείται ήδη για τον χαρακτηρισμό της παραγωγής κανναβινοειδών σε μηχανική S. cerevisiae. Τα ανάλογα κανναβινοειδών έχουν εντοπιστεί που παράγονται από πολλά γονίδια τυχαίων μονοπατιών. Επιπλέον, η εφαρμογή των μεταβολικών βοήθησε τον σχεδιασμό και τη βελτιστοποίηση μιας νέας οδού μεβαλονικού διποφενικού διφωσφορικού ισοπεντενυλίου στο Ε. Coli για παραγωγή αλκοόλης C5. Πρόσφατα, ορισμένοι συγγραφείς χρησιμοποίησαν τον κύκλο DBTL για να σχεδιάσουν το Rhodosporidium toruloides, ένα ελαιώδες είδος ζύμης που αναπτύσσεται σε λιγνοκυτταρινικά υλικά και παράγει το διτερπένιο εντα-καυρένιο, ένα πιθανό θεραπευτικό, που παρουσιάζει αντιμικροβιακά, αντιφλεγμονώδη, καρδιαγγειακά, διουρητικά, αντι-HIV και κυτταροτοξικές επιδράσεις.

Γεωργία και Τροφική Βιοτεχνολογία

Πρόσφατες καινοτομίες στη γεωργική βιοτεχνολογία έχουν οδηγήσει σε νέες ποικιλίες φυτών, που έχουν σχεδιαστεί από τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA και ανταποκρίνονται καλύτερα στις απαιτήσεις της αγοράς και στις περιβαλλοντικές προκλήσεις. Στην πραγματικότητα, τα εργαλεία omics στη γεωργική βιοτεχνολογία έχουν χρησιμοποιηθεί για την ενίσχυση των επιθυμητών φαινοτυπικών χαρακτηριστικών (π.χ. χρώμα, γεύση, ανοχή στην ξηρασία, αντοχή στα φυτοφάρμακα κ.λπ.). Η τεχνολογία Omics παίζει ρόλο όχι μόνο στη βελτίωση της ποιότητας, της συνέπειας και της παραγωγικότητας των καλλιεργειών, αλλά και στην ανάπτυξη καλλιεργειών τροφίμων με ενισχυμένη θρεπτική σύνθεση. Επιπλέον, η βιολογία συστημάτων που βασίζονται σε ομόλογα βοηθά στην κατανόηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των «ΟΜΕ» και παρέχει συνδέσεις μεταξύ γονιδίων και συγκεκριμένων χαρακτηριστικών.

Σε καλλιεργήσιμες εκτάσεις το έδαφος είναι πιο επιρρεπές σε απώλεια δομής, οργανικής ύλης, ορυκτών και διάβρωσης. Συνεπώς, καταβάλλονται προσπάθειες, μέσω της γεωργικής βιοτεχνολογίας, να παρέχεται μια συνεχής παροχή θρεπτικών συστατικών απαραίτητων για την ανάπτυξη των καλλιεργειών. Αναπόσπαστο μέρος αυτής της προσέγγισης είναι η χρήση βιολιπασμάτων. Αυτά είναι σκευάσματα που περιέχουν εξειδικευμένα μικροβιακά εμβόλια που μπορούν να διορθώσουν, να κινητοποιήσουν, να διαλυτοποιήσουν ή να αποσυνθέσουν θρεπτικές πηγές. Τα βιολιπάσματα εφαρμόζονται γενικά μέσω σπόρων ή εδάφους και ενισχύουν την πρόσληψη θρεπτικών συστατικών από τα φυτά. Η ευρεία εφαρμογή αυτής της προσέγγισης, ωστόσο, παρεμποδίστηκε από τις διακυμάνσεις των απαντήσεων των μικροβιακών εμβολιασμών σε χωράφια και καλλιέργειες. Ως αποτέλεσμα, υπάρχει επιτακτική ανάγκη να κατανοηθούν καλύτερα οι μηχανισμοί που διέπουν τις αλληλεξαρτήσεις μεταξύ των μικροβιακών κοινοτήτων του εδάφους και της παραγωγικότητας των φυτών ξενιστών. Πρόσφατες μελέτες γονιδιωματικής και μεταβολικής έδειξαν ότι συγκεκριμένα βακτήρια ριζόσφαιρας προτιμούν φυσικά ορισμένα αρωματικά οργανικά οξέα που εκκρίνονται από τα φυτά. Αυτό το γεγονός πρότεινε ότι τα χαρακτηριστικά εξώθησης των φυτών και τα χαρακτηριστικά πρόσληψης μικροβιακού υποστρώματος αλληλεπιδρούν και σχηματίζουν συγκεκριμένα πρότυπα δημιουργείας μιας μικροβιακής κοινότητας. Επιπλέον, η εφαρμογή της γονιδιωματικής και της μεταγραφής στη μελέτη της πρόσληψης φωσφορικών από διάφορα μικροφύκη αποκάλυψε μια σειρά μεταφορέων Pi που έχουν συγκεκριμένα πρότυπα έκφρασης σε σχέση με τη διαθεσιμότητα του Ρ. Επί του παρόντος, χρησιμοποιούνται τεχνικές omics για τη μελέτη σύνθετων ριζοσφαιρικών ενδοεπικοινωνιών, που είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη νέων βιολιπασμάτων, προωθώντας έτσι τη σταθερή ανάπτυξη των φυτών, την καλύτερη παραγωγικότητα και την απόδοση των καλλιεργειών.

Στον σχετικό τομέα της βιοτεχνολογίας τροφίμων, η εφαρμογή μεταγραφικών και μεταβολικών έδειξε ότι το Bacillus pumilus LZP02 προάγει την ανάπτυξη των ριζών του ρυζιού ενισχύοντας τον μεταβολισμό των υδατανθράκων και τη βιοσύνθεση φαινυλοπροπανοειδών. Επιπλέον, η εφαρμογή τεχνικών omics στη βιομηχανική αμύλου παρέχει καλύτερη κατανόηση των σημαντικότερων ενζύμων για τη βιοσύνθεσή του. Αυτό διευκολύνει την πρόβλεψη για τον τρόπο τροποποίησης των φαινοτύπων που σχετίζονται με το άμυλο και εξασφαλίζει περαιτέρω πρόοδο στον ερευνητικό τομέα της βιοτεχνολογίας αμύλου ρυζιού. Το “Omics” βοηθά επίσης στην επίλυση ζητημάτων που σχετίζονται με την ποιότητα και την ιχνηλασιμότητα των τροφίμων, την προστασία της προέλευσης των τροφίμων και την ανακάλυψη βιοδεικτών πιθανών προβλημάτων ασφάλειας τροφίμων. Η εκ των προτέρων διερεύνηση του μικροβιώματος του κρασιού έχει μεγάλη επιρροή για τη βιομηχανία κρασιού βοηθώντας στην καλύτερη κατανόηση των παραγόντων που μετατρέπουν τα σταφύλια σε κρασί, συμπεριλαμβανομένης της γεύσης και του αρώματος. Ο χαρακτηρισμός, χρησιμοποιώντας τεχνικές Omics, των πολύπλοκων σχέσεων μεταξύ αυτών των μικροοργανισμών, του υποστρώματος και του περιβάλλοντος, είναι απαραίτητος για τη διαμόρφωση της παραγωγής κρασιού. Τέλος, ο συνδυασμός τεχνολογιών omics με την  γονιδιωματική επεξεργασία μικροοργανισμών τροφίμων μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη δημιουργία βελτιωμένων στελεχών προβιοτικών, την ανάπτυξη καινοτόμων βιοθεραπευτικών και την τροποποίηση της δομής της μικροβιακής κοινότητας σε μήτρες τροφίμων.

Τεχνολογίες OMICs” και COVID-19

Η ασθένεια του κορωνοϊού 2019 (COVID-19) χαρακτηρίζεται από σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο κορωνοϊού 2 [δηλαδή, SARS-CoV-2, ο οποίος συνδέεται με τον υποδοχέα ACE2 στον πνεύμονα και άλλα όργανα]. Λόγω της παγκόσμιας εξάπλωσής της έχει ανακοινωθεί παγκόσμια πανδημία και έχει επιβραδυνθεί μεγάλο μέρος της παγκόσμιας οικονομίας. Μέχρι τον Απρίλιο του 2021 υπάρχουν περισσότερα από 138 εκατομμύρια επιβεβαιωμένα κρούσματα και 2,5 εκατομμύρια επιβεβαιωμένοι θάνατοι παγκοσμίως (https://www.worldometers.info/coronavirus/). Έτσι, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για ένα αποτελεσματικό αντίμετρο για τον μετριασμό της εξάπλωσης της πανδημίας.

Συνεπώς, συνεχίζονται οι προσπάθειες για την ταχεία παρακολούθηση της ανάπτυξης και παραγωγής ασφαλών και αποτελεσματικών εμβολίων κατά του SARS-CoV-2. Η προηγούμενη γνώση του SARS και του αναπνευστικού συνδρόμου της Μέσης Ανατολής (MERS) διευκόλυνε τη στόχευση της πρωτεΐνης αιχμής ως ιικού αντιγόνου (μέσω του υποδοχέα ACE2). Επιπλέον, η αλληλουχία γονιδιώματος του SARS-CoV-2 τον Ιανουάριο του 2020 επέτρεψε την επιτάχυνση της ανάπτυξης mRNA επόμενης γενιάς και πλατφορμών εμβολίων που κωδικοποιούν το αντιγόνο. Μόλις εγχυθεί σε έναν ξενιστή, το mRNA, εγκλωβισμένο σε λιπιδικά νανοσωματίδια, παραμένει στο κυτταρόπλασμα. Όταν χρησιμοποιείται DNA, εγκλωβισμένο σε εξασθενημένο φορέα αδενοϊού, εισέρχεται στον πυρήνα. Το κύτταρο ξενιστής μεταφράζει αυτά τα γενετικά υλικά στην πρωτεΐνη αιχμής. Εγκαθίσταται στην επιφάνεια του κυττάρου και προκαλεί μια προσαρμοστική ανοσοαπόκριση που αντιμετωπίζεται από τα Τ κύτταρα (π.χ., CD4+ και CD8+) και Β κύτταρα (δηλαδή, αντισώματα). Αυτά τα εμβόλια αναφέρθηκαν ότι ήταν αποτελεσματικά έναντι του SARS-CoV-2 σε πρόσφατες κλινικές δοκιμές, γεγονός που υπογραμμίζει τη σημασία των γονιδιωματικών στη νέα εποχή ανάπτυξης εμβολίων.

Από την αρχή του ξεσπάσματος του SARS-CoV-2 δημιουργήθηκε ένας χάρτης αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης και αποκαλύφθηκαν στόχοι με βάση την πρωτεϊνομετρική προσέγγιση για επαναχρησιμοποίηση φαρμάκων. Εφαρμόζοντας πρωτεϊνομετρική ανάλυση κλωνοποιήθηκαν 26 από τις 29 πρωτεΐνες SARS-CoV-2, επισημάνθηκαν η συγγένεια και εκφράστηκαν σε ανθρώπινα κύτταρα και ταυτοποιήθηκαν οι σχετικές πρωτεΐνες. Συνολικά 66 ανθρώπινες πρωτεΐνες ή παράγοντες ξενιστές ανακαλύφθηκαν ως πιθανοί στόχοι φαρμάκων 69 ενώσεων. Δύο σετ αυτών των φαρμακολογικών παραγόντων έδειξαν αντιική δράση. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν υπολογιστικές ανοσοπρωτεομικές μελέτες υποστηρίζοντας τις εργαστηριακές έρευνες και επιτρέποντας την αξιολόγηση της ειδικότητας των διαγνωστικών προϊόντων, την πρόβλεψη πιθανών ανεπιθύμητων ενεργειών των εμβολίων και τη μείωση της χρήσης ζωικών μοντέλων.

Επιπλέον, πρόσφατα αναπτύχθηκε μια μέθοδος βασισμένη στη μεταβολική που είναι σε θέση να διακρίνει τους ασθενείς με COVID-19 από υγιείς μάρτυρες μέσω ανάλυσης 10 μεταβολιτών πλάσματος. Επιπλέον, τα δεδομένα από τη μελέτη της λιπιδωμικής υποδηλώνουν ότι εμπλουτισμένα εξωσωμικά γαγγλιοσιδικά εξωσωμίδια θα μπορούσαν να εμπλέκονται σε παθολογικές διεργασίες. Οι έρευνες για πρωτεϊνομεταλλικές και μεταβολικές επιδράσεις σε ορούς ασθενών με COVID-19 αποκάλυψαν ότι η μόλυνση από SARS-CoV-2 προκαλεί μεταβολική δυσρύθμιση του μεταβολισμού των μακροφάγων και των λιπιδίων, αποκοκκίωση των αιμοπεταλίων, οδούς του συστήματος συμπληρώματος και μαζική μεταβολική καταστολή. Η ανάλυση των μεταβολικών υπογραφών πλάσματος έδειξε παρόμοιο προφίλ με εκείνο που περιγράφεται για το σύνδρομο σήψης. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της μεταγραφής έδειξαν αυξημένη ρύθμιση των γονιδίων που σχετίζονται με την οξειδωτική φωσφορυλίωση τόσο σε περιφερειακά μονοπύρηνα λευκοκύτταρα όσο και σε βρογχοκυψελιδικό υγρό πλύσης. Όλες αυτές οι πληροφορίες υποδηλώνουν έναν κρίσιμο ρόλο της μιτοχονδριακής δραστηριότητας κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από SARS-CoV-2. Η κατανόηση της κλινικής παρουσίασης του COVID-19 καθώς και των μεταβολικών, πρωτεομικών και γενετικών προφίλ θα μπορούσε να βοηθήσει στην ανακάλυψη συγκεκριμένων διαγνωστικών, προγνωστικών και προγνωστικών βιοδεικτών, εξασφαλίζοντας την ανάπτυξη πιο επιτυχημένης ιατρικής θεραπείας. Επιπλέον, η διαφοροποίηση των μεταβολικών βιοδεικτών σοβαρών και ήπιων καταστάσεων ασθένειας στον πνεύμονα κατά τη διάρκεια λοιμώξεων του αναπνευστικού θα μπορούσε να οδηγήσει στην ανακάλυψη νέων θεραπευτικών που ρυθμίζουν τα συμπτώματα και τη σοβαρότητα της νόσου.

Διατροφική έρευνα βασιζόμενη στην τεχνολογία Omics

Πάνω από μια δεκαετία έχει περάσει από τότε που πρωτοεμφανίστηκε η ιδέα της διατροφογενομικής. Η διατροφογενομική, που αναφέρεται επίσης ως διατροφική γονιδιωματική, διατροφική omics ή nutri-omics, μπορεί να οριστεί ως ένας τομέας έρευνας για τα τρόφιμα και τη διατροφή χρησιμοποιώντας βαθιές αναλύσεις μορίων ή άλλα φυσικά φαινόμενα.

Λαμβάνοντας υπόψη την πολυπλοκότητα του ανθρώπινου σώματος και τις διάφορες αλληλεπιδράσεις του με τα τρόφιμα, είναι κατανοητό ότι οι ολιστικές αναλύσεις των αλληλεπιδράσεων τροφίμων-σώματος αποτελούν σημαντική προϋπόθεση για την καλύτερη κατανόηση της επίδρασης των συστατικών της διατροφής. Η κύρια υπόθεση είναι ότι ο συνδυασμός διαφορετικών πλατφορμών omics θα δώσει μια βαθύτερη εικόνα για την επιρροή των συστατικών των τροφίμων και τον μηχανισμό των ενεργειών τους.

Γονιδιωματική και διατροφή

Τα ανθρώπινα γονίδια έχουν διαφορετικές παραλλαγές στον πληθυσμό. Έχοντας υπόψη ότι η ανταπόκριση στη διατροφή είναι μια πολυγονιδιακή διαδικασία, δεν αποτελεί έκπληξη το γεγονός ότι τα μη συγγενικά άτομα μπορεί να ανταποκριθούν διαφορετικά. Η βασική τους υπόθεση που προτάθηκε τα τελευταία χρόνια ανέφερε ότι η γενετική διακύμανση βασίζεται στη διακύμανση των διαταραχών που σχετίζονται με τη διατροφή και τον κίνδυνο για ασθένειες. Στην πραγματικότητα, η διατροφογενετική προσπαθεί να εξηγήσει πώς και σε ποιο βαθμό τα χαρακτηριστικά και οι διαταραχές που σχετίζονται με τη διατροφή επηρεάζονται από τη γενετική διακύμανση. Με άλλα λόγια, τα βασικά ερωτήματα της διατροφογενετικής είναι:

  • Ποια γονίδια εμπλέκονται στον προσδιορισμό ενός καθορισμένου χαρακτηριστικού;
  • Ποια είναι η λειτουργική ταυτότητα της παραλλαγής με την οποία οι άνθρωποι διαφέρουν για αυτό το χαρακτηριστικό;
  • Πώς μπορεί να χρησιμοποιηθεί αυτή η γνώση προς όφελος του πληθυσμού;

Συνήθως, οι ερευνητές ορίζουν «υποψήφια γονίδια» για ένα χαρακτηριστικό ή διαταραχή και αναζητούν παραλλαγή σε αυτά τα γονίδια. Αυτό περιγράφεται ως η προσέγγιση «βασισμένη σε υποθέσεις» επειδή η επιλογή των γονιδίων βασίζεται στην υποτιθέμενη λειτουργία τους. Για παράδειγμα, τα γονίδια για τις λιποπρωτεΐνες χρησιμοποιούνται ως υποψήφια για παχυσαρκία και τα γονίδια για τη σηματοδότηση της ινσουλίνης – ως υποψήφια για διαβήτη. Άλλοι ελκυστικοί υποψήφιοι στους ανθρώπους είναι τα ορθολογικά γονίδια που κρύβονται στα ζωικά μοντέλα με Μεντελιανό διαχωρισμό ενός χαρακτηριστικού. Ένα πολύ γνωστό παράδειγμα είναι το ποντίκι db/db. Είναι ένα μοντέλο για τον διαβήτη στο οποίο ταυτοποιήθηκε το γονίδιο για τον υποδοχέα λεπτίνης. Ο ανθρώπινος ομόλογος δοκιμάστηκε στη συνέχεια σε άτομα με μειωμένη ανοχή γλυκόζης. Μια παραλλαγή (αλληλόμορφο) του γονιδίου εντοπίστηκε και αποδείχθηκε ότι σχετίζεται με σημαντικά υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης διαβήτη σε σύγκριση με τον γενικό πληθυσμό.

Άλλες μέθοδοι που εφαρμόζονται σχετίζονται με τη μελέτη του προτιμώμενου διαχωρισμού ενός αλληλόμορφου από τους γονείς σε ένα προσβεβλημένο παιδί (δοκιμή ανισορροπίας μετάδοσης) ή σε πιο επηρεασμένα αδέλφια (ανάλυση ζεύγους αδελφών). Εάν διαπιστωθεί ότι ένα γονίδιο συνδέεται με το χαρακτηριστικό, μένει να αποδειχθεί εάν το σχετικό ή συνδεδεμένο αλληλόμορφο είναι ο ίδιος ο παράγοντας κινδύνου ή αν θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί μόνο ως δείκτης για μια κοντινή αιτιολογική παραλλαγή. Εάν η γενετική παραλλαγή συνδέεται με τη διακύμανση των αμινοξέων στην πρωτεΐνη, θα μπορούσε να αναπτυχθεί μια λειτουργική δοκιμή και οι αλληλικές πρωτεΐνες μπορούν να συγκριθούν για την ενζυματική τους δράση, τη συγγένεια που συνδέει το DNA κ.λπ.

Μια άλλη προσέγγιση για την αναζήτηση γονιδίων που προκαλούν κίνδυνο για ένα συγκεκριμένο χαρακτηριστικό ή διαταραχή είναι η σάρωση συνολικού γονιδιώματος. Εκατοντάδες πολυμορφισμοί ανιχνεύονται με τυχαία κατανομή στο γονιδίωμα αλλά με γνωστή χρωμοσωμική θέση. Για κάθε πολυμορφική θέση τότε προσδιορίζεται αν υπάρχει συσχέτιση μεταξύ του αλληλόμορφου και του χαρακτηριστικού. Χρησιμοποιώντας αυτήν την προσέγγιση οι τόποι κινδύνου μπορούν να εντοπιστούν για πολλές διαταραχές που σχετίζονται με τη διατροφή του ανθρώπου, όπως η παχυσαρκία και ο διαβήτης.

Μετά τον Δεύτερο Παγκόσμιο Πόλεμο σε πολλές δυτικές χώρες, παρατηρήθηκε ότι τα περιστατικά της δισχιδής ράχης μειώθηκαν σταδιακά. Προτάθηκε ότι η βελτίωση της δίαιτας είχε φέρει αυτό το αποτέλεσμα. Ξεκίνησε μια μεγάλη επιδημιολογική μελέτη. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν έδειξαν ότι ο εμπλουτισμός της δίαιτας με βιταμίνες ήταν σε θέση να αποτρέψει την εμφάνιση και την επανεμφάνιση της δισχιδής ράχης σε ανθρώπους με ποσοστό άνω του 50%. Το φολικό οξύ ανακαλύφθηκε ότι είναι η δραστική ουσία και τώρα σε πολλές χώρες η προ-σύλληψη συμπλήρωση φολικού οξέος συνιστάται ως γενικό προληπτικό μέτρο. Ταυτόχρονα, έχει γίνει σαφές ότι όσον αφορά τον κίνδυνο για ένα παιδί με ραχιαία ρίζα, οι γυναίκες στον πληθυσμό μπορούν να χωριστούν σε τρεις ομάδες: [δεν] δεν κινδυνεύουν ακόμη και σε χαμηλή πρόσληψη φυλλικού οξέος, [β] σε κίνδυνο χαμηλά διαιτητικό φυλλικό οξύ αλλά μπορεί να βοηθηθεί από την αυξημένη πρόσληψη φυλλικού οξέος και [c] σε κίνδυνο παρά την επιπλέον πρόσληψη φυλλικού οξέος. Η γενετική προδιάθεση θεωρήθηκε και τα υποψήφια γονίδια που ελήφθησαν από το μεταβολισμό του φυλλικού οξέος εξετάστηκαν για γενετική παραλλαγή. Αυτό οδήγησε στην ανίχνευση των αλληλόμορφων 667C-> T και 1298A-> C στο γονίδιο για μεθυλενοτετραϋδροφολική αναγωγάση (MTHFR) ως παράγοντες κινδύνου. Ωστόσο, αυτά τα αλληλόμορφα κινδύνου ανακαλύπτονται σε κάποιο βαθμό και στις τρεις ομάδες γυναικών, αποδεικνύοντας ότι ο γενετικός έλεγχος στο πλαίσιο μιας εξατομικευμένης διατροφής θα ήταν ανεπαρκής. Επιπλέον, κατέστη σαφές ότι δεν μπορούσαν να εξηγηθούν όλοι οι σχετικοί κίνδυνοι με αυτά τα αλληλόμορφα. Συνεπώς, η αναζήτηση για γενετική παραλλαγή σε άλλα γονίδια συνεχίζεται και μπορεί να βρεθούν νέα υποψήφια γονίδια.

Επί του παρόντος, αρκετές εκατοντάδες γονίδια που σχετίζονται με συγκεκριμένα χαρακτηριστικά και διαταραχές που σχετίζονται με τη διατροφή έχουν ήδη αναγνωριστεί με τη χρήση γενετικών πειραμάτων σε διάφορους πληθυσμούς και τη διερεύνηση συστημάτων μοντέλων σε ζώα και in vitro. Τέλος, η έρευνα για τη διατροφογονιδιωματική και τη διατροφογενετική θα πρέπει να οδηγήσει στην ολοκληρωμένη κατανόηση της αιτιολογίας αυτών των χαρακτηριστικών και διαταραχών σε σχέση με τα αλληλεπιδρώντα γονίδια, τα συστατικά της διατροφής και τον σχετικό κίνδυνο που επιφέρει τόσο η γενετική διακύμανση όσο και η διατροφή. Αυτή η συνδυασμένη γνώση θα επιτρέψει το γενετικό προφίλ κάθε ατόμου και θα εκτιμήσει έτσι τον κίνδυνο του για ανάπτυξη διαταραχών που σχετίζονται με τη διατροφή. Με βάση αυτό το προσωπικό προφίλ κινδύνου γενετικών παραγόντων, θα μπορούσε στη συνέχεια να προταθεί μια «εξατομικευμένη διατροφή» με την οποία θα μπορούσε να προληφθεί ή τουλάχιστον να καθυστερήσει η εμφάνιση μιας διαταραχής. Δη ορισμένες εταιρείες προσφέρουν γενετικές δοκιμές για αλληλόμορφα που διαπιστώθηκε ότι σχετίζονται με ορισμένα χαρακτηριστικά. Για παράδειγμα, το αλληλόμορφο ApoE δοκιμάζεται ως παράγοντας κινδύνου για καρδιαγγειακές διαταραχές και ένα αλληλόμορφο του γονιδίου αφυδρογονάσης αλκοόλης χρησιμοποιείται για να προβλέψει πιθανή ευαισθησία στο αλκοόλ και (ab) χρήση. Ωστόσο, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η παρουσία συγκεκριμένου αλληλόμορφου μπορεί να ειπωθεί ότι αυξάνει τον κίνδυνο για διαταραχή κατά 100%, ενώ σε απόλυτους όρους ο κίνδυνος θα ήταν συνήθως πολύ μικρός, όπως μια αύξηση από 0,001 σε 0,002. Επιπλέον, η δοκιμή μόνο ενός γενετικού παράγοντα μπορεί να δώσει μια ατελή ή ακόμη και μια λανθασμένη εικόνα της κατάστασης. Σήμερα, δεν έχουμε ιδέα για όλους τους γενετικούς παράγοντες και πώς αλληλεπιδρούν. Μέχρι να συγκεντρωθούν περισσότερες πληροφορίες, οι συμβουλές που βασίζονται σε απλές δοκιμές πρέπει πιθανώς να παραμείνουν απλές, να ακούγονται σαν «πίνετε λιγότερο αλκοόλ» ή «τρώτε λιγότερο κορεσμένο λίπος».

Μεταγραφικά (Transcriptomics) και διατροφή

Η Transcriptomics είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη στην έρευνα τροφίμων λόγω των πολλών πλεονεκτημάτων της τεχνολογίας μικροσυστοιχιών DNA, συμπεριλαμβανομένης της πληρότητας των δεδομένων έκφρασης, των καθιερωμένων πρωτοκόλλων και της υψηλής αξιοπιστίας και αναπαραγωγιμότητας των δεδομένων. Έχει επίσης αναφερθεί η εναλλαγή της παγκόσμιας γονιδιακής έκφρασης ως απάντηση σε διαφορετικές διατροφικές αλλαγές όπως η διατροφική ανεπάρκεια, η νηστεία, η υπερκατανάλωση τροφής και η κατάποση συγκεκριμένων τροφικών παραγόντων. Ως ένα παράδειγμα των προσπαθειών που πραγματοποιήθηκαν για την απόκτηση δεδομένων αναφοράς, πραγματοποιήθηκε μεταγραφική ανάλυση του ήπατος αρουραίων που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ήπιο θερμιδικό περιορισμό. Κατά τη χρήση πειραμάτων σε ζώα, αποδείχθηκε ότι μια μέτρια μείωση της πρόσληψης τροφής ή ένα τροποποιημένο πρότυπο πρόσληψης θα μπορούσε να είναι επαρκής για την εμφάνιση σημαντικών μεταβολικών μεταβολών. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να γίνει διάκριση μεταξύ των άμεσων επιδράσεων του συστατικού τροφίμων και των δευτερογενών επιδράσεων που προκαλούνται από την αλλαγή στη διατροφική συμπεριφορά. Όταν οι αρουραίοι έλαβαν δίαιτα με 5 έως 30 % λιγότερη τροφή από εκείνη που καταναλώθηκε από μια ομάδα που έτρωγε κατά βούληση για 1 εβδομάδα ή 1 μήνα, παρατηρήθηκαν αλλαγές στο επίπεδο έκφρασης του cyp4a14 που εξαρτώνται από περιορισμούς. Στην πραγματικότητα, το γονίδιο cyp4a14 προκλήθηκε από ακόμη και χαμηλό επίπεδο θερμιδικών περιορισμών. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το γονίδιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βιοδείκτης για τις ευεργετικές επιδράσεις των τροφίμων στον ενεργειακό μεταβολισμό.

Πρωτεομικά και διατροφή

Πολλές έρευνες για τα τρόφιμα και τη διατροφή έχουν διεξαχθεί χρησιμοποιώντας πρωτεομικές προσεγγίσεις. Αμέσως, η επίδραση του ήπιου θερμιδικού περιορισμού που περιγράφηκε παραπάνω εξετάστηκε επίσης από την πρωτεομική. Εννέα σημαντικά αυξημένες πρωτεΐνες και εννέα μειωμένες πρωτεΐνες έχουν ανιχνευθεί μετά από τη σύγκριση πρωτεϊνών του ήπατος αρουραίων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με περιορισμό τροφής 30% με εκείνες ελέγχου. Ο περιορισμός δέκα τοις εκατό προκάλεσε την άνω ρύθμιση 9 πρωτεϊνών και την κάτω ρύθμιση 2 πρωτεϊνών. Μια ενδιαφέρουσα ανακάλυψη ήταν η ρύθμιση της απαγοτίνης, της οποίας η συμμετοχή στη ρύθμιση της μακροζωίας αποκαλύφθηκε πρόσφατα. Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι η απαβητίνη μπορεί να εφαρμοστεί ως αποτελεσματικός βιοδείκτης των ευεργετικών επιδράσεων των παραγόντων των τροφίμων. Παρόλο που το τρέχον στάδιο της έρευνας πρωτεομικής είναι πολύ λιγότερο εκτεταμένο σε σύγκριση με εκείνο της μεταγραφικής, η μελέτη που περιγράφεται εδώ μαζί με άλλα ευρήματα της διατροφικής πρωτεομικής δείχνει ότι η πρωτεϊνομετρική είναι ένα πολλά υποσχόμενο εργαλείο για την ανακάλυψη βιοδεικτών.

Μεταβολικά και διατροφή

Περίπου δέκα χιλιάδες διαφορετικοί τύποι κύριων μεταβολιτών υπάρχουν στα σώματα των ζώων, ενώ ο αριθμός των πρωτεϊνών θεωρείται ότι υπερβαίνει τις 100.000. Αυτό το χαρακτηριστικό των μεταβολιτών αναμένεται να έχει ως αποτέλεσμα πιο περιεκτικά χαρακτηριστικά μεταβολικής ανάλυσης από αυτά των πρωτεομικών. Ωστόσο, η ανάλυση των μεταβολιτών είναι στην πραγματικότητα γεμάτη δυσκολίες και συνήθως απαιτεί τη χρήση εξελιγμένων τεχνικών και προσωπικού υψηλού επιπέδου. Μια άλλη δυσκολία προέρχεται από την αφθονία των μεταβολιτών. Ανεξάρτητα από αυτά τα εμπόδια, η μεταβολική είναι ένα ισχυρό εργαλείο στην επιστήμη των τροφίμων και της διατροφής.

Πολλές έρευνες έδειξαν ότι ο μεταβολισμός του εντέρου και του ορού του αίματος επηρεάζεται από την αλλαγή στη σύνθεση του μικροβιώματος του εντέρου. Το μικροβίωμα του εντέρου και η εναλλαγή του σε σχέση με τη δίαιτα είναι απαραίτητα κατά την αξιολόγηση των δοκιμών διαιτητικής παρέμβασης με μεταβολικές τελικές επιδράσεις. Η σύγκριση μεταξύ ποντικών χωρίς μικρόβια που αποικίστηκαν από ανθρώπινη χλωρίδα και συμβατικά ποντίκια έδειξε την πολυπλοκότητα της τροποποίησης της διατροφής με τροποποίηση μικροβιώματος/μεταβολισμού. Σε αυτή τη μελέτη, μελετήθηκε η επίδραση του εντερικού μικροβιώματος στους μεταβολίτες του πλάσματος. Τα δεδομένα αποκάλυψαν ότι περισσότερο από το 10% του μεταβολισμού πλάσματος εξαρτάται άμεσα από το μικροβίωμα. Ορισμένα παραδείγματα για μικροβιακά εξαρτώμενες ενώσεις στο πλάσμα περιλαμβάνουν κιναμικό οξύ, ενώσεις συζευγμένες με γλυκίνη, ιππουρικό οξύ και άλλους μεταβολίτες πλάσματος. Το μικροβίωμα του εντέρου επηρεάζει επίσης άμεσα την ικανότητα του ξενιστή να μεταβολίζει λιπίδια, υδατάνθρακες και πρωτεΐνες και μπορεί να πραγματοποιήσει αρκετές αντιδράσεις αποτοξίνωσης φάσης II. Υπάρχουν επίσης ενδείξεις ότι οι μικροοργανισμοί του εντέρου χρησιμοποιούν μη θρεπτικά φυτοχημικά. Για παράδειγμα, αρκετές έρευνες κατέδειξαν ότι τα επίπεδα τριών μεταβολιτών που εξαρτώνται από το μικροβίωμα, της διατροφής, της χολίνης, της τριμεθυλαμίνης Ν και της βεταΐνης, θα μπορούσαν να προβλέψουν τον κίνδυνο καρδιαγγειακής νόσου σε ποντίκια.

Διατροφή και άλλες τεχνικές OMICs

Πολλές άλλες τεχνικές omics είναι επίσης ένα επίκεντρο της έρευνας για τις θρεπτική ουσίες. Αποδείχθηκε ότι η επιγενετική αλλοίωση μπορεί να προκληθεί από τη διατροφή κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης και μπορεί να επηρεάσει την προδιάθεση για ασθένειες που σχετίζονται με τον τρόπο ζωής στη μετέπειτα ζωή. Για παράδειγμα, τα παιδιά μητέρων που υπέστησαν υπερφαγία ή υποσιτισμό κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης έχουν αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης παχυσαρκίας, διαβήτη, υπέρτασης, καρδιαγγειακών παθήσεων κλπ. Πολλές μελέτες έχουν αποδείξει τη συμμετοχή επιγενετικών τροποποιήσεων σε τέτοια επίκτητη ευαισθησία. Ένας άλλος πολλά υποσχόμενος στόχος των προσεγγίσεων omics στην επιστήμη των τροφίμων σχετίζεται με τις μεταγραφές RNA που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Το MicroRNA (miRNA) είναι ένας υπότυπος αυτών των μη κωδικοποιητικών RNA. Οι πρόδρομοι των miRNA (pri-miRNA) είναι μακρά προϊόντα τα οποία διασπώνται για να δώσουν ώριμα miRNA με 22 νουκλεοτίδια σε μήκος. Τα ώριμα miRNA ρυθμίζουν τα επίπεδα αποικοδόμησης του mRNA, τη μετάφραση του mRNA, ακόμη και τη γονιδιακή μεταγραφή. Στην περίπτωση των ανθρώπινων κυττάρων, αναγνωρίζονται περίπου 1.000 miRNA και υποτίθεται ότι ρυθμίζουν την έκφραση περισσότερων από το ήμισυ των γονιδίων που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες. Λαμβάνοντας υπόψη τα συσσωρευμένα δεδομένα που υποστηρίζουν τον βασικό ρόλο του miRNA στην ανάπτυξη ασθενειών και τη διατήρηση της υγείας, οι πληροφορίες σχετικά με την κατάσταση των miRNA είναι αναμφίβολα ζωτικές για την κατανόηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ των συστατικών των τροφίμων και του σώματος. Η παγκόσμια ανάλυση miRNA μπορεί τώρα να πραγματοποιηθεί εύκολα με τη χρήση εμπορικών συστοιχιών miRNA.
Με την εισαγωγή των νέων τεχνολογιών και την αποκτηθείσα γνώση, ο αριθμός των τεχνολογιών omics και οι εφαρμογές τους σε διάφορους τομείς αυξάνονται ραγδαία στη μεταγεννετική εποχή. Τέτοια αναδυόμενα πεδία – συμπεριλαμβανομένης της φαρμακογονιδιωματικής, της τοξικογονιδιωματικής, της κανονικής, της σπλικεομικής, της μεταγονιδιωματικής και της περιβαλλοντικής – παρουσιάζουν πολλά υποσχόμενες λύσεις για την καταπολέμηση των παγκόσμιων προκλήσεων στη βιοϊατρική, τη γεωργία και το περιβάλλον.

Test: LO1-Προχωρημένο επίπεδο

Name

Βιβλιογαρφικές Αναφορές

  • Amer B, Baidoo EEK. 2021. Omics-Driven Biotechnology for Industrial Applications. Frontiers Bioeng. Biotech., 9, Art. 613307: 1-19.
  • Azizipour N, Avazpour R, Rosenzweig DH, Sawan M, Ajji A. 2020. Evolution of Biochip Technology: A Review from Lab-on-a-Chip to Organ-on-a-Chip. Micromachines, 11: 599.
  • Canzler S, · Schor J, · Busch W, et al. · 2020. Prospects and challenges of multi omics data integration in toxicology. Archives of Toxicology, 94:371–388.
  • Horgan RP, Kenny LC. 2011. ‘Omic’ technologies: genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. The Obstetrician & Gynaecologist, 13:189–195.
  • Joseph P. 2017. Transcriptomics in toxicology. Food Chem Toxicol., 109(1): 650–662.
  • Karahalil B. 2016. Overview of Systems Biology and Omics Technologies. Curr. Med. Chem., 23, 1-10.
  • Karczewski KJ, Snyder MP. 2018. Integrative omics for health and disease. Nat Rev Genet., 19(5): 299–310.
  • Kato H, Takahashi S, Saito K. 2011. Omics and Integrated Omics for the Promotion of Food and Nutrition Science. J. Trad. Complement. Medicine, 1 (1): 25-30.
  • Kim DH, Kim YS, Son NI, Kang CK, Kim AR. 2017. Recent omics technologies and their emerging applications for personalized medicine. IET Syst. Biol.,11 (3): 87-98.
  • Kodzius R, Gojobori T. 2016. Single-cell technologies in environmental omics. Gene 576: 701–707.
  • Mariman ECM. 2006. Nutrigenomics and nutrigenetics: the ‘omics’ revolution in nutritional science. Biotechnol Appl Biochem., 44(3):119-28.
  • Mousumi D, Prasad GBKS, Bisen PS. 2010. Omics technology. In: Molecular Diagnostics: Promises and Possibilities, Dordrech Heidelberg London, Springer, pp 11-31.
  • Ryan EP, Heuberger AL, Broeckling CD, Borresen EC, Tillotson C, Prenni JE. 2013. Advances in Nutritional Metabolomics. Current Metabolomics, 1: 109-120.
  • Sauer UG, Deferme L, Gribaldo L, et al. 2017. The challenge of the application of ‘omics technologies in chemicals risk assessment: Background and outlook. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 91: S14 – S26
  • Simões T, Novais SC, Natal-da-Luz T, et al. 2018. An integrative omics approach to unravel toxicity mechanisms of environmental chemicals: effects of a formulated herbicide. Scientific Reports 8:11376
  • Titz B, Elamin A, Martin F, et al. 2014. Proteomics for systems toxicology. Computational and Structural Biotechnology Journal, 11: 73–90.
  • Vlaanderen J, Moore LE, Smith MT, et al. 2010. Application of Omics Technologies in Occupational and Environmental Health Research; Current Status and Projections. Occup Environ Med., 67(2): 136–143.
  • Yılmaz B, Yılmaz F. 2018. Lab-on-a-Chip Technology and Its Applications. In: Omics Technologies and Bio-engineering: Towards Improving Quality of Life, pp. 145, Elsevier Inc.
  • Amer B, Baidoo EEK. 2021. Omics-Driven Biotechnology for Industrial Applications. Frontiers Bioeng. Biotech., 9, Art. 613307: 1-19.
  • Azizipour N, Avazpour R, Rosenzweig DH, Sawan M, Ajji A. 2020. Evolution of Biochip Technology: A Review from Lab-on-a-Chip to Organ-on-a-Chip. Micromachines, 11: 599.
  • Canzler S, · Schor J, · Busch W, et al. · 2020. Prospects and challenges of multi omics data integration in toxicology. Archives of Toxicology, 94:371–388.
  • Horgan RP, Kenny LC. 2011. ‘Omic’ technologies: genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. The Obstetrician & Gynaecologist, 13:189–195.
  • Joseph P. 2017. Transcriptomics in toxicology. Food Chem Toxicol., 109(1): 650–662.
  • Karahalil B. 2016. Overview of Systems Biology and Omics Technologies. Curr. Med. Chem., 23, 1-10.
  • Karczewski KJ, Snyder MP. 2018. Integrative omics for health and disease. Nat Rev Genet., 19(5): 299–310.
  • Kato H, Takahashi S, Saito K. 2011. Omics and Integrated Omics for the Promotion of Food and Nutrition Science. J. Trad. Complement. Medicine, 1 (1): 25-30.
  • Kim DH, Kim YS, Son NI, Kang CK, Kim AR. 2017. Recent omics technologies and their emerging applications for personalized medicine. IET Syst. Biol.,11 (3): 87-98.
  • Kodzius R, Gojobori T. 2016. Single-cell technologies in environmental omics. Gene 576: 701–707.
  • Mariman ECM. 2006. Nutrigenomics and nutrigenetics: the ‘omics’ revolution in nutritional science. Biotechnol Appl Biochem., 44(3):119-28.
  • Mousumi D, Prasad GBKS, Bisen PS. 2010. Omics technology. In: Molecular Diagnostics: Promises and Possibilities, Dordrech Heidelberg London, Springer, pp 11-31.
  • Ryan EP, Heuberger AL, Broeckling CD, Borresen EC, Tillotson C, Prenni JE. 2013. Advances in Nutritional Metabolomics. Current Metabolomics, 1: 109-120.
  • Sauer UG, Deferme L, Gribaldo L, et al. 2017. The challenge of the application of ‘omics technologies in chemicals risk assessment: Background and outlook. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 91: S14 – S26
  • Simões T, Novais SC, Natal-da-Luz T, et al. 2018. An integrative omics approach to unravel toxicity mechanisms of environmental chemicals: effects of a formulated herbicide. Scientific Reports 8:11376
  • Titz B, Elamin A, Martin F, et al. 2014. Proteomics for systems toxicology. Computational and Structural Biotechnology Journal, 11: 73–90.
  • Vlaanderen J, Moore LE, Smith MT, et al. 2010. Application of Omics Technologies in Occupational and Environmental Health Research; Current Status and Projections. Occup Environ Med., 67(2): 136–143.
  • Yılmaz B, Yılmaz F. 2018. Lab-on-a-Chip Technology and Its Applications. In: Omics Technologies and Bio-engineering: Towards Improving Quality of Life, pp. 145, Elsevier Inc.