Η διαδικασία παραγωγής βιοαερίου έχει ήδη περιγράφει στο τμήμα βασικού επιπέδου. Συνοψίζοντας όσα περιεγράφηκαν ήδη, στις αναπτυσσόμενες χώρες υπήρξε αυξημένο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη τεχνολογιών για την παραγωγή ανανεώσιμων πηγών ενέργειας.

Κύρια βήματα προς τη σύγχρονη ΒΙΟΠΛΑΣΤΙΚΗ

• Τα βιοπλαστικά δεν είναι μια πραγματική καινοτομία: οι φυσικές ρητίνες χρησιμοποιούνταν από την αρχαιότητα (για παράδειγμα κεχριμπάρι, shellac κλπ.)
• Ing Από το 1860, απελευθερώθηκαν τα πρώτα πλαστικά που προέρχονταν από κυτταρίνη (π.χ. κυτταρίνη, σελοφάν)
• Τη δεκαετία του 1940, ο Henry Ford έφτιαξε ανταλλακτικά αυτοκινήτων με πλαστικά που προέρχονταν από σόγια
• Τη δεκαετία του ’50 τα πλαστικά που προέρχονταν από την επάλειψη λαδιού
• Πετρελαϊκή κρίση στη δεκαετία του ’70: το ενδιαφέρον για βιοπλαστικά ανακαλύφθηκε ξανά.
• Επί του παρόντος υπάρχει αύξηση της ζήτησης για βιοπλαστικά, κυρίως λόγω των πιεστικών περιβαλλοντικών προβλημάτων (εξάντληση πόρων, φαινόμενο θερμοκηπίου, διάθεση απορριμμάτων κ.λπ.). Οι Εικόνες 5, 6 και 7 δίνουν μερικές βασικές πληροφορίες για τα βιοπλαστικά.

Εικόνα 5. Βιοπλαστικά και Ευρωπαϊκές οδηγίες

Το πλαστικό και το καουτσούκ είναι πολυμερή υλικά που αποτελούνται από μονομερή. Αυτά παράγονται κυρίως από πετρέλαιο και επομένως το υλικό προέλευσης δεν είναι ανανεώσιμο. Περίπου το 4% της παγκόσμιας κατανάλωσης πετρελαίου χρησιμοποιείται ως πρώτη ύλη στην παραγωγή πλαστικών και παρόμοια ποσότητα χρησιμοποιείται ως ενέργεια στη διαδικασία παραγωγής. Εκτός από το πετρέλαιο, η παραγωγή πλαστικού απαιτεί τη χρήση χημικών πρόσθετων όπως πλαστικοποιητές, επιβραδυντικά φλόγας, σταθεροποιητές θερμότητας και υπεριώδους ακτινοβολίας, βιοκτόνα, χρωστικές και επεκτάσεις. Διάφορα πρόσθετα ταξινομούνται ως επικίνδυνα σύμφωνα με τους κανονισμούς της ΕΕ (καρκινογόνα, μεταλλαξιογόνα, επιβλαβή για την αναπαραγωγική υγεία ή για τους υδρόβιους οργανισμούς ή με συνεχείς αρνητικές επιπτώσεις στο περιβάλλον).

Στη δεκαετία του ’60 το πλαστικό θεωρήθηκε για πρώτη φορά ως ανησυχία για τη ρύπανση της θάλασσας και των ωκεανών και άρχισαν να περιγράφονται οι αρνητικές επιπτώσεις στην υγεία για τον άνθρωπο και το περιβάλλον. Πράγματι, τα πλαστικά απελευθερώνουν τοξικές χημικές ουσίες καθ ‘όλη τη διάρκεια ζωής του προϊόντος.

Η ανακύκλωση πλαστικών εμφανίστηκε ως πιθανή λύση. Η ανακύκλωση, ωστόσο, δεν είναι η μόνη λύση που απαιτείται για την επίλυση κρίσεων πλαστικών αποβλήτων που μολύνουν το περιβάλλον. Το πλαστικό μπορεί να κυμαίνεται από μη ανακυκλώσιμο, ανακυκλώσιμο μόνο μία ή δύο φορές, ή σε καθορισμένο αριθμό φορές αλλά όχι για πάντα. Μετά από αυτό το όριο, το πλαστικό θα καταλήξει σε χωματερή. Επιπλέον, πολλοί καταναλωτές πλαστικών δεν επιτρέπουν καν στο πλαστικό τους να έχει τόσο μεγάλη διάρκεια ζωής. Τα ανανεώσιμα πλαστικά, δηλαδή τα πλαστικά που προέρχονται από ανανεώσιμες πηγές και είναι εύκολα βιοδιασπώμενα στο περιβάλλον, μπορεί να προσφέρουν λύση στο πρόβλημα της βιοπλαστικής δηλητηρίασης.

Εικόνα 6. Βιολογικά και βιοδιασπώμενα

Εικόνα 7. Παράγονται κύρια βιοπλαστικά παγκοσμίως

Η βιολογική βάση ορίζεται στο ευρωπαϊκό πρότυπο EN 16575 ως “προέρχεται από βιομάζα”. Τα βιοδιασπώμενα υλικά είναι υλικά που μπορούν να διασπαστούν από μικροοργανισμούς όπως βακτήρια ή μύκητες σε νερό, διοξείδιο του άνθρακα ή μεθάνιο και βιομάζα. Ωστόσο, η βιοδιασπασιμότητα εξαρτάται από τις περιβαλλοντικές συνθήκες: παρουσία μικροοργανισμών, θερμοκρασία και διαθεσιμότητα οξυγόνου και νερού. Τα λιπασματοποιήσιμα υλικά είναι υλικά που διασπώνται σε συνθήκες κομποστοποίησης. Οι συνθήκες βιομηχανικής κομποστοποίησης απαιτούν αυξημένη θερμοκρασία (55˚C – 60˚C) σε συνδυασμό με υψηλή σχετική υγρασία και παρουσία οξυγόνου, και είναι στην πραγματικότητα βέλτιστες σε σύγκριση με άλλες συνθήκες υποβάθμισης, όπως στο έδαφος, στα επιφανειακά και τα θαλάσσια ύδατα. Η συμμόρφωση με το πρότυπο EN 13432 θεωρείται ένα καλό μέτρο για την κομποστοποίηση των υλικών συσκευασίας. Σύμφωνα με αυτό το πρότυπο, η πλαστική συσκευασία μπορεί να ονομαστεί λιπασματοποιήσιμη. Κάποιες λεπτομέρειες για τις 3 κύριες κατηγορίες βιοπλαστικών δίνονται παρακάτω.

Πλαστικά με βάση το άμυλο

Το 75% όλων των οργανικών υλικών στη γη υπάρχει με τη μορφή πολυσακχαριτών. Ένας σημαντικός πολυσακχαρίτης είναι το άμυλο. Τα φυτά συνθέτουν και αποθηκεύουν άμυλο στη δομή τους ως ενεργειακό απόθεμα. Το άμυλο βρίσκεται σε σπόρους, κόνδυλους ή ρίζες των φυτών. Πηγές αμύλου είναι το καλαμπόκι, το σιτάρι, το ρύζι, η πατάτα, η ταπιόκα, ο μπιζέλι και πολλοί άλλοι φυτικοί πόροι. Το μεγαλύτερο μέρος του άμυλου που παράγεται παγκοσμίως προέρχεται από το καλαμπόκι. Το άμυλο εξάγεται γενικά από τον φυτικό πόρο με υγρές διαδικασίες άλεσης. Το άμυλο αποτελείται από δύο τύπους πολυμερών γλυκόζης: την αμυλόζη και την αμυλοπηκτίνη. Η αμυλόζη είναι ουσιαστικά ένα γραμμικό πολυμερές στο οποίο οι μονάδες γλυκόζης συνδέονται κυρίως μέσω α-D- (l, 4) γλυκοσιδικών δεσμών. Η αμυλοπηκτίνη είναι ένα διακλαδισμένο πολυμερές, που περιέχει περιοδικούς κλάδους που συνδέονται με τους σκελετούς μέσω α-D- (l, 6) γλυκοσιδικών δεσμών. Η περιεκτικότητα σε άμυλοζη και αμυλοπηκτίνη στο άμυλο ποικίλλει και εξαρτάται από την πηγή άμυλου.

Εικόνα 8. Τεχνολογία με βάση το άμυλο της Novamont

An important class of plastics is represented by starch‐based plastics. Από τις αρχές της δεκαετίας του 1990, οι ερευνητικές και τεχνολογικές εξελίξεις επέτρεψαν τη σύνθεση πολύπλοκων φυσικών πολυμερών όπως το άμυλο (από καλαμπόκι, πατάτα κ.λπ.) με βιοδιασπώμενα μακρομόρια (πολυμερείς παράγοντες σύμπλεξης) προκειμένου να ληφθούν θερμοπλαστικά και βιοδιασπώμενα καινοτόμα υλικά σε βιομηχανική κλίμακα. Συγκεκριμένα, η τεχνολογία με βάση το άμυλο του Novamont (Εικ. 8) χρησιμοποιεί συνθήκες επεξεργασίας ικανές να καταστρέψουν σχεδόν πλήρως την κρυσταλλικότητα της αμυλόζης και της αμυλοπηκτίνης, παρουσία μακρομορίων, τα οποία είναι ικανά να σχηματίσουν ένα σύμπλοκο με αμυλόζη. Μπορούν να είναι φυσικής ή συνθετικής προέλευσης και είναι βιοδιασπώμενα. Το σύμπλοκο που σχηματίζεται από αμυλόζη με τον παράγοντα συμπλοκοποίησης είναι γενικά κρυσταλλικό και χαρακτηρίζεται από μία μόνο έλικα αμυλόζης που σχηματίζεται γύρω από τον παράγοντα συμπλοκοποίησης. Σε αντίθεση με την αμυλόζη, η αμυλοπηκτίνη δεν αλληλεπιδρά με τον παράγοντα συμπλοκοποίησης και παραμένει στην άμορφη κατάσταση. Η πηγή του αμύλου, δηλαδή η αναλογία του μεταξύ αμυλόζης και αμυλοπηκτίνης, οι συνθήκες επεξεργασίας και η φύση των παραγόντων συμπλοκοποίησης επιτρέπουν τη μηχανική διαφόρων υπερμοριακών δομών με πολύ διαφορετικές ιδιότητες. Τα τελευταία χρόνια έχουν γίνει πολλές επιτυχημένες προσπάθειες για να αυξηθεί η ποσότητα των ανανεώσιμων πρώτων υλών για την παραγωγή βιοδιασπώμενων πολυεστέρων. Το Novamont είναι επομένως ένας από τους σημαντικότερους παίκτες στα βιοπλαστικά με βάση το άμυλο. Η εταιρεία εργάζεται επί του παρόντος στην ανάπτυξη ενός έργου βιοκαθαρισμού που αποτελείται από ένα καινοτόμο μοντέλο ανάπτυξης ικανό να συνθέτει διάφορα χημικά ενδιάμεσα προϊόντα χρησιμοποιώντας ανανεώσιμες πρώτες ύλες που καλλιεργούνται με χαμηλή εισροή και σε οριακές περιοχές αντί για ορυκτές πρώτες ύλες.

Πλαστικά πολυγαλακτικού οξέος

Συνθετικές βιοαποικοδομήσιμες πολυ-λακτόνες όπως πολυ-γαλακτικό οξύ (PLA), πολυ-γλυκολικό οξύ (PGA) και πολυ-καπρολακτόνη (PCL) είναι πολυμερή που διασπώνται με απλή υδρόλυση των εστερικών δεσμών. Τα υδρολυτικά προϊόντα από μια τέτοια διαδικασία αποικοδόμησης στη συνέχεια μετατρέπονται σε μη τοξικά υποπροϊόντα (Εικ. 9).

Εικόνα  9. Κύκλος ζωής PLA

Τα πλαστικά PLA προέρχονται από τη ζύμωση γεωργικών υποπροϊόντων όπως ουσίες πλούσιες σε άμυλο όπως ο αραβόσιτος, το σιτάρι ή η ζάχαρη και το άμυλο καλαμποκιού. Η διαδικασία περιλαμβάνει μετατροπή καλαμποκιού ή άλλων πηγών υδατανθράκων σε γλυκόζη ακολουθούμενη από ζύμωση σε γαλακτικό οξύ (Εικ. 9 και 10).

Εικόνα 10. Παραγωγή PLA από άμυλο

Το PLA που προέρχεται από γαλακτικό οξύ είναι θερμοπλαστικό, βιοδιασπώμενο αλειφατικό πολυεστέρα με άφθονο δυναμικό για εφαρμογές συσκευασίας. Τα μονομερή γαλακτικού οξέος είτε είναι άμεσα πολυσυμπυκνωμένα είτε υφίστανται πολυμερισμό λακτιδίου με άνοιγμα δακτυλίου με αποτέλεσμα τον σχηματισμό σφαιριδίων PLA. Οι ιδιότητες του PLA ως υλικού συσκευασίας εξαρτώνται από την αναλογία μεταξύ των δύο οπτικών ισομερών του μονομερούς γαλακτικού οξέος. Όταν χρησιμοποιούνται 100% L-PLA μονομερή έχει ως αποτέλεσμα πολύ υψηλή κρυσταλλικότητα και σημείο τήξης, ενώ 90/10% D/L συμπολυμερή πληροί τις απαιτήσεις της μαζικής συσκευασίας. Το PLA είναι το πρώτο πολυμερές που βασίζεται στο εμπόριο σε μεγάλη κλίμακα και μπορεί να διαμορφωθεί σε αντικείμενα, μεμβράνες και επικαλύψεις. Το PLA αντικατέστησε το πολυαιθυλένιο υψηλής πυκνότητας, το πολυαιθυλένιο χαμηλής πυκνότητας (LDPE), το τερεφθαλικό πολυαιθυλένιο και το PS ως υλικό συσκευασίας.

Οι κύριες ιδιότητες του PLA είναι: i) η μηχανική αντίσταση και η θερμική ευαισθησία είναι παρόμοια με τα παραδοσιακά πλαστικά. ii) η σκληρότητα, η ακαμψία και ο βαθμός ελαστικότητας είναι παρόμοια με το PET, iii) μπορεί να περιέχει λίπη, έλαια, αλκοόλ και αλειφατικά μόρια, iv) η σπάνια αντίσταση σε οξέα και βάσεις είναι καλή αντίσταση στην υπεριώδη ακτινοβολία, v) μπορεί να εκτυπωθεί και βαμμένο, vi) μπορεί να μετατραπεί σε αγαθά μέσω τυποποιημένων μηχανών που χρησιμοποιούνται για παραδοσιακά πλαστικά, vii) η φάση μετά τη χρήση μπορεί να περιλαμβάνει κομποστοποίηση σε βιομηχανικές εγκαταστάσεις.

The main properties of PLA are: i) the mechanical resistance and heat sensitivity are similar to traditional plastics; ii) hardness, stiffness and degree of elasticity are similar to PET, iii) it can contain fats, oils, alcohol and aliphatic molecules, iv) scarce resistance to acids and bases is but good resistance to UV radiation, v) it can be printed and dyed, vi) it can be transformed into goods through standard machines used for traditional plastics, vii) the post-use phase may involve composting in industrial plants.

Πολυϋδροξυαλκανοϊκά

Οι πολυϋδροξυαλκανότες (PHA) είναι βιοδιασπώμενα πολυμερή που συσσωρεύονται από ορισμένα βακτήρια ως ένωση αποθήκευσης σε μορφή ενδοκυτταρικών κόκκων. Το PHA είναι ένα από τα βιοπολυμερή που μπορεί να αντικαταστήσει αποτελεσματικά τα συμβατικά πετροχημικά πλαστικά με τις ιδιότητες υλικών που τα συγκρίνουν. Ακόμα και τότε, η παραγωγή τους σε μεγάλη κλίμακα εξακολουθεί να περιορίζεται από το υψηλό κόστος παραγωγής σε σύγκριση με τα συμβατικά πλαστικά με βάση τα ορυκτά καύσιμα, καθώς η τιμή του PHA, ανάλογα με τη σύνθεση του πολυμερούς, κυμαίνεται από 2,2 έως 5,0 €/κιλό που είναι τουλάχιστον τρεις φορές υψηλότερη από τα κύρια πολυμερή με βάση το πετροχημικό που κοστίζουν λιγότερο από 1,0 €/κιλό (υπολογισμοί έγιναν το 2016).
Στην πλειονότητα των εταιρειών που παράγουν PHA, χρησιμοποιούνται κυρίως αγνές καλλιέργειες. Το πρόβλημα με τη χρήση καθαρών καλλιεργειών είναι οι προϋποθέσεις για τη στειρότητα, τα εκλεπτυσμένα υποστρώματα εάν δεν χρησιμοποιούνται πρώτες ύλες φυτικής προέλευσης, περιορίζοντας έτσι τη διαδικασία εμπορευματοποίησης. Όλα αυτά τα ζητήματα θα ξεπεραστούν με τη χρήση Μικτών Μικροβιακών Καλλιεργειών (MMCs): αυτό συνδυάζει τη μετατροπή των αποβλήτων σε παραγωγή προϊόντος προστιθέμενης αξίας. Η βιολογική επεξεργασία των λυμάτων και η διαχείριση της ιλύος για την ανάκτηση άνθρακα από τα λύματα, καθώς οι PHA είναι μια διαδρομή για τη μετατροπή της υποδομής προστασίας του περιβάλλοντος στο τέλος του αγωγού σε βιο-διυλιστήρια. Στρατηγικές ενσωμάτωσης για την παραγωγή MMC PHA στο πλαίσιο των διαδικασιών επεξεργασίας λυμάτων έχουν προταθεί για βιομηχανική επεξεργασία λυμάτων και αστικών λυμάτων.
Ένα από τα καλύτερα χαρακτηριζόμενα μέλη της οικογένειας PHA είναι το πολυϋδροξυβουτυρικό (PHB), που παράγεται από μικροοργανισμούς που το αποθηκεύουν μέσα στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου. Το 1926, ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά μια μικροβιακή παραγωγή γραμμικού πολυεστέρα D (-)-3-υδροξυβουτυρικού οξέος ως ενδοκυτταρικών κόκκων, η οποία εμφανίστηκε σε gram-θετικά και gram-αρνητικά βακτήρια υπό συνθήκες πείνας (Εικ. 11).

Εικόνα 11. Πολυϋδροξυβουτυρικό

Το κόστος είναι το σημαντικότερο μειονέκτημα της παραγωγής PHB κατά τη διάρκεια της εκβιομηχάνισης. Η βιομηχανική παραγωγή PHB είναι δαπανηρή από εκείνη των πετροπλαστικών. Μεγάλες ποσότητες παραγωγής PHB εκτιμάται σε περίπου 4,4 δολάρια ΗΠΑ/κιλό, δηλαδή πολύ ακριβότερα από το κόστος παραγωγής πολυπροπυλενίου, το οποίο είναι κοντά στο 1 δολάριο/κιλό. Οι οικονομικές δυσκολίες αναμφίβολα σχετίζονται με το κόστος παραγωγής, τόσο σε ανάντη όσο και σε μεταγενέστερες διαδικασίες. Περίπου, το 40% και το 50% του συνολικού κόστους παραγωγής του PHB έχουν ανατεθεί σε ακατέργαστα υλικά και συστήματα διαχωρισμού/καθαρισμού, αντίστοιχα. Στις τεχνικές βιοαφαίρεσης, η γενετική μηχανική είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη για την εισαγωγή μικροοργανισμών και είναι σε θέση να εξαγάγουν αποτελεσματικά PHB από κύτταρα που συσσωρεύουν PHB. Υπάρχουν αρκετές προσεγγίσεις που έχουν ερευνηθεί, συμπεριλαμβανομένου του συστήματος λύσης που μεσολαβεί από βακτηριοφάγους και αρπακτικά βακτήρια, τα οποία είναι καλύτερα από τις συμβατικές προσεγγίσεις εξαγωγής που παράγουν περιβαλλοντικά επιβλαβείς διαλύτες, με υψηλότερο κόστος αποικοδόμησης. Έτσι, λόγω των μη περιβαλλοντικών και μη οικονομικών ιδιοτήτων των συμβατικών μεθόδων εκχύλισης, δίνεται μεγαλύτερη προσοχή στα συστήματα βιοεξόρυξης.

Αυτή η μονάδα εστιάζεται βασικά στις τεχνολογίες που επιτρέπουν τη μελέτη του μικροβίου σε εδάφη ή πολύπλοκες μήτρες. Οι κύριες τεχνολογίες απεικονίζονται παρακάτω (Εικόνα 12).

Εικόνα 12: Τεχνικές μελέτης της πολυπλοκότητας του μικροβιώματος

Η πολιτισμική προσέγγιση περιγράφεται καλά στο βίντεο που έχει δημιουργηθεί στο Digit-Biotech. Αυτή η “κλασική μέθοδος”, προβλέπει την ταυτοποίηση μικροοργανισμών μέσω της απομόνωσης καθαρών καλλιεργειών, ακολουθούμενη από δοκιμές που αναλύουν ορισμένα μορφο-φυσιολογικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά. Αυτές οι αναλύσεις συχνά δεν επαρκούν για τον εντοπισμό των περισσότερων ειδών μικροοργανισμών και επιπλέον περιορίζονται σε καλλιεργήσιμα είδη που αντιπροσωπεύουν ένα πολύ μικρό ποσοστό όλων των ειδών που βρίσκονται στη φύση. Αυτές οι δοκιμές έχουν επίσης τον σοβαρό περιορισμό να απαιτούν σημαντικό χρόνο. Ωστόσο, έχουν το μεγάλο πλεονέκτημα της απόκτησης μέσω της προσέγγισης απομόνωσης μικροοργανισμών -στόχων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην προσέγγιση βιοεξυγίανσης.

Τις τελευταίες δεκαετίες, έρευνες στον τομέα της μικροβιολογικής περιβαλλοντικής έδειξαν ότι οι μικροβιακές κοινότητες παίζουν έναν λειτουργικό ρόλο ελέγχου των οικοσυστημάτων που δεν αποδίδεται σε μεμονωμένα είδη αλλά στις ίδιες τις κοινότητες ως “λειτουργικές μονάδες”. Αυτή η λειτουργική δραστηριότητα των μικροβιακών κοινοτήτων είναι, σε πολλές περιπτώσεις, υπεύθυνη για σημαντικές διαδικασίες για τον άνθρωπο, συμπεριλαμβανομένης της βιοαποδόμησης των αρχικών αποβλήτων σε εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυμάτων και χώρους υγειονομικής ταφής, κομποστοποίηση και, γενικά, όλες τις διαδικασίες στις οποίες χημικοί μετασχηματισμοί των ουσιών που παράγονται από πραγματοποιούνται οι δραστηριότητες. Ηλεκτροφόρηση γέλης μετουσίωσης (DGGE), PCR σε πραγματικό χρόνο (ή ποσοτική PCR) και η προσέγγιση ολόκληρου του γονιδιώματος (αλληλουχία υψηλής απόδοσης και αλληλουχία κυνηγετικών όπλων) είναι οι κύριες τεχνολογίες που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη μικροβιακών πληθυσμών στο περιβάλλον.

DGGE: είναι μια ηλεκτροφορητική τεχνική διαχωρισμού που χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό και την ανάλυση θραυσμάτων DNA που διαφέρουν στην νουκλεοτιδική αλληλουχία επίσης ενός μόνο ζεύγους βάσεων. Στην κλασική ηλεκτροφόρηση που πραγματοποιήθηκε σε πηκτή αγαρόζης ή ακρυλαμιδίου, τα θραύσματα DNA διαχωρίζονται με βάση το μοριακό βάρος. η ταχύτητα λειτουργίας μειώνεται παράλληλα με την αύξηση του μήκους του θραύσματος. Αντίθετα, στο DGGE, θραύσματα DNA ίσου μοριακού βάρους διαχωρίζονται σύμφωνα με το πρότυπο μετουσίωσης. Η παρουσία θερμότητας ή χημικών μετουσιωτικών επιτρέπει τη μετουσίωση των δύο συστατικών νημάτων ενός μορίου δίκλωνου DNA (dsDNA). Η θερμοκρασία και η συγκέντρωση του μετουσιωτικού στο οποίο συμβαίνει ο διαχωρισμός των δύο νημάτων εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την αλληλουχία του ίδιου του θραύσματος. Συγκεκριμένα, οι καθοριστικοί παράγοντες είναι: η ποσότητα δεσμών υδρογόνου που δημιουργούνται μεταξύ συμπληρωματικών βάσεων και ο τύπος αλληλεπιδράσεων που δημιουργούνται μεταξύ βάσεων που γειτνιάζουν στον ίδιο κλώνο (αλληλεπίδραση στοίβαξης). Επομένως, ένα μόριο DNA έχει περιοχές με χαρακτηριστικές θερμοκρασίες τήξης ή Tm, που καθορίζονται από την αλληλουχία νουκλεοτιδίων. Τα θραύσματα DNA σχεδόν πανομοιότυπα σε μοριακό βάρος, αλλά ότι διαφέρουν επίσης σε ένα μόνο νουκλεοτίδιο, μπορούν να χαρακτηριστούν με Tm και τομείς τήξης διαφορετικούς μεταξύ τους. Η ανάλυση DGGE διεξάγεται σε γέλη πολυακρυλαμιδίου που περιέχει βαθμίδα μετουσίωσης με τέτοιο τρόπο ώστε το dsDNA να υπόκειται, κατά τη διάρκεια της πορείας, σε αύξηση των συνθηκών μετουσίωσης με επακόλουθο διαχωρισμό στους τομείς τήξης. Στο άνω μέρος της γέλης, όπου υπάρχουν ήπιες συνθήκες μετουσίωσης, οι τομείς τήξης στο χαμηλότερο Tm αρχίζουν να μετουσιώνονται μερικώς, δημιουργώντας διακλαδισμένα μόρια με λιγότερη κινητικότητα. Η αύξηση των συνθηκών μετουσίωσης κατά μήκος της γέλης πολυακρυλαμιδίου μπορεί να καθορίσει τη συνολική διάσταση μερικώς μετουσιωμένων θραυσμάτων σε μονόκλωνο DNA (ssDNA). Πειραματικά, η πλήρης διάσπαση των δύο κλώνων dsDNA εμποδίζεται με την εισαγωγή, στο τέλος κάθε νήματος, τομέων που χαρακτηρίζονται από υψηλή περιεκτικότητα σε G + C και υψηλή Tm. Οι περιοχές πλούσιες σε G + C δημιουργούνται τεχνητά στο ένα άκρο του dsDNA μέσω ενσωμάτωσης ενός σφιγκτήρα GC κατά τη διάρκεια αντιδράσεων ενίσχυσης. Η ενσωμάτωση του σφιγκτήρα GC καθίσταται δυνατή με τη χρήση εκκινητών που χαρακτηρίζονται από μια ακολουθία περίπου 30-40 GC στο άκρο 5 ‘. Η παρουσία του σφιγκτήρα GC της ίδιας αλληλουχίας στο άκρο κάθε μορίου προκαλεί τις διαφορές μεταξύ των προφίλ διαδρομής των αναλυθέντων θραυσμάτων να καθορίζονται κυρίως από παραλλαγές στην ακολουθία περιοχών χαμηλής τήξης. Δεδομένου ότι το Tm καθορίζεται από την αλληλουχία νουκλεοτιδίων, η παρουσία μιας μεμονωμένης μετάλλαξης είναι ικανή να δημιουργήσει διαφορετικό προφίλ μετουσίωσης και, κατά συνέπεια, διαφορετική ηλεκτροφορητική πορεία. Ως εκ τούτου, η επανεμφάνιση πολυμορφισμών σε πολύ διατηρημένα γονίδια μπορεί να αναλυθεί από το DGGE και μπορεί να παρέχει χρήσιμες πληροφορίες για τον χαρακτηρισμό της δομής των μικροβιακών κοινοτήτων. Στην πραγματικότητα, με την ηλεκτροφόρηση πηκτής διαβάθμισης αποκτάται ένα ηλεκτροφορητικό προφίλ που σχηματίζεται από μια σειρά ζωνών στις οποίες, ως πρώτη προσέγγιση, ο αριθμός των ζωνών είναι ανάλογος με τον αριθμό των παρόντων ειδών και η θέση κάθε ζώνης είναι διαφορετική για κάθε είδος Το Η τεχνική DGGE παρέχει επομένως μια απλή προσέγγιση για την απόκτηση μικροβιακά προφίλ κοινότητας που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον εντοπισμό χωρικών και χρονικών διαφορών στη δομή της κοινότητας ή για την παρακολούθηση των αλλαγών στη δομή που συμβαίνουν ως απόκριση σε περιβαλλοντικές διαταραχές.

PCR πραγματικού χρόνου: Είναι μια τεχνική που επιτρέπει την ενίσχυση και την ταυτόχρονη ποσοτικοποίηση μιας αλληλουχίας DNA -στόχου. Περιλαμβάνει τη χρήση φθορίζουσων χρωμάτων, όπως το Sybr Green που παρεμβάλλονται στο δευτερεύον μόριο του DNA διπλού κλώνου, ή ανιχνευτές με συγκεκριμένες αλληλουχίες, που αποτελούνται από ολιγονουκλεοτίδια επισημασμένα με παράγοντες φθορισμού. Ο εκπεμπόμενος φθορισμός μετράται συνεχώς και παρέχει πληροφορίες «σε πραγματικό χρόνο» για την ποσότητα του αμπλικονίου που παράγεται. Από μια αντίδραση ενίσχυσης λαμβάνεται ένα γράφημα με σιγμοειδή καμπύλη. Αυτό θα ξεκινήσει το συντομότερο δυνατό όσο μεγαλύτερη είναι η ποσότητα του DNA εκκίνησης και θα συνεχίσει να αυξάνεται με εκθετική τάση μέχρι να φτάσει σε μια μέγιστη τιμή (οροπέδιο), στην οποία η αντίδραση θα επιβραδυνθεί λόγω εξάντλησης των υποστρωμάτων.

Κατά τη μελέτη ενός γραφήματος PCR πραγματικού χρόνου, καθορίζονται τρεις παράμετροι:

– βάση φθορισμού ή περιοχή βάσης,

– η γραμμή κατωφλίου, παράλληλη με τη γραμμή βάσης,

– ο κύκλος κατωφλίου ή CT, συγκεκριμένος για κάθε δείγμα, προσδιορίζει την τιμή του κύκλου PCR στον οποίο η καμπύλη εκθετικής φάσης τέμνει τη γραμμή κατωφλίου.

Τα περισσότερα όργανα PCR σε πραγματικό χρόνο είναι προγραμματισμένα να διαβάζουν τα μήκη κύματος του φάσματος εκπομπών και διέγερσης SYBR Green (αντίστοιχα 495nm και 537nm). Αυτή η βαφή είναι πολύ ευαίσθητη στο φως, συνδέεται μόνο με δίκλωνο DNA και επομένως μόνο με το πρόσφατα συνθεμένο αμπλικόνιο. Τα δείγματα ποσοτικοποιούνται με βάση τις καμπύλες βαθμονόμησης που λαμβάνονται με τη χρήση γνωστών ποσοτήτων 16 αντιγράφων γονιδίου S rDNA. Η σύγκριση μεταξύ του σήματος που εκπέμπεται από το άγνωστο δείγμα με τις τιμές φθορισμού που χρησιμοποιούνται για την κατασκευή της καμπύλης βαθμονόμησης επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό ενός συγκεκριμένου μικροβιακού είδους. Εκτός από την ποσοτική μέτρηση των βακτηρίων στόχων, οι παρεμβολείς όπως το SYBR Green επιτρέπουν τη διάκριση αμπλικόνων διαφορετικού μήκους και τον εντοπισμό μη ειδικών ενισχύσεων που μπορεί να υπάρχουν.

Αλληλουχία επόμενης γενιάς: Η ιδιαιτερότητα αυτής της τεχνολογίας που εισήχθη το 2006 δεν έγκειται μόνο στην ικανότητα αλληλουχίας ενός μεμονωμένου θραύσματος DNA κάθε φορά, επέκταση αυτής της διαδικασίας σε εκατομμύρια θραύσματα ταυτόχρονα, αλλά και στην ικανότητα ανάλυσης θραυσμάτων DNA σε και τις δύο κατευθύνσεις.

Το πρώτο βήμα περιλαμβάνει μονοκλωνικά θραύσματα DNA, στα άκρα των οποίων μονοφωνικές αλληλουχίες, που ονομάζονται “δείκτης”, φορτώνονται σε μια ροή κυττάρων όπου συλλαμβάνονται σε μια επιφάνεια που περιέχει “ολιγονουκλεοτίδια ακόμα” συμπληρωματικά των δεικτών, πάνω στα οποία ακινητοποιούνται για την προετοιμασία των βιβλιοθηκών. Ο υβριδισμός μεταξύ του τελευταίου και των θραυσμάτων DNA γίνεται μέσω διαδικασιών θέρμανσης και ψύξης, που ακολουθείται από επώαση με ειδικά αντιδραστήρια και ισοθερμική πολυμεράση. Μέσω μιας «γεφυρωμένης» ενίσχυσης κάθε θραύσμα ενισχύεται ξεχωριστά από τα άλλα, δημιουργώντας ένα σύμπλεγμα κλώνων. Όταν ολοκληρωθεί η δημιουργία συμπλέγματος, τα παραγόμενα μοντέλα, μετά από κατάλληλη μετουσίωση, είναι έτοιμα για πραγματική αλληλουχία.

Το Illumina χρησιμοποιεί τεχνολογία βασισμένη στην αλυσίδα που τερματίζει τα φθορίζοντα νουκλεοτίδια με ΟΗ στα 3 ‘. Αυτό διασφαλίζει ότι ενσωματώνεται μία μόνο βάση ανά κύκλο. Ακολουθεί ένα βήμα απεικόνισης για τον προσδιορισμό του νουκλεοτιδίου που ενσωματώνεται σε κάθε ομάδα και ένα χημικό στάδιο για την απομάκρυνση της φθορίζουσας ομάδας και του τελικού ΟΗ για να επιτρέψει την ενσωμάτωση μιας άλλης βάσης στον επόμενο κύκλο.

Στο τέλος της αλληλουχίας, η οποία διαρκεί περίπου 4 ημέρες, η ακολουθία κάθε συμπλέγματος υποβάλλεται σε διαδικασίες επιλογής (περικοπή) για την εξάλειψη των προϊόντων χαμηλής ποιότητας. Κατά τη διάρκεια της ανάλυσης δεδομένων τα θραύσματα διαφόρων μηκών ευθυγραμμίζονται και αλληλοεπικαλύπτονται, με αυτόν τον τρόπο είναι δυνατό να προσδιοριστεί η ακολουθία του νημάτιου εκκίνησης. Σε μια τυπική διαδικασία, αναλύονται τουλάχιστον 40-50 εκατομμύρια αλληλουχίες.

Η αλληλουχία κυνηγετικών όπλων είναι η αλληλουχία όλων των γονιδιωμάτων που υπάρχουν σε μια σύνθετη μήτρα, όπως ένα δείγμα εδάφους. Η αλληλουχία κυνηγετικών όπλων είναι επομένως ο πιο αποτελεσματικός τρόπος για να προσδιοριστεί η αλληλουχία ενός μεγάλου κομματιού DNA. Για αυτό, το αρχικό DNA διασπάται τυχαία σε πολλά μικρότερα κομμάτια, κάπως με κυνηγετικό όπλο, με κάθε ένα από αυτά τα κομμάτια να ακολουθείται ξεχωριστά. Οι προκύπτουσες αναγνώσεις ακολουθίας που δημιουργούνται από τα διαφορετικά κομμάτια αναλύονται στη συνέχεια από ένα πρόγραμμα υπολογιστή, αναζητώντας τμήματα αλληλουχίας από διαφορετικές αναγνώσεις που είναι πανομοιότυπες μεταξύ τους. Όταν εντοπίζονται πανομοιότυπες περιοχές, αλληλοεπικαλύπτονται μεταξύ τους, επιτρέποντας τη συρραφή των δύο διαδοχικών σειρών μεταξύ τους. Αυτή η διαδικασία του υπολογιστή επαναλαμβάνεται ξανά και ξανά, αποδίδοντας τελικά την πλήρη αλληλουχία του αρχικού τεμαχίου του DNA. Ο αρχικός τυχαίος κατακερματισμός και ανάγνωση του DNA έδωσε σε αυτήν την προσέγγιση το όνομα “αλληλουχία κυνηγετικών όπλων”.

Πολλές βιοτικές και αβιοτικές καταπονήσεις, όπως η μαζική χρήση φυτοφαρμάκων στη γεωργία και η κλιματική αλλαγή, θέτουν σε κίνδυνο την επιβίωση των επικονιαστικών εντόμων, με δυνητικά επιβλαβείς συνέπειες τόσο στα αγροοικοσυστήματα όσο και στα φυσικά συστήματα. Στην πραγματικότητα, οι μέλισσες είναι υπεύθυνες για την επικονίαση του 84% των καλλιεργούμενων φυτικών ειδών, από τα οποία το 35% έχουν παγκόσμια σημασία και το 78% των άγριων. Αρκεί να πούμε ότι μόνο το 70% των σπόρων προς σπορά (όπως καρότα, κρεμμύδια, σκόρδο κ.λπ.) εξαρτώνται αυστηρά από την επικονίαση εντόμων, καθώς και το 80% των 264 ειδών καλλιέργειας που ενδιαφέρουν την Ευρώπη. Από αυτό, προκύπτει ότι η δραστηριότητα των επικονιαστικών εντόμων, συμπεριλαμβανομένων των μελισσών, παίζει ουσιαστικό ρόλο σε οικονομικό επίπεδο, της οποίας η νομισματική εκτίμηση είναι περίπου 15 δισεκατομμύρια ευρώ / έτος μόνο στην Ευρώπη, ενώ παγκοσμίως η εκτίμηση αυξάνεται σε 153 δισεκατομμύρια ευρώ / έτος.

Εκτός από μια ανυπολόγιστη αξία για τη διατήρηση της βιοποικιλότητας και τις ισορροπίες που υπάρχουν στα διάφορα οικοσυστήματα, οι μέλισσες προμηθεύουν μέλι, κερί μέλισσας, πρόπολη, γύρη και βασιλικό πολτό: στην Ευρώπη, τα δεδομένα που συλλέχθηκαν το 2010 έδειξαν παραγωγή περίπου 220 000 τόνων μέλι με τιμές που κυμαίνονται από 1,50 έως 40 €/κιλό ανάλογα με την περιοχή προέλευσης. Or, στην Αυστραλία η παραγωγή μελιού και κεριού κυμαίνεται ετησίως γύρω από μια εμπορική αξία 90 εκατομμυρίων δολαρίων, υπογραμμίζοντας και πάλι τη σημασία που παίζει ο μελισσοκομικός τομέας στο πανόραμα. παγκόσμια οικονομία. Οι αποικίες των μελισσών μειώθηκαν γρήγορα από 6 εκατομμύρια τη δεκαετία του 1940 σε περίπου 2,6 εκατομμύρια σήμερα. Η μεγάλη ετήσια απώλεια αποικίας μελισσών εξακολουθεί να παρατηρείται και έχει γίνει ο κανόνας για τους μελισσοκόμους. Η υγεία του εντέρου παίζει σημαντικό ρόλο στην έμφυτη ανοσοαπόκριση του ξενιστή και την προσαρμοστικότητα στο πλήθος των στρεσογόνων παραγόντων που αντιμετωπίζουν οι μέλισσες σήμερα.

Οι γόνοι που επηρεάστηκαν από “Διαταραχή Κατάρρευσης Αποικίας” (CCD) ή “Σύνδρομο Αποπληθυσμού Κυψέλης” έδειξαν επίσης σημαντικά σημάδια ανισορροπίας. Οι αιτίες αυτού του συνδρόμου δεν είναι ακόμη σαφείς, αλλά πιστεύεται ότι μπορεί να αποδοθούν σε αλλαγές περιβαλλοντικών παραγόντων, υποσιτισμό, παρουσία παθογόνων μικροοργανισμών και μαζική χρήση εντομοκτόνων. Η συμπτωματολογία βλέπει την παρουσία γόνων που εγκαταλείπουν τις προνύμφες τους παρά την παρουσία της βασίλισσας και έλλειψη όρεξης για αποθέματα γύρης και νέκταρ που δεν καταναλώνονται αμέσως (Εικ. 13)

Εικόνα 13. Εσωτερική ματιά στο συνδρομο αποπληθυσμού κυψέλης

Μία από τις πιθανές αιτίες αυτής της εξάλειψης μπορεί να σχετίζεται με τη δυσβίωση των μικροβίων του εντέρου, όπως η μικροβιακή αλλοίωση ως προς την ποσότητα και τη σύνθεση. Με αυτόν τον όρο υποδεικνύουμε το φαινόμενο που επηρεάζει αρνητικά τις ευεργετικές λειτουργίες του μικροβίου και που σχετίζονται με συγκεκριμένες μεταβολικές ανισορροπίες. Στην πραγματικότητα, αυτές οι ελλείψεις θα μπορούσαν να δημιουργήσουν σοβαρά προβλήματα στην ανάπτυξη των νέων ενηλίκων επηρεάζοντας την ικανότητά τους να αναπτύσσουν γονίδια αντίστασης, συμπεριλαμβανομένων εκείνων για τη σύνθεση της βιτελογενίνης και αναστέλλοντας τις λειτουργίες του ανοσοποιητικού συστήματος, δεδομένων των στοιχείων που προάγουν την ίδια μικροβιακή την αποτελεσματικότητά του (Εικ. 14).

Fig. 14. Consequences of altered gut microbial compositions in bees

Πριν από λίγα χρόνια, προσπαθήσαμε να καταλάβουμε ποιοι παράγοντες είναι σε θέση να αποσταθεροποιήσουν τη μικροβιακή ζώνη, καταλήγοντας στο συμπέρασμα ότι η δυσβίωση προκαλείται τόσο από βιοτικούς όσο και από αβιοτικούς παράγοντες. Λαμβάνοντας υπόψη τις βιοτικές καταπονήσεις, έχει διαπιστωθεί ότι η διατροφή, η παρουσία συγκεκριμένων παθογόνων και διαταραχών (π.χ. CCD) και οι δυσμενείς περιβαλλοντικές συνθήκες παίζουν θεμελιώδη ρόλο. Η έλλειψη θρεπτικών συστατικών έχει καταστροφικές επιπτώσεις στη φυσιολογική ανάπτυξη της εντερικής μικροβιακής χλωρίδας, συνέπεια της οποίας είναι η αύξηση της θνησιμότητας των μελισσών, καθώς και η ευαισθησία σε ασθένειες και παθογόνους παράγοντες. Επιπλέον, οι ανώμαλες θερμοκρασίες προκαλούν μια κατάσταση στρες στους ξενιστές, όπως να έχουν δραματικές επιπτώσεις στα συμβόλια.

Λαμβάνοντας υπόψη τους αβιοτικούς στρεσογόνους παράγοντες, η ζημιά αποδίδεται σχεδόν εξ ολοκλήρου στη χρήση εντομοκτόνων, μυκητοκτόνων, ακαρεοκτόνων και αντιβιοτικών. Οι μέλισσες, μάλιστα, κατά τη διάρκεια των επιχειρήσεων αναζήτησης τροφίμων κινδυνεύουν να καταπιούν έμμεσα και να συναντήσουν τα ενεργά συστατικά, τόσο στις κύριες καλλιέργειες που υποβάλλονται σε επεξεργασία όσο και στις γειτονικές που υποβάλλονται σε παρασυρόμενα. Αυτό θα μπορούσε να προκαλέσει σοβαρά προβλήματα και ανισορροπίες στο μεταβολισμό και την ανοσολογική άμυνα: στην πραγματικότητα, υπάρχει η πιθανότητα η έκθεση σε ορισμένες ουσίες να παρεμποδίσει την ικανότητα των μελισσών να ρυθμίζουν τον μικροβιακό πληθυσμό του εντέρου τους.

Για τους λόγους αυτούς, μια από τις πιο καινοτόμες μελλοντικές προοπτικές έχει ως στόχο να κατανοήσει τη σε βάθος σχέση μεταξύ μικροοργανισμών και μελισσών, προκειμένου να βελτιώσει τη δραματική διάρκεια ζωής και τις συνθήκες τους.

Δυσβίαση του εντέρου: ένα παράδειγμα

Δεδομένου του αυξανόμενου ενδιαφέροντος που δείχνει η κοινή γνώμη για αυτό το προϊόν, η πρώτη αντικειμενική ανάλυση πέφτει στην επίδραση του Glyphosate (Ν-φωσφονομεθυλο-γλυκίνη). Είναι ένα μη επιλεκτικό μεταεμφανιζόμενο συστηματικό ζιζανιοκτόνο, επομένως ένα ολικό ζιζανιοκτόνο. Ο μηχανισμός δράσης του διακόπτει τη μεταβολική οδό που είναι υπεύθυνη για τη σύνθεση φαινυλαλανίνης, τυροσίνης και τρυπτοφάνης, αναστέλλοντας τη σύνθεση της 3-φωσφοσικιμάτης-1-καρβοξυβινυλοτρανσφεράσης (συνθετάση EPSP). Αυτό το ζιζανιοκτόνο θεωρούνταν πάντα ως ένα από τα λιγότερο τοξικά προϊόντα για τα ζώα, καθώς στερούνται αυτού του μεταβολικού μονοπατιού. Παρ ‘όλα αυτά, έχει αποδειχθεί ότι μπορεί να επηρεάσει οργανισμούς μη στόχους που παρουσιάζουν εξαιρετικά τοξικές επιδράσεις σε γαιοσκώληκες, μικροφύκη, υδρόβια βακτήρια, ριζόσφαιρα και ενδόφυτα. Επηρεάζοντας, λοιπόν, τα βακτήρια, θα πρέπει να τονιστεί ότι τα αποτελέσματα εντοπίστηκαν επίσης σε εντερικούς μικροοργανισμούς και συμβόλαια της πανίδας που γειτνιάζουν με γεωργικές περιοχές, συμπεριλαμβανομένων των μελισσών.

Συγκεκριμένα, οι Motta et al. (2018) διεξήγαγε μια μελέτη που στοχεύει στον χαρακτηρισμό της μικροβιολογίας του μέλισσες εκτεθειμένες στο Glyphosate, καταλήγοντας στο συμπέρασμα ότι η απόλυτη αφθονία των S. alvi, G. apicola, Lactobacillus sp. και Bifidobacterium sp. (Εικ. 15) έχει υποστεί σημαντική μείωση.

Εικόνα 15. Αναλύει του μικροβιώματος του εντέρου της μέλισσας

Το προϊόν παραβίασε τη βακτηριακή χλωρίδα σταματώντας την ανάπτυξή τους χωρίς, ωστόσο, να τους σκοτώσει άμεσα. Επομένως, υποτέθηκε ότι η επίδραση έπεσε στην κυτταρική διαίρεση κατά τις πρώτες μέρες του αποικισμού. Οι μέλισσες που αντιμετώπισαν το ζιζανιοκτόνο στο χωράφι, στην πραγματικότητα, θα μετέφεραν το δραστικό συστατικό μέσα στην κυψέλη το οποίο, όντας πολύ σταθερό και αδιάλυτο στο νερό, θα μπορούσε να παραμείνει στις επιφάνειες για μεγάλο χρονικό διάστημα. Ομοίως, ακόμη και στο πεδίο, η επιμονή σημαίνει ότι η μόλυνση μπορεί να διαρκέσει για μεγάλο χρονικό διάστημα. Μέσα στην κυψέλη, επομένως, η διάχυση με τροφαλαξία και επαφή με άλλες μέλισσες σημαίνει ότι το προϊόν φτάνει στις νεαρές προνύμφες που τρέφονται από ενήλικες, αλλάζοντας ανεπανόρθωτα την ανάπτυξη ευεργετικών ειδών συμβόλων.

Πώς αποκτάται η μικροβίωση

Εικόνα 16. Ο κύκλος ανάπτυξης μιας μέλισσας

Τα φυσικά βακτήρια που συλλέγονται από τις μέλισσες από τα λουλούδια ενώ συλλέγουν νέκταρ και γύρη βρίσκονται κυρίως στο μέσον και στο πίσω έντερο της μέλισσας. Τα βακτήρια του εντέρου που βρίσκονται φυσικά στις μέλισσες είναι δυναμικά. Κατά την ανάπτυξη των προνυμφών (Εικ. 16), ο βακτηριακός πληθυσμός αυξομειώνεται. Οι προνύμφες λαμβάνουν κάποια βακτήρια από τις μέλισσες που τις ταΐζουν. Κατά τη διάρκεια της βλάστησης, η επένδυση του εντέρου χάνεται και το έντερο μιας νεοεμφανιζόμενης ενήλικης μέλισσας είναι στείρο. Το έντερο επανεγκαθίσταται γρήγορα με χαρακτηριστική μικροβίωση. Πώς συμβαίνει αυτό; Οι κύριες οδοί είναι η στοματική τροφαλαξία, η αλληλεπίδραση με το υλικό της κυψέλης και η κοπράνη-στοματική μετάδοση. Συγκεκριμένα, η χαρακτηριστική μικροβίωση των ενήλικων μελισσών αρχίζει να αναπτύσσεται περίπου τέσσερις ημέρες μετά το τρεμόπαιγμα.

Αν και οι παράγοντες που επέτρεψαν την εξέλιξη του μικροβίου για κάθε ζωντανό ον είναι ακόμα άγνωστοι, είναι αποδεδειγμένο ότι οι κοινωνικές μέλισσες διαθέτουν μια ξεχωριστή μικροχλωρίδα ανάλογα με την οικογένεια στην οποία ανήκουν. Για παράδειγμα, έχει διαπιστωθεί ότι η ανάλυση των μικροβίων διαφόρων γενών ευρωκοινωνικών στεροειδών Apoidea όπως Bombus spp., Megachile spp. και Apis spp., τα κύρια γένη βακτηρίων ήταν επαναλαμβανόμενα (Snodgrassella spp., Gilliamella spp., Bifidobacterium spp. και Lactobacillus spp.) αλλά τα είδη ποικίλλουν σε σχέση με τα είδη εντόμων. Ως εκ τούτου, η υπόθεση που βλέπει το μικροβίωμα ως αποτέλεσμα μιας δυναμικής συν-εξέλιξης μεταξύ μικροοργανισμών και ξενιστών, εξαρτάται από το περιβάλλον και από τις γονότυπες παραλλαγές στις οποίες έχουν υποβληθεί τα είδη κατά τη διάρκεια των αιώνων, των οποίων ο πλούτος συσχετίζεται επίσης με το μέγεθος του μεμονωμένες μέλισσες και ολόκληρες αποικίες. Στην πραγματικότητα, η καθιέρωση μιας ειδικής για το είδος μικροβιακής χλωρίδας είναι το αποτέλεσμα μιας μακράς επιλογής στην οποία έχουν καθοριστεί οι βέλτιστες ευεργετικές αναλογίες τόσο για τους μικροοργανισμούς όσο και για τους ξενιστές.

Ποιοι και που βρίσκονται

Έχει υπολογιστεί ότι μέσα στα έντερα των ενήλικων εργαζομένων μελισσών υπάρχουν περίπου 1 δισεκατομμύριο βακτηριακά κύτταρα, το 95% των οποίων βρίσκονται, συγκεκριμένα, στο οπίσθιο έντερο (Εικ. 17). Εδώ, σημειώθηκε μια συγκεκριμένη διαφοροποίηση μεταξύ ειλεού και ορθού. στα τρία πρώτα είδη Πρωτεοβακτηρίων όπως G. apicola, F. perrara και S. alvi που σχηματίζουν ένα πυκνό βιοφίλμ σε αντιστοιχία με τους σωλήνες Malpighian και το οποίο συνεχίζει κατά μήκος του τοιχώματος του ειλεού. Στο ορθό, ωστόσο, επικρατεί μια πυκνή βακτηριακή κοινότητα που σχηματίζεται από τρεις κατηγορίες θετικών κατά Gram, όπως τα Firmicutes (Firm-4, Firm-5) και Bifidobacteria. Όσον αφορά το μεσαίο έντερο, έχει διαπιστωθεί ότι υπάρχουν κυρίως Lactobacillus spp. και Acetobacteraceae, δηλαδή εκείνα τα taxa που βρίσκονται επίσης στη γύρη, το νέκταρ και γενικότερα μέσα στην κυψέλη. Ως εκ τούτου, μπορεί να ειπωθεί ότι μια προ-προσαρμοσμένη μικροβίωση δεν υπάρχει στο μεσαίο έντερο και ότι ποικίλλει σε σχέση με το περιβάλλον και τις διατροφικές συνήθειες του ατόμου. Σε ποσοτικούς όρους, λοιπόν, εδώ υπάρχει πολύ λιγότερο άφθονη χλωρίδα από ό, τι στο ορθό. Το μεσαίο έντερο περιέχει επίσης λίγα βακτήρια και αυτά τα δώρα είναι πιο συγκεντρωμένα στην προκοιλιακή περιοχή δίπλα στο οπίσθιο έντερο.

Εικόνα 17. Το βασικό μικροβίωμα της μέλισσας

Ποιες είναι οι λειτουργίες του μικροβίώματος του εντέρου;

Τα τελευταία χρόνια, η επιστημονική κοινότητα έχει αρχίσει να ενδιαφέρεται όλο και περισσότερο για το ρόλο που παίζει η μικροβίωση στην ευημερία των μελισσών (Εικ. 18). Πολυάριθμες μελέτες και έρευνες έχουν δείξει ότι οι αλληλεπιδράσεις με τον ξενιστή έχουν υποστηρικτικά αποτελέσματα τόσο σε μεταβολικό και διατροφικό επίπεδο όσο και σε όρους ανοσολογικής απόκρισης σε παθογόνους παράγοντες. Όσον αφορά τη διατροφική υποστήριξη, μια ισορροπημένη βακτηριακή χλωρίδα είναι απαραίτητη για τη σωστή αφομοίωση των θρεπτικών συστατικών καθώς, χάρη στην ενζυματική της δράση, συμμετέχει στην αποικοδόμηση σύνθετων σακχάρων. Εκτός από την ευθύνη για την παρουσία κυτταρινών, ημικυτταρινών και λιγνινολυτικών ενζύμων στο έντερο που είναι χρήσιμα για τη διαδικασία πέψης των κόκκων γύρης, ο πλούτος των ειδών είναι τέτοιος ώστε να επιτρέπει τη συνύπαρξη διαφορετικών οδών κατάλυσης σακχάρου (ειδικά για τα γαμμαπρωτοβακτήρια, τα στερεωτικά και Bifidobacteriaceae). Πράγματι, έχει υπολογιστεί ότι το 91% των μεταγραφών πρωτεΐνης που συνδέονται με την πέψη των φυτικών μακρομορίων και με τα φαινόμενα ζύμωσης των μονομερών υπομονάδων παράγονται από βακτήρια. Ένα άλλο συγκεκριμένο παράδειγμα αφορά πηκτίνες-λυάσες ικανές να υποβαθμίσουν τις πηκτίνες που υπάρχουν στα κύτταρα του τοιχώματος των κόκκων γύρης. Το τελευταίο είναι επίσης ένας εξαιρετικός δείκτης της υψηλής γενετικής μεταβλητότητας και προσαρμοστικότητας στο ίδιο είδος μικροοργανισμών. Στην πραγματικότητα, έχει διαπιστωθεί ότι μόνο ορισμένα στελέχη του G. apicola τα κατέχουν ενώ άλλα στερούνται εντελώς από αυτά. Η σημασία μιας μεγαλύτερης πεπτικής ικανότητας και, κατά συνέπεια, της ικανότητας μεταβολισμού των θρεπτικών συστατικών που δεν μπορούσαν να καταστραφούν, έχει αποδειχθεί σε διάφορες μελέτες. Zheng et al. (2017), για παράδειγμα, συγκρίνοντας τις μέλισσες με μια φυσιολογική μικροχλωρίδα και άλλες χωρίς κανένα είδος εντερικής χλωρίδας, τόνισαν σημαντικές φυσιολογικές διαφορές. Στο πρώτο, τα συμβόλια επηρέασαν θετικά το μέγεθος του εντέρου, το βάρος των ατόμων, τις τιμές της βιτελογενίνης και της ινσουλίνης και την ευαισθησία στα σάκχαρα. Αυτά τα ευρήματα πρότειναν τότε ότι η μικροβίωση θα μπορούσε να επηρεάσει την όρεξη και την ανάπτυξη του σώματος των μελισσών μέσω της αύξησης των σημάτων που σχετίζονται με την παρουσία ινσουλίνης.

Εκτός από την υδρόλυση σύνθετων υδατανθράκων, οι εντερικοί μικροοργανισμοί παράγουν χρήσιμα μεταβολικά υποστρώματα, όπως η βιταμίνη Β και άλλες και μικρές αλυσίδες λιπαρών οξέων. Για παράδειγμα, έχει φανεί ότι τα γένη Lactobacillus sp. και Bifidobacterium sp. εμπλέκονται στις διαδικασίες ζύμωσης γύρης και νέκταρ, έτσι ώστε να μπορούν να θεωρηθούν υπεύθυνοι για τη βιταμινική αξία του μελιού. Το φαινόμενο της συμβίωσης με τον ξενιστή υπερβαίνει τη διατροφική και μεταβολική υποστήριξη: η μικροβιακή παίζει σημαντικό ρόλο στην υποστήριξη του ανοσοποιητικού συστήματος. Στην πραγματικότητα, καταρχάς, τα βακτήρια θα μπορούσαν να διεγείρουν άμεσα την παραγωγή των αμυντικών μορίων της μέλισσας. Μετά την επαφή μεταξύ της επιθηλιακής επιφάνειας και της πεπτιδογλυκάνης (κύριο συστατικό του κυτταρικού τοιχώματος των θετικών κατά Gram βακτηρίων), το ανοσοποιητικό σύστημα θα μπορούσε να ενεργοποιήσει τα γονίδια για την παραγωγή 6 αντιμικροβιακών πεπτιδίων όπως: αβαεκίνη, υμενοπατεΐνη, απιδικίνη, defensin-1 και defensin -2. Η παραγωγή αυτών των ενώσεων, λοιπόν, τονίζεται από τις μεταβολές των ίδιων των μικροβιακών μεμβρανών και μπορεί επίσης να προκληθεί από έκθεση σε ορισμένους παθογόνους και μη παθογόνους μικροοργανισμούς. Για παράδειγμα, το Frischella perrara, ένα σύμβολο που αποικίζει την περιοχή του ειλεού στο οπίσθιο έντερο, πάνω απ ‘όλα διεγείρει την παραγωγή απιδικίνης. Δεύτερον, το μικροβίωμα μπορεί να είναι άμεσα υπεύθυνο για την παραγωγή αντιμικροβιακών ενώσεων, οι οποίες, μεταξύ άλλων, επιβεβαιώνονται από πολυάριθμες μελέτες. Saraiva et al. (2015), για παράδειγμα, τεκμηριώθηκε η παρουσία πολυάριθμων γονιδίων που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση της στρεπτομυκίνης και των δευτερογενών μεταβολιτών που εκφράζονται με συμβόλαιο και τα οποία μπορεί να διαδραματίσουν ρόλο στη διατήρηση του μικροβίου.

Εικόνα 18. Λειτουργίες του εντέρου της μέλισσας

Τι μπορούμε να κάνουμε;

Από τη δική μας και γενική εμπειρία σε ανθρώπους και ζώα, οι βιοτικές και αβιοτικές καταπονήσεις θα μπορούσαν να επηρεάσουν αρνητικά τη σύνθεση του μικροβίου του εντέρου και ως εκ τούτου να προκαλέσουν συγκεκριμένες αλλαγές στις δραστηριότητες των μικροοργανισμών σε επίπεδο εντέρου.

Πρέπει να αναρωτηθούμε εάν κάθε είδους διαμόρφωση μικροβίων, με τη χορήγηση επιλεγμένων στελεχών, θα μπορούσε να αποκαταστήσει αυτή τη διαταραχή, να μειώσει τη θνησιμότητα των μελισσών και/ή να βελτιώσει την υγεία των μελισσών.

Τα προβιοτικά είναι «ζωντανοί μικροοργανισμοί που, όταν χορηγούνται σε επαρκείς ποσότητες, ωφελούν την υγεία του ξενιστή, εξαιρουμένων των αναφορών σε βιοθεραπευτικούς παράγοντες και ωφέλιμους μικροοργανισμούς που δεν χρησιμοποιούνται στα τρόφιμα» (FAO / WHO, 2001). Η χορήγησή τους, λοιπόν, δεν πρέπει να σχετίζεται με αρνητικές επιπτώσεις στους οργανισμούς και το περιβάλλον. Ο τρόπος δράσης αυτών των μικροοργανισμών μπορεί να συνοψιστεί στις ακόλουθες λειτουργίες:

– ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΙΚΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ: εξάρθρωση παθογόνων, ανταγωνισμός για θρεπτικά συστατικά, ανταγωνισμός με υποδοχείς και παραγωγή αντιμικροβιακών μορίων (π.χ. βακτηριοκίνες, οργανικά οξέα …).

– ΔΟΜΙΚΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ: επίδραση φραγμού, βιοφίλμ στο τοίχωμα της τρίχας του εντέρου, ανάπτυξη του ανοσοποιητικού συστήματος.

– ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ: διαφοροποίηση και πολλαπλασιασμός εντερικών επιθηλιακών κυττάρων, κατάλυση καρκινογόνων ουσιών που υπάρχουν στη διατροφή, σύνθεση βιταμινών, ζύμωση μη εύπεπτων σακχάρων, ιοντική απορρόφηση και εξοικονόμηση ενέργειας.

Ωστόσο, φαίνεται ότι ο κύριος μηχανισμός δράσης των προβιοτικών είναι η διέγερση του ανοσοποιητικού συστήματος: μετά από συνοχή με το εντερικό τοίχωμα, είναι σε θέση να διεγείρουν μια σειρά από σήματα καταρράκτη που ενεργοποιούν τη σύνθεση αντιμικροβιακών πεπτιδίων. Στην πράξη, είναι σε θέση να εκτελέσουν εκείνα τα καθήκοντα που περιγράφηκαν προηγουμένως που εκτελεί φυσιολογικά η μικροβίωση της μέλισσας, αποδεικνύοντας ότι είναι μια υποθετική βέλτιστη βοήθεια για τη διαφύλαξη και βελτιστοποίησή της, καθώς και για τη βελτίωση των προοπτικών ζωής της μέλισσας.

Όπως και με τη διατροφή των ανθρώπων και των ζώων, τα κύρια βακτήρια που θεωρούνται ικανά για αυτά τα οφέλη είναι τα Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Bacillus spp.

Συμπερασματικά, η χρήση προβιοτικών άρχισε πρόσφατα να αξιολογείται και μέσα στην ίδια την κυψέλη. Στην πραγματικότητα, αν και οι μέλισσες προτιμούν να καταναλώνουν φρέσκια γύρη, υπό ορισμένες συνθήκες, όπως η εποχικότητα, πρέπει να προμηθευτούν οι ίδιοι τα αποθηκευμένα αποθέματα. Το υγρό περιβάλλον (50-60% RH) που δημιουργείται μετά τη συλλογή γύρης αυξάνει τον κίνδυνο ανεξέλεγκτης βακτηριακής και, κυρίως, μυκητιακής ανάπτυξης. Υπάρχει σαφής ανάγκη να διατηρηθούν τα αποθέματα μέσα στην κυψέλη για να αποφευχθούν λοιμώξεις που θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε θανατηφόρα αποτελέσματα, όπως ασβεστοποιημένες προνύμφες λόγω Ascosphaera apis ή εντερικές λοιμώξεις λόγω Nosema spp.