In den letzten Jahrzehnten ist der rasante Fortschritt der Molekularbiologie und die Errungenschaften in diesem wissenschaftlichen Bereich direkt mit den Fortschritten in den Computerwissenschaften und der Entwicklung neuer Software-Tools verbunden.

Systembiologie und Omics-Technologien: Das große Bild

In den letzten Jahrzehnten ist der rasante Fortschritt der Molekularbiologie und die Errungenschaften in diesem wissenschaftlichen Bereich direkt mit den Fortschritten in den Computerwissenschaften und der Entwicklung neuer Software-Tools verbunden. Die Anwendung verschiedener omics-bezogener Technologien (Genomik, Epigenomik, Transkriptomik, Proteomik, Metabolomik usw.) führt zur Anhäufung vielseitiger biologischer Daten und ihre kombinierte Interpretation eröffnet den Wissenschaftlern neue Möglichkeiten, von der Untersuchung isolierter biologischer Moleküle zu einer umfassenden Analyse großer Mengen biologischer Moleküle überzugehen. Die biologischen Wissenschaften haben sich zu Big-Data-Wissenschaften entwickelt, die für die Lösung von Problemen im Zusammenhang mit der menschlichen Gesundheit und der Umwelt von wachsender Bedeutung sind. Die Herausforderungen von Big Data sind nicht nur ihre Größe, sondern auch ihre zunehmende Komplexität.

Die Systembiologie hat sich als ein neues interdisziplinäres Studienfeld herauskristallisiert, das in den letzten Jahren eine enorme Aufmerksamkeit erlangt hat. Obwohl der Begriff „Systembiologie“ auf unterschiedliche Weise verwendet wurde, wird er im Allgemeinen so verstanden, dass er Forschung beschreibt, die Biologie mit scheinbar disparaten Disziplinen wie Physik, Biochemie, Ingenieurwesen, Biostatistik, Mathematik, Informatik, Bioinformatik und anderen verbindet. Der Hauptzweck dieses interdisziplinären Feldes ist es, eine hochgradig parallele Sicht auf die biologischen Systeme auf molekularer Ebene zu erhalten und zu verstehen, wie sie als Ganzes statt als Summe von Teilen funktionieren. Durch die Klärung der molekularen Mechanismen und Prozesse auf verschiedenen Systemebenen im Organismus oder einer Zelle kann vorhergesagt werden, wie sich diese Systeme im Laufe der Zeit und unter verschiedenen Bedingungen verändern. Die große Menge an Informationen, die man über die molekularen Grundlagen der Zellphysiologie und -organisation erhält, könnte Lösungen in Bezug auf Krankheiten, Toxizitäten, Therapien, Medikamentenentwicklung usw. liefern.

Die Systembiologie wurde als eigenständige Disziplin in den 1950er Jahren mit der Arbeit der Systemtheoretiker Mihajlo Mesarovic und Ludwig von Bertalanffy an der allgemeinen Systemtheorie begründet. Das Hauptkonzept dieser Theorie ist, dass die Dynamik eines jeden Systems ein Ergebnis der Beziehungen zwischen seinen einzelnen Einheiten ist, die seine Funktion bestimmen. Damals versuchten die Biochemiker, Anhänger der Systemtheorie, durch das gründliche Studium von Enzymen und der Kinetik von Enzymreaktionen, das Verhalten der biochemischen Wege als ein Netzwerk zu untersuchen, anstatt als eine Summe seiner Teile. Aus dem biochemischen Bereich kommend, entwickelte Reinhart Heinrich theoretische Ansätze zur Beschreibung und quantitativen Untersuchung von Signalwegen und entwickelte eine metabolische Kontrolltheorie. Die Notwendigkeit eines integrierten Ansatzes für ein detaillierteres Studium und Verständnis der komplexen biologischen Prozesse wurde offensichtlich.

Die Systembiologie ist in hohem Maße von den biologischen Informationen abhängig, die durch molekularbiologische und / oder individuelle Omics-Ansätze gewonnen werden, die jedoch oft weitgehend hypothesengesteuert oder reduktionistisch sind. Bei dem reduktionistischen Ansatz werden die funktionellen Eigenschaften der einzelnen molekularen Komponenten in den komplexen biologischen Systemen untersucht. Nach dem Abschluss des Humangenomprojekts hat sich die moderne Wissenschaft über die gen-zentrierte Sichtweise der früheren Genomik-Ära hinaus entwickelt. Diese als postgenomische Ära bezeichnete Periode ist durch große Veränderungen in der wissenschaftlichen Forschungsdurchführung und Ergebnisinterpretation gekennzeichnet und bedeutet laut Bloom das Ende des „naiven Reduktionismus“. Trotzdem, dass diese klassischen Methoden allein kein vollständiges Verständnis von lebenden Organismen liefern können, werden sie weiterhin ein wesentliches Element aller biologischen Forschung sein. In diesem Zusammenhang hat die Systembiologie eine grundlegende Veränderung der traditionellen Ansätze bewirkt. Sie verwendet einen neuen, hypothesengenerierenden, ganzheitlichen Ansatz, der sich auf die Untersuchung von Teilsystemen konzentriert und so ein tieferes Verständnis des Gesamtprozesses ermöglicht. Der Galaktoseverwertungsweg (GAL) der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist ein Beispiel für die Anwendung des systembiologischen Ansatzes, um die mit dem reduktionistischen Ansatz (ein Gen/ein Protein auf einmal) gewonnenen Ergebnisse neu zu lesen und zu interpretieren. Auf der Grundlage von experimentellen Daten, die aus Analysen von Protein- und RNA-Levels sowie Protein-Protein- und Protein-DNA-Interaktionen gewonnen wurden, und deren Integration in ein einziges Modell wurde eine neue Hypothese zur Regulation des GAL-Signalwegs aufgestellt, die anschließend experimentell verifiziert wurde.

Durch den Einsatz von computergestützten und mathematischen Werkzeugen wird eine große Menge an experimentellen Daten gesammelt und von der Systembiologie integriert, um unbekannte Muster aufzudecken und Hypothesen zu generieren. Dies ist eine wichtige Strategie, um neue Erkenntnisse über die biologischen Systeme zu gewinnen und auch bei der Versuchsplanung zu helfen.

Der System-Level-Ansatz der biologischen Systeme zielt darauf ab, die folgenden drei Fragen im Kontext des molekularen Netzwerks zu klären: i) was sind die einzelnen Komponenten des Systems; ii) wie arbeiten sie separat? und iii) wie arbeiten diese Komponenten zusammen, um eine Aufgabe zu erfüllen? (3). Im Zusammenhang mit molekularen Netzwerken lässt sich das grundlegende Ziel der Systembiologie wie folgt zusammenfassen: (i) ein Verständnis der Struktur aller Komponenten einer Zelle / eines Organismus bis zur molekularen Ebene, (ii) die Fähigkeit, den zukünftigen Zustand der Zelle / des Organismus unter einer normalen Umgebung vorherzusagen, (iii) die Fähigkeit, die Ausgangsreaktionen für einen gegebenen Eingangsstimulus vorherzusagen, und (iv) die Fähigkeit, die Veränderungen im Systemverhalten bei einer Störung der Komponenten oder der Umgebung abzuschätzen.

Der Begriff „Systeme“ in der Systembiologie definiert verschiedene Komplexitätsspannen, die von zwei Makromolekülen, die zusammenwirken, um eine bestimmte Aufgabe zu erfüllen, bis hin zu ganzen Organismen reichen (Abb.1).

Abb. 1. Haupttypen von biologischen Netzwerken. A. Protein-Protein-Interaktionen; B. Genregulatorisches Netzwerk; C. Metabolische Netzwerke; D. Verschiedene Arten von Netzwerken in der Zelle (9).

Damit teilt die Systembiologie ein gemeinsames wissenschaftliches Ziel mit der Disziplin der Physiologie, die sich der Untersuchung der integrierten Funktion des gesamten komplexen biologischen Systems widmet. Organismen sind viel mehr als die Summe ihrer Teile und die Komplexität physiologischer Prozesse kann nicht verstanden werden, indem man einfach untersucht, wie die Komponenten isoliert funktionieren. Zum Beispiel kodieren Gene die Primärstruktur der zellulären Proteine, die ihrerseits spezifische Funktionen ausführen, die den Zellstoffwechsel und die Physiologie sowie die Entwicklung des Organismus unterstützen. Gleichzeitig agieren die Proteine in jeder Zelle nicht isoliert, sondern in einem komplexen Netzwerk, das für die Spezifikation von Phänotypen wichtig ist. Die meisten biologischen Prozesse sind hochdynamisch und beinhalten oft mehr als eine Art von Molekülen. Gleichzeitig kann ein Phänotyp durch mehrere verschiedene molekulare und epigenetische Mechanismen bedingt sein und ein Molekültyp kann an verschiedenen Phänotypen beteiligt sein. Tatsächlich kann ein Protein sogar im selben Organismus in verschiedenen Zellen unterschiedliche Rollen spielen; oder Signalweg-Effektoren können in verschiedenen Zelllinien unterschiedliche Differenzierungsprogramme induzieren. Darüber hinaus haben einzelne Zellen in mehrzelligen Organismen keine vom Gesamtorganismus unabhängige Existenz, sie sind ontogenetisch miteinander verbunden.

Ungeachtet ihres gemeinsamen Ziels verwenden die Systembiologie und die Physiologie unterschiedliche Werkzeuge und experimentelle Ansätze, was dazu führt, dass sie einen unterschiedlichen Satz an experimentellen Daten erhalten. Eine disziplinübergreifende Systembiologie ist eine moderne, sich schnell entwickelnde Disziplin, da sie eine Vielzahl von Methoden und Werkzeugen verwendet, einschließlich groß angelegter funktioneller Genomik und anderer Omics-Technologien, Bioinformatik und Computermodellierung, die von den Physiologen nicht genutzt werden. Die Rolle der computergestützten Biologie in der Systembiologie besteht darin, massive Mengen empirischer Daten zu verarbeiten und zu analysieren, die von verschiedenen Omics-Ebenen produziert werden, was wiederum zur Entdeckung biologischen Wissens und zur Generierung von Forschungshypothesen führt. Die Anwendung von in silico- und simulationsbasierten Analysen bietet die Möglichkeit, Vorhersagen zu treffen, die wiederum durch experimentelle Untersuchungen bestätigt werden. Der rasante Fortschritt der Informationstechnologien, einschließlich der Erweiterung öffentlicher Web-Datenbanken mit biologischen Informationen, unterstützt ebenfalls die Entwicklung von Omics-Studien und führt zum Fortschritt der Systembiologie.

Um biologische Prozesse umfassend zu untersuchen, ist es entscheidend zu verstehen, wie die einzelnen biologischen Schichten (Genom, Epigenom, Transkriptom, Proteom, Metabolom und Ionom) in einem zellulären System miteinander verbunden sind und wie der Fluss der biologischen Information abläuft. Um ein genaues Bild des lebenden Organismus zu entwerfen, ist die Kombination verschiedener Omics-Analysen mit einem Multi-omics-Ansatz erforderlich.  Transcriptomics-, Proteomics- und Metabolomics-Daten können unabhängig voneinander wichtige biologische Fragen bezüglich der Expression von Transkripten, Proteinen und Metaboliten beantworten, aber eine systematische Multi-omics-Integration kann diese großen Datensätze umfassend assimilieren, annotieren und modellieren.

Die Übertragung der genetischen Information in biologischen Systemen erfolgt von der DNA über die mRNA zum Protein und dies wird als zentrales Dogma der Molekularbiologie bezeichnet. Die drei Hauptprozesse in jeder Zelle sind Replikation, Transkription und Translation. Ihr ständiger Fluss sorgt für die Aufrechterhaltung und Umsetzung der in der DNA kodierten genetischen Information in Genprodukte, die je nach Gen entweder RNAs oder Proteine sind. Die Replikation ist ein Prozess der Vervielfältigung der DNA einer Zelle und bildet die Grundlage für die biologische Vererbung. Sie wird von dem Enzym DNA-Polymerase durchgeführt, das ein einzelnes elterliches doppelsträngiges DNA-Molekül in zwei Tochter-DNA-Moleküle kopiert. Das Enzym RNA-Polymerase erzeugt aus der DNA ein RNA-Molekül, dieser Vorgang wird als Transkription bezeichnet. Das neu synthetisierte RNA-Molekül ist komplementär zu einem Gen-kodierenden Abschnitt der DNA. Bei der Translation wird aus der mRNA ein Protein hergestellt. Das Ribosom erzeugt eine Polypeptidkette aus Aminosäuren unter Verwendung der mRNA als Vorlage. Die Polypeptidkette faltet sich zu einem Protein auf. In eukaryotischen Zellen, d. h. Zellen mit einem Zellkern, finden Replikation und Transkription innerhalb des Zellkerns statt, während die Translation außerhalb des Zellkerns im Zytoplasma erfolgt. In prokaryotischen Zellen, also solchen, die keinen Zellkern haben, finden alle drei Prozesse im Zytoplasma statt. Der Phänotyp des Organismus wird durch dieses Paradigma der Informationsübertragung bestimmt. Biologen untersuchen diese „Omes“ seit Jahren in Form von Genomik, Transkriptomik und Proteomik. Die Daten aus diesen experimentellen Ansätzen werden durch Epigenomik und Metabolomik ergänzt, die in jüngster Zeit zur Lösung spezifischer Probleme bei vielen Funktionen eines Organismus eingesetzt werden. Die rasante Entwicklung und der Fortschritt der „Omics“-Technologien bestimmen die fortschreitende Erweiterung der Informationsmenge, die in einzelnen Studien gesammelt werden kann. Darüber hinaus hat die derzeitige Hochdurchsatznatur dieser Techniken die Zugänglichkeit zu diesen Informationen in Bezug auf Zeit und Kosten erhöht. Viele Forscher befinden sich in einer Situation, in der sie mehrere Omics-Datensätze an denselben experimentellen Proben sammeln können. Um umfassendere Aussagen über biologische Prozesse zu erhalten, müssen diese Datensätze durch einen Multi-omics-Ansatz integriert und als ganzheitliches System analysiert werden (Abb. 2).

Abb. 2. Integrierte Omics-Ansätze der Systembiologie

Der Begriff „Omics“ leitet sich aus dem Griechischen ab und die Anfügung des Suffixes -ome an zelluläre Moleküle, wie z. B. Gen, Transkript, Protein, Metabolit, gibt die Bedeutung von „ganz“, „alles“ oder „vollständig“. Die verschiedenen Schichten der Zelle, bestehend aus DNA und Modifikationen (Genom, Epigenom), RNA und Proteingehalt (Transkriptom, Proteom), kleinen Molekülen (Metabolom, Lipidom) und elementarer Zusammensetzung (gemessen als „Ionom“), können durch omische Technologien analysiert werden. Die Kombination von Omics-Schichten in einem Multi-Omics-Datensatz wird durch eine robuste Systembiologie integriert, die in der Lage ist, Mechanismen und Interaktionen zwischen den Schichten sowie die Funktion von Zellpopulationen, Geweben, Organen und dem gesamten Organismus aufzudecken. Omics-Ansätze umfassen eine größere Anzahl von Messungen pro Endpunkt und obwohl die Anzahl der gemessenen Parameter pro Analyse erhöht wird, wird die Anzahl der Replikate verringert. Dies liegt zum einen an der Überschätzung der Methoden, da davon ausgegangen wird, dass mehr Messungen eine geringe Anzahl von Proben kompensieren würden, und zum anderen an den Kosten und dem Zeitaufwand von Omics-Experimenten.

Die omischen Einzeldisziplinen zielen auf die Untersuchung spezifischer biologischer Fragestellungen ab, ohne dass ein vorheriges Verständnis der beteiligten biologischen Grundlagen erforderlich ist. Abhängig von der Art der Biomoleküle, auf die sie sich in einer bestimmten biologischen Probe primär konzentrieren, werden Omics-Technologien unterteilt in: Genomik (Genom / Gen), Metagenomik (direkt aus Umweltproben gewonnene Genome), Epigenomik (unterstützende Struktur des Genoms, einschließlich Protein- und RNA-Binder, alternative DNA-Strukturen und chemische Modifikationen an der DNA), Transkriptomik (mRNA), Proteomik (Peptide / Proteine), Metabolomik (Stoffwechselprodukte), Lipidomik (Lipide), Glykome (Kohlenhydrate und Zucker), Ionomik (Ionen).

Obwohl keine der aktuellen Omic-Technologien perfekt ist, gelingt es einigen von ihnen, ein umfassenderes Bild der biologischen Ebene zu liefern, die sie untersuchen wollen, als anderen. Diese Tatsache ist nicht nur auf Unterschiede im Stand der technologischen Entwicklung zurückzuführen, sondern vielmehr auf die Unterschiede in der chemischen und physikalischen Komplexität der einzelnen biologischen Ebenen.

Genomik

Genomik ist die systematische Untersuchung aller Gene eines Organismus (des Genoms), einschließlich der Wechselwirkungen dieser Gene untereinander und mit der Umwelt des Organismus. Das Genom ist die basale biologische Schicht in der Zelle und stellt die gesamte DNA einer Zelle oder eines Organismus dar. Desoxyribonukleinsäure (DNA) ist die chemische Verbindung, die alle notwendigen genetischen Informationen enthält, die für die Entwicklung und Steuerung der Aktivitäten fast aller lebenden Organismen benötigt werden. DNA-Moleküle bestehen aus zwei verdrehten, gepaarten Strängen, die oft als Doppelhelix bezeichnet werden. Jeder DNA-Strang besteht aus vier Nukleotidbasen – Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G) und Cytosin (C), die sich spezifisch auf gegenüberliegenden Strängen paaren: Ein A paart sich immer mit einem T; ein C paart sich immer mit einem G. Eine Sequenz von drei benachbarten Nukleotiden (Codon) kodiert bei der Proteinsynthese oder Translation für eine bestimmte Aminosäure. Die Anordnung der Nukleotide entlang der DNA-Moleküle bestimmt den genetischen Code. Der genetische Code ist universell, weil er bei allen Organismen gleich ist, und er ist auch degeneriert, weil 64 Codons nur für 22 Aminosäuren kodieren. Mit ihrer Vier-Buchstaben-Sprache enthält die DNA die Informationen, die zum Aufbau eines ganzen Organismus benötigt werden. Ein Gen stellt die Einheit der DNA dar, die Codes für die Herstellung eines bestimmten Proteins oder einer Reihe von Proteinen trägt. Auf der Grundlage der intrinsischen Komplementarität der Nukleotidbasen in der DNA ist es möglich geworden, eine große Anzahl von Genomen schnell und zu relativ geringen Kosten zu sequenzieren. Aus den effizient sequenzierten Genomen konnten Vorhersagen über RNA- und Proteinsequenzen getroffen werden, die in den Multi-Omic-Ansätzen kombiniert werden. Die digitale Form der DNA-Sequenzen als eine Art biologische omic-Information könnte leicht in biologischen Datenbanken gespeichert und zwischen Wissenschaftlern auf der ganzen Welt ausgetauscht werden. Die Sequenzierung des ersten ganzen Genoms des Bakteriums Haemophilus influenza im Jahr 1995 war eine Revolution in der Molekularbiologie. Es entstand eine große Menge an Sequenzdaten, die nicht mehr vollständig zu interpretieren war. Die relevante genetische Information aus dem genetischen Hintergrundmaterial zu entschlüsseln, war eine fast unlösbare Aufgabe. Um dies zu überwinden, wurden detailliertere biologische Informationen benötigt. Informationen über die Transkription des genetischen Materials und die anschließende Produktion von Proteinen waren notwendig.

Eine wesentliche Forschungsrichtung auf dem Gebiet der Systembiologie ist die funktionelle Genomik. Diese Disziplin entwickelt und nutzt Methoden im großen Maßstab und mit hohem Durchsatz mit dem Ziel, die Genfunktion auf globaler Ebene zu definieren und zu analysieren. Für die Entwicklung eines systemischen Verständnisses eines biologischen Prozesses ist es sehr wichtig, die Gene und die von ihnen kodierten Proteine zu identifizieren, die zusammenarbeiten, um diesen Prozess zu bewirken. Die funktionelle Genomik ist ein integratives wissenschaftliches Feld, das mehrere große Datensätze kombiniert und versucht, Erkenntnisse über die Genfunktion zu gewinnen. Zunächst wurden die Gene einzeln analysiert, aber der Fortschritt der Technologien in den letzten Jahren ermöglicht es, die Expression von Tausenden von Genen gleichzeitig zu analysieren. Diese groß angelegte Analyse der Genfunktion wird als DNA-Mikroarray-Technologie bezeichnet (Abb. 3).

Abb. 3. Schema der DNA-Microarray-Analyse

DNA-Microarrays messen Unterschiede in der DNA-Sequenz zwischen Individuen und diese Technologie kann Informationen über die Funktion von nicht charakterisierten Genen liefern und auch Cluster von interagierenden Genen aufdecken, die einen biologischen Prozess von Interesse hervorrufen. Microarray-Analysen können auch Einblicke in Mechanismen der Genregulation, der Evolution und der Ätiologie von Krankheiten liefern. Die Analyse von Microarray-Daten kann zum Beispiel Anomalien wie chromosomale Insertionen und Deletionen oder abnormale Chromosomenzahlen in einem Prozess namens vergleichende genomische Hybridisierung aufdecken. Die häufigsten Variationen in DNA-Sequenzen zwischen Menschen sind Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), bei denen ein Nukleotid durch ein anderes ersetzt wird; dies kann funktionelle Bedeutung haben, wenn die Veränderung zu einem Codon für eine andere Aminosäure führt. Sie sind von besonderem Interesse, wenn sie mit genetisch bedingten Krankheiten in Verbindung gebracht werden. Die Erstellung von Einzelnukleotid-Polymorphismus-Profilen spielt auch in der Pharmakogenomik eine Rolle, wenn es darum geht, die individuellen Reaktionen von Patienten auf Medikamente zu untersuchen.

Epigenomik

Die epigenetischen Veränderungen wie DNA-Methylierung, Histon-Modifikationen, 2D- und 3D-Analyse der Chromatinstruktur und nicht-kodierende RNA werden mit den Methoden der Epigenomik untersucht. Diese -omics-Richtung konzentriert sich auf die Analyse der gesamten epigenetischen Veränderungen, die wichtige Informationen über die Mechanismen und die Funktion der Genregulation bei vielen Genen in einer Zelle oder einem Organismus liefert. Wissenschaftler haben verstanden, dass der Phänotyp eines Individuums nicht nur durch das Genom gesteuert wird, sondern auch durch die Veränderungen in der Regulation der Genaktivitäten. Genetische Experimente an Menschen und Tieren haben bewiesen, dass neben der DNA-Sequenz auch epigenetische Markierungen über die Gameten von den Eltern auf die Nachkommen übertragen werden und den Phänotyp der Nachkommen beeinflussen können.

Epigenomik definiert die Modifikationen in der Regulation von Genaktivitäten, die ohne oder unabhängig von Veränderungen der Gensequenzen wirken. Einige Definitionen beschränken die Epigenetik/Epigenomik auf Modifikationen des Phänotyps ohne Veränderungen der DNA-Sequenz, die an die nächsten Generationen weitergegeben werden. Bei den epigenetischen Modifikationen handelt es sich um chemische Modifikationen, die nicht durch das Genom kodiert sind und die koordinieren, wie und wann Gene exprimiert werden. Die Epigenomik erforscht vererbbare, reversible Modifikationen der DNA und des Chromatins, die keinen Einfluss auf die primären Nukleotidsequenzen haben. Während der Begriff Epigenomik die Analyse epigenetischer Veränderungen bei vielen Genen in einer Zelle oder im gesamten Organismus beschreiben würde, konzentriert sich die Epigenetik auf Prozesse, die regulieren, wie und wann bestimmte Gene ein- und ausgeschaltet werden. Es sind mehrere Faktoren bekannt, die die epigenetische Regulation beeinflussen: 1) Ernährung (diätetische Faktoren); 2) Umweltfaktoren; 3) Strahlenbelastung; 4) Infektionserreger; 5) immunologische Faktoren; 6) genetische Faktoren; 7) toxische Erreger; 8) Mutagene.

Für die Analyse der epigenetischen Modifikationen in der Zelle werden vielseitige Nachweisverfahren eingesetzt. DNA-Methylierungen werden durch Verdauungsassays und Bisulfit-Sequenzierung der DNA analysiert. In Verdauungsassays wird die genomische DNA mit methylierungssensitiven und methylierungsunsensitiven Endonukleasen fragmentiert. Methylierungssensitive Restriktionsenzyme spalten nur unmethylierte DNA und lassen methylierte DNA-Fragmente unverdaut. Die fragmentierte DNA kann durch Sequenzierung oder Microarray analysiert werden, und so werden die Methylierungsstellen kartiert. Der Nachteil dieser Methode ist, dass sie nur die DNA-Sequenzen in der Nähe der Ziele der gewählten Restriktionsenzyme untersucht und in der Regel nur zur Charakterisierung des globalen Niveaus der DNA-Methylierung verwendet wird, anstatt methylierte DNA auf der Ebene einzelner Reste zu identifizieren. Die Auflösung wird durch den Einsatz der Methode der Bisulfit-Sequenzierung verbessert. Bei dieser strangspezifischen Methode wird unmethyliertes Cytosin in Uracil umgewandelt, während methylierte Cytosinreste unbeeinflusst bleiben. Die resultierende DNA wird in PCR amplifiziert und kann durch Sequenzierung der interessierenden Regionen analysiert werden. Die Analyse kann auch mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie oder Microarrays durchgeführt werden. Die DNA-Methylierung kann auch durch Methoden untersucht werden, die auf dem Prinzip der Affinitätschromatographie beruhen. Die Probe, die fragmentierte DNA enthält, wird auf eine Säule mit gebundener methylbindender Domäne (MBD) von MeCP2 geladen, die spezifisch für methylierte DNA ist. Die methylierten DNA-Fraktionen werden heraus eluiert und mit genomweiten Techniken wie MBDCap-seq/MethylCap-seq analysiert. Ein weiterer Ansatz ist die Immunopräzipitation von methylierter DNA (MeDIP), die auf der spezifischen Bindung von Antikörpern an das methylierte Cytosin (5mC) in der DNA basiert. Diese Methode wird auch für die Analyse von hydroxyliertem Methylcytosin (5hmC) verwendet. Gereinigte Fragmente werden mittels PCR, Sequenzierung oder Microarray analysiert.

Eine weit verbreitete Technik zum Nachweis von Histonmodifikationen ist die Immunpräzipitation von Chromatin (ChIP). Sie wird zur Identifizierung lokaler posttranslationaler Modifikationen der Histonschwänze und zur Überwachung von Veränderungen der Modifikationen als Reaktion auf verschiedene Stimuli eingesetzt. Antikörper gegen spezifische Histonmodifikationen (z. B. Trimethylierung von Histon H3 Lysin K27) werden zur Immunpräzipitation derjenigen Chromatinregionen verwendet, die diese Modifikationen aufweisen. ChIP kann auch angewendet werden, um die Bindung von Transkriptionsfaktoren und Enzymen an das Chromatin zu untersuchen, wobei ein spezifischer Antikörper gegen den Faktor von Interesse verwendet wird. Die assoziierten Chromatinregionen können entweder mittels PCR zum Nachweis spezifischer Loci oder mittels Deep Sequencing für eine globalere Betrachtung sowie mittels Microarray (ChIP-Chip) analysiert werden, wobei im letzten Fall die Auflösung der Daten im Vergleich zum Sequencing schwächer ist. Während des letzten Jahrzehnts wurde die grundlegende ChIP-Methode weiterentwickelt, was zur Entstehung anderer vielfältiger ChIP-Methoden wie μChIP-seq für die Analyse geringer, mikroskaliger Probenmengen und der modernen Einzelmolekül-Echtzeitsequenzierung (SMRT; „Sequenzierung der dritten Generation“) von ChIP-Proben führte.

Epigenetische Modifikationen können auch mit Methoden untersucht werden, die die aktiven Regionen des Chromatins identifizieren. Bei der DNase-seq-Methode wird das Enzym DNase I verwendet, um die DNA zu verdauen, die nicht durch die Nukleosomenstruktur geschützt ist, sodass die Regionen, die empfindlich auf DNase reagieren, mit aktiven Genen assoziiert sind. Für die Analyse und Interpretation der Ergebnisse können Sequenzierungs-, Microarray- oder Southern Blot-Techniken verwendet werden. Das offene Chromatin kann auch durch die Formaldehyd-unterstützte Isolierung von regulatorischen Elementen (FAIRE) nachgewiesen werden, die zur Isolierung offener, nukleosomendepletierter Chromatinregionen führt. Die FAIRE-Methode basiert auf der Quervernetzung zwischen Formaldehyd und DNA, Histonen und anderen damit assoziierten Proteinen. Die DNA wird durch Sonikation fragmentiert und anschließend durch Phenol-Chloroform-Extraktion isoliert. Nur DNA, die nicht durch Nukleosomen und assoziierte Proteine gebunden ist, verbleibt bei der Extraktion in der wässrigen Phase, so dass die offenen und aktiven Bereiche des Genoms isoliert werden können. Die isolierten Fragmente können wiederum mit verschiedenen Methoden, wie PCR, Microarray und Sequenzierung, analysiert werden. Chromatin kann auch mit der Chromatin Conformation Capture (3C)-Technik untersucht werden, die die Chromatinregionen identifiziert, die physisch miteinander assoziiert sind, wie z. B. Promotoren mit Enhancern. 3C wird oft durch PCR analysiert, aber heutzutage auch durch Deep Sequencing der Interaktionen global (Hi-C).

Nicht-kodierende RNAs (ncRNAs) wirken als epigenetische Modifikatoren und regulieren die Genexpression stark. Ihre abweichende Expression, hauptsächlich in Form von microRNAs (miRNAs) und langen nichtkodierenden RNAs, kann die Genexpression modifizieren und komplizierte Immunstörungen auslösen. Die Analyse der RNA-Komponente der Epigenetik erfolgt meist genomweit mit Next-Generation-Sequencing-Methoden. Die Veränderungen in ncRNA und mRNA können durch Deep Sequencing charakterisiert werden. Die Expression von RNAs kann auch durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) analysiert werden. Die quantitative PCR, auch Real-Time-PCR genannt, ist eine Labortechnik in der Molekularbiologie, mit der die Menge des PCR-Produkts in Echtzeit bestimmt werden kann, und ist sehr nützlich für die Untersuchung der Genexpression.

Transkriptomik

Bei der Expression von Genen wird die in der DNA gespeicherte genetische Information auf die RNA (Ribonukleinsäure) übertragen. RNAs sind wichtige Makromoleküle, die aus linearen Ketten von Nukleotiden bestehen (Abb. 4), die durch den zellulären Prozess der Transkription hergestellt werden. RNAs erfüllen vielfältige zelluläre und biologische Funktionen, da sie entweder als Vorlage für die Proteinsynthese dienen oder kritische katalytische und regulatorische Rollen spielen. Bei der Transkription wird die genetische Information von der DNA auf die mRNA übertragen. Dieser Vorgang wird von einem Enzym, der RNA-Polymerase, durchgeführt. In den Zellen existieren mehrere Klassen von RNAs (Messenger-RNAs (mRNA), Transfer-RNAs (tRNA), ribosomale RNA (rRNA), kleine Kern-RNA (snRNA), kleine nukleolare RNA (snoRNA), short interfering RNA (siRNAs), Mikro-RNA (miRNAs), lange nicht-kodierende RNA und Pseudogene), aber diejenigen, die an der Proteinsynthese beteiligt sind, sind Boten-RNA (mRNA), Transfer-RNA (tRNA) und ribosomale RNA. Boten-RNA (mRNA) ist ein einzelsträngiges Molekül, das die Übertragung der genetischen Information zu den Ribosomen vermittelt, wo die Proteine synthetisiert werden. Bei Eukaryonten wird jedes Gen so transkribiert, dass eine einzelne mRNA entsteht, während bei Prokaryonten ein einziges mRNA-Molekül die genetische Information von mehreren Genen, d. h. von mehreren proteinkodierenden Regionen, tragen kann. Es besteht eine lineare Entsprechung zwischen der Basensequenz eines Gens und der Aminosäuresequenz eines Polypeptids. Jede Gruppe von drei aufeinanderfolgenden Nukleotiden kodiert die Position einer bestimmten Aminosäure in einem Proteinmolekül, und jedes solche Triplett von Basen wird als Codon bezeichnet. Codons werden von Ribosomen (die selbst aus Proteinen und rRNA bestehen), tRNA und Helferproteinen, die Translationsfaktoren genannt werden, in Sequenzen von Aminosäuren übersetzt.

Abb. 4. Einzelsträngige Struktur der RNA mit den vier Nukleotidbasen – Adenin, Uracil, Guanin, Cytosin.

Der Begriff „Transkriptom“ wird häufig verwendet, um den vollständigen Satz aller Ribonukleinsäure (RNA)-Moleküle in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organismus zu bezeichnen. Das Transkriptom spiegelt die molekulare Aktivität in Zellen wider, also die Gene, die zu einem bestimmten Zeitpunkt aktiv exprimiert werden. Es umfasst alle Formen von RNA-Molekülen, einschließlich protein-kodierender, nicht-protein-kodierender, alternativ gespleißter, alternativ polyadenylierter, alternativ initiierter, Sense-, Antisense- und RNA-editierter Transkripte. Dementsprechend untersucht die Transkriptomik alle Arten von Transkripten innerhalb einer Zelle oder eines Organismus, einschließlich mRNAs, miRNAs und verschiedener Arten von langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs). Die Transkriptomik umfasst alles, was mit RNAs zu tun hat, wie z. B. ihre Transkriptions- und Expressionsniveaus, Funktionen, Orte, Transport und Abbau. Sie umfasst auch die Strukturen von Transkripten und ihren Elterngenen in Bezug auf Startstellen, 5′- und 3′-Endsequenzen, Spleißmuster und posttranskriptionelle Modifikationen.

Die wichtigsten Studien der Transkriptomik zielen auf:

• Charakterisierung verschiedener Zustände von Zellen (d.h. Entwicklungsstadien), Geweben oder Zellzyklusphasen durch Expressionsmuster;
• Untersuchung der molekularen Mechanismen, die einem Phänotyp zugrunde liegen;
• Identifizierung von Biomarkern, die zwischen dem erkrankten und dem gesunden Zustand unterschiedlich exprimiert werden;
• Differenzierung von Krankheitsstadien oder Subtypen (z. B. Krebsstadien);
• den ursächlichen Zusammenhang zwischen genetischen Varianten und Genexpressionsmustern herzustellen, um die Ätiologie von Krankheiten zu beleuchten.

In den letzten drei Jahrzehnten hat der technologische Fortschritt die Transkriptom-Profilierung revolutioniert und neu definiert, was untersucht werden kann. Die Integration von transkriptomischen Daten mit anderen omics gibt einen zunehmend integrierten Blick auf zelluläre Komplexitäten, was ganzheitliche Ansätze in der biomedizinischen Forschung erleichtert.

Die wichtigsten Techniken, die für Transkriptom-Studien eingesetzt werden, sind:

• Expressed Sequence Tag (EST)-basierte Methoden
• SAGE
• Hybridisierungs-basierter Microarray
• Real-Time PCR
• NGS-basierte RNA-Sequenzierungsmethoden (RNA-seq),
• RNA-Interferenz
• Bioinformatik-Tools für die Transkriptomanalyse.

Die Auswahl der Technik ist abhängig von Kosteneffizienz, Empfindlichkeit, hohem Durchsatz und minimaler Konzentration der Ausgangs-RNA. Die Methodik umfasst die RNA-Isolierung, -Reinigung, -Quantifizierung, den Aufbau einer cDNA-Bibliothek und die Hochdurchsatz-Sequenzierung.

• Expressed Sequence Tag (EST)-basierte Methoden – Expressed Sequence Tags (ESTs) sind relativ kurze DNA-Sequenzen (in der Regel 200-300 Nukleotide), die üblicherweise von den 3′-Enden von cDNA-Klonen erzeugt werden, von denen PCR-Primer abgeleitet und zum Nachweis der spezifischen kodierenden Sequenz in genomischer DNA verwendet werden können. Die Sequenzierung der ESTs gibt einen Überblick über das Expressionsniveau des Gens. Da immer mehr EST-Daten öffentlich verfügbar sind, hat sich die Verwendung von ESTs auf andere Bereiche ausgeweitet, wie z. B. die Entdeckung von genetischen Markern in silico, die Entdeckung von Genen in silico, die Konstruktion von Genmodellen, die Vorhersage von alternativem Spleißen, die Genomannotation, die Erstellung von Expressionsprofilen und die vergleichende Genomik. Im Vergleich zur Ganzgenomsequenzierung ist die EST-Technologie einfacher und weniger kostspielig, insbesondere bei großen Genomen. Es gibt EST-Datenbanken wie dbEST (NCBI EST) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/dbest/), die Sequenzdaten und andere Informationen zu „Single-Pass“ cDNA-Sequenzen oder „Expressed Sequence Tags“ aus einer Reihe von Organismen enthalten und somit als Referenz für das Expressionsprofil eines Organismus dienen.
• Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) ist eine transkriptomische Technik, die von Wissenschaftlern verwendet wird, um eine Momentaufnahme der Boten-RNA-Population in einer Probe von Interesse in Form von kleinen Tags zu erstellen, die Fragmenten dieser Transkripte entsprechen. Diese Technik hat gegenüber EST den Vorteil, dass nur kurze „Tags“ von nur etwa 15 Basen sequenziert werden. Die erzeugten kurzen Fragmente werden dann zusammengefügt und sequenziert. Ein Pool von cDNA kann einem Hochdurchsatz-NGS, bekannt als RNA-seq, zur Quantifizierung, Entdeckung neuer ESTs und Profilierung von RNAs unterzogen werden.
• Ein DNA-Chip, Gen-Chip, Biochip oder Microarray ist eine Sammlung von DNA-, cDNA-, Oligonukleotidspots, die auf einem festen Träger wie einem Glas- oder Siliziumchip angebracht sind. Durch diese auf Hybridisierung basierende Methode wird das Expressionsniveau von Tausenden von Genen gleichzeitig überwacht. Die größte Einschränkung dieser Technologie besteht darin, dass Genomsequenzinformationen vorausgesetzt werden und auch ein höherer Hintergrund mit der Hybridisierungstechnik verbunden ist.
• Die quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) ist eine Art der PCR zur zuverlässigen Quantifizierung von mRNA mit geringer Abundanz oder von Transkripten mit geringer Kopienzahl. Die wichtigsten Vorteile dieser Technik sind die hohe Sensitivität, die bessere Reproduzierbarkeit und der große dynamische Quantifizierungsbereich. Sie erleichtert Genexpressions- und Regulationsstudien sogar in einer einzelnen Zelle aufgrund ihrer exponentiellen Amplifikationsfähigkeit. Die Verfügbarkeit von verschiedenen Arten von Fluoreszenz-Monitoring-Systemen, die mit der PCR verbunden sind, führte zu ihrer Beliebtheit für Genexpressionsstudien. Die Probleme der unspezifischen Amplifikation und der Bildung von Primer-Dimeren sind einige der Einschränkungen der qRT-PCR.
• Die RNA-Sequenzierung ist eine der fortschrittlichsten Hochdurchsatztechnologien für die Transkriptomik. RNA-seq, auch bekannt als Whole-Transcriptome Shotgun Sequencing, nutzt NGS-Tools. Die Vorteile der RNA-seq sind, dass sie nicht auf die Verfügbarkeit der Genomsequenz angewiesen ist, keine oberen Quantifizierungsgrenzen hat, eine hohe Reproduzierbarkeit aufweist und einen großen dynamischen Nachweisbereich besitzt.

Der Fortschritt der Transkriptomik führte zu einer Reihe von biologischen Entdeckungen. Diese Omic-Technologie legte den Grundstein für die ersten echten Multi-omic-Studien, die auf dem Vergleich zwischen DNA-Sequenz und mRNA-Expression basieren. Heutzutage wird die Transkriptionsanalyse von den meisten Biologen immer noch häufiger eingesetzt, da die gewonnenen Daten immer noch einfacher zu analysieren und weiterzugeben sind als die „nachgeschalteten Omics“ wie Proteomics und Metabolomics. In jüngerer Zeit erlebt die Transkriptomik ein zweites Revival, da sie in vielen Fällen auf einzelne Zellen anwendbar ist.

Proteomics

Proteine steuern die zelluläre Struktur und Aktivität, liefern die Mechanismen für die Signalübertragung zwischen Zellen und Geweben und katalysieren chemische Reaktionen, die den Stoffwechsel unterstützen. Die Proteinstruktur diktiert die Funktion (oder Dysfunktion). Proteine können die Grundursache von Krankheiten sein (wie Alzheimer oder Chorea Huntington), und sie können zur Heilung eingesetzt werden (z. B. werden Antikörper als Therapeutika gegen virale und bakterielle Infektionen eingesetzt). Die Menge aller exprimierten Proteine in einem biologischen System unter bestimmten, definierten Bedingungen wird als Proteom bezeichnet. Das Wort „Proteom“ ist eine Kombination aus Protein und Genom und wurde 1994 von Mark Wilkins geprägt.
Das Hauptziel der Proteomik ist eine groß angelegte experimentelle Analyse der Struktur und Funktion dieser gesamten Menge von Proteinen, die von einem lebenden Organismus produziert werden. Der Begriff „Proteomik“ tauchte erstmals 1997 auf und bezieht sich auf eine Kerntechnologie in systembiologischen Ansätzen, die das Proteom untersucht. Die Funktion von Zellen ist abhängig von den Proteinen, die im intra- und interzellulären Raum vorhanden sind, und von deren Häufigkeit. Die Synthese von Proteinen in der Zelle basiert auf mRNA-Vorläufern, aber es ist unmöglich, die Abundanz bestimmter Proteine nur aufgrund der Analyse der Genexpression vorherzusagen. Der Grund dafür ist, dass native Proteine posttranslationale Modifikationen (PTMs) oder Veränderungen als Reaktion auf Veränderungen in der Umgebung erfahren. Das Proteom ist ein dynamisches Spiegelbild sowohl der Gene als auch der Umwelt und stellt eine wertvolle Quelle für die Entdeckung von Biomarkern dar, da Proteine höchstwahrscheinlich ubiquitär bei Krankheiten und Krankheitsreaktionen betroffen sind. Die vollständige Charakterisierung aller Proteine ist das Ziel der Proteomik seit ihren Anfängen vor fast 25 Jahren. Dabei geht es um mehr als die bloße Identifizierung von Proteinen, die potenziell in einer Probe vorhanden sind, sondern auch um die Bewertung der Proteinhäufigkeit, der Lokalisierung, der posttranslationalen Modifikationen, der Isoformen und der molekularen Wechselwirkungen. Die Proteomik zielt darauf ab, den Fluss biologischer Informationen durch Proteinwege und -netzwerke zu untersuchen, mit dem letztendlichen Ziel, die funktionelle Bedeutung von Proteinen zu verstehen. Dies erfordert die Entwicklung von Technologien, die ein breites Spektrum von Proteinen in Proben unterschiedlicher Herkunft nachweisen können. In der Proteomik kommen verschiedene Technologien zum Einsatz, die meist in Kombination angewendet werden, zum Beispiel ein- oder zweidimensionale Gelelektrophorese mit Massenspektrometrie (MS) oder Flüssigkeitschromatographie und MS.
Die konventionellen Techniken zur Isolierung und Reinigung von Proteinen basieren auf Chromatographie, wie z. B. Ionenaustauschchromatographie (IEC), Hydroxyapatit, Größenausschlusschromatographie (SEC) und Affinitätschromatographie. Für die Analyse selektiver Proteine können Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) und Western Blotting eingesetzt werden. Diese Techniken können für die Analyse einzelner Proteine eingesetzt werden, sie können jedoch nicht das Proteinexpressionsniveau bestimmen. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), zweidimensionale Gelelektrophorese (2-DE) und zweidimensionale differentielle Gelelektrophorese (2D-DIGE) werden zur Trennung komplexer Proteinproben verwendet.

• Die Massenspektrometrie (MS) ermöglicht die Analyse von Proteomen und ist normalerweise die bevorzugte Methode zur Identifizierung von Proteinen in biologischen Systemen. Die drei Hauptanwendungen der MS in der Proteomik sind: Katalogisierung der Proteinexpression, Definition von Proteininteraktionen und Identifizierung von Stellen der Proteinmodifikation. Die Massenspektrometrie misst das Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) von Ionen in der Gasphase. Massenspektrometer bestehen aus einer Ionenquelle, die Analytmoleküle in Gasphasen-Ionen umwandelt, einem Massenanalysator, der ionisierte Analyten basierend auf dem m/z-Verhältnis trennt, und einem Detektor, der die Anzahl der Ionen bei jedem m/z-Wert aufzeichnet. Die Entwicklung der Elektrospray-Ionisation (ESI) und der Matrix-unterstützten Laser-Desorption/Ionisation (MALDI), den beiden weichen Ionisierungstechniken, die Peptide oder Proteine ionisieren können, revolutionierte die Proteinanalyse mit MS. Der Massenanalysator ist das Herzstück der MS-Technologie. Für die Proteomics-Forschung werden üblicherweise vier Arten von Massenanalysatoren verwendet: Quadrupol (Q), Ionenfalle (Quadrupol-Ionenfalle, QIT; lineare Ionenfalle, LIT oder LTQ), Flugzeit-Massenanalysator (TOF) und Fourier-Transformations-Ionenzyklotronresonanz-Massenanalysator (FTICR). Sie unterscheiden sich in ihren physikalischen Prinzipien und analytischen Leistungen. „Hybrid“-Instrumente wurden entwickelt, um die Fähigkeiten verschiedener Massenanalysatoren zu kombinieren und umfassen den Q-Q-Q, Q-Q-LIT, Q-TOF, TOF-TOF und LTQ-FTICR.
• Tandem-Massenspektrometrie ist ein zusätzliches experimentelles Verfahren, das auch als MS/MS oder MS2 bezeichnet wird. Dies ist eine Schlüsseltechnik für die Protein- oder Peptidsequenzierung und PTM-Analyse, bei der zwei oder mehr Massenspektrometer gekoppelt werden. Die Moleküle einer gegebenen Probe werden ionisiert und das erste Spektrometer (als MS1 bezeichnet) trennt diese Ionen nach ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis (oft als m/z oder m/Q angegeben). Ionen eines bestimmten m/z-Verhältnisses, die vom MS1 kommen, werden ausgewählt und dann dazu gebracht, sich in kleinere Fragment-Ionen aufzuspalten, z. B. durch kollisionsinduzierte Dissoziation (CID), Elektroneneinfangdissoziation (ECD), Elektronentransferdissoziation (ETD), Ionen-Molekül-Reaktion oder Photodissoziation. Diese Fragmente werden dann in das zweite Massenspektrometer (MS2) eingeführt, das wiederum die Fragmente nach ihrem m/z-Verhältnis trennt und detektiert. Der Fragmentierungsschritt ermöglicht es, Ionen zu identifizieren und zu trennen, die in regulären Massenspektrometern sehr ähnliche m/z-Verhältnisse haben.
  Die Komplexität der biologischen Systeme erfordert, dass das Proteom vor der Analyse aufgetrennt wird. Sowohl gelchromatographie- als auch flüssigchromatographie-basierte Trennungen haben sich in dieser Hinsicht als nützlich erwiesen. Typischerweise werden Proteine nach diesen umfangreichen Auftrennungen durch MS-Analyse von entweder intaktem Protein (top-down) oder enzymatisch verdauten Proteinpeptiden (bottom-up) charakterisiert. Die Identifizierung der Proteine erfolgt durch den Vergleich der gemessenen Massen der intakten Proteine (top-down) oder der verdauten Proteinpeptide (bottom-up) mit den berechneten Massen aus den Genomdaten.
• Isobaric Taq Labelling (ITL) ist eine häufig verwendete Methode zur Quantifizierung von Proteinen. In der Proteomik ist die Quantifizierung der Proteinhäufigkeit ein wichtiger Schwerpunkt. Proteinexpressionsniveaus stellen das Gleichgewicht zwischen Translation und Abbau von Proteinen in Zellen dar. Es wird daher angenommen, dass die Abundanz eines bestimmten Proteins mit seiner Rolle in der Zellfunktion zusammenhängt. ITL bietet die Möglichkeit der gleichzeitigen Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen aus mehreren Proben in einer einzigen Analyse. Um die Menge der Proteine in einer bestimmten Probe zu messen, werden Peptide mit chemischen Markierungen (Tags) versehen, die die gleiche Struktur und nominelle Masse haben, sich aber in der Verteilung der schweren Isotope in ihrer Struktur unterscheiden. Diese Markierungen, die gemeinhin als Tandem-Massen-Tags bezeichnet werden, sind so konzipiert, dass das Massen-Tag bei der Tandem-Massenspektrometrie durch kollisionsinduzierte Dissoziation (HCD) mit höherer Energie an einer spezifischen Linker-Region gespalten wird, wodurch Reporter-Ionen mit unterschiedlichen Massen entstehen. Die Proteinquantifizierung erfolgt durch den Vergleich der Intensitäten der Reporter-Ionen in den MS/MS-Spektren. Weitere quantitative Techniken sind die ICAT-Markierung und die stabile Isotopenmarkierung mit Aminosäuren in Zellkultur (SILAC). Die ICAT hat auch die Palette der analysierbaren Proteine erweitert und ermöglicht die genaue Quantifizierung und Sequenzidentifizierung von Proteinen aus komplexen Gemischen. SILAC ist ein MS-basierter Ansatz für quantitative Proteomik, der auf der metabolischen Markierung des gesamten zellulären Proteoms beruht. Die Proteome verschiedener in Zellkultur gewachsener Zellen werden mit „leichter“ oder „schwerer“ Form von Aminosäuren markiert und durch MS differenziert.
• Röntgenkristallographie und Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) sind zwei wichtige Hochdurchsatztechniken, die die dreidimensionale (3D) Struktur von Proteinen liefern, die für das Verständnis ihrer biologischen Funktion hilfreich sein könnte. Mit der Unterstützung von Hochdurchsatztechnologien wird ein riesiges Volumen an Proteomics-Daten gesammelt. Bioinformatik-Datenbanken werden eingerichtet, um die enormen Datenmengen zu handhaben und zu speichern. Verschiedene Bioinformatik-Tools werden für die Vorhersage von 3D-Strukturen, die Analyse von Proteindomänen und -motiven, die schnelle Analyse von Protein-Protein-Interaktionen und die Datenanalyse von MS entwickelt. Die Alignment-Tools sind hilfreich für das Sequenz- und Struktur-Alignment, um die evolutionäre Beziehung zu entdecken. Die Proteomanalyse bietet eine vollständige Darstellung der strukturellen und funktionellen Informationen der Zelle sowie des Reaktionsmechanismus der Zelle auf verschiedene Arten von Stress und Medikamenten unter Verwendung einzelner oder mehrerer Proteomics-Techniken. Die wichtigsten Techniken, die in der Proteomforschung eingesetzt werden, sind in Abb. 5 dargestellt.

Abb. 5. Methoden, die im Bereich Proteomics für großflächige Untersuchungen von Proteinen eingesetzt werden

Metabolomics

Das Metabolom wurde erstmals 1998 von Oliver und Kollegen im Rahmen ihrer Pionierarbeit zum Hefestoffwechsel als die Gesamtheit der kleinen Moleküle in einem biologischen System oder einer Flüssigkeit beschrieben. Es umfasst alle kleinen Moleküle wie Lipide, Aminosäuren, Fettsäuren, Kohlenhydrate und Vitamine, die als Metabolite bezeichnet werden und als Ergebnis des zellulären Stoffwechsels entstehen. Sie nehmen an den Stoffwechselprozessen in den Zellen teil, indem sie mit anderen biologischen Molekülen interagieren und Stoffwechselwegen folgen. Der Status der Metaboliten in den biologischen Systemen ist hochgradig variabel und zeitabhängig, und Veränderungen in den Konzentrationen der wichtigsten Metaboliten werden aufgrund von genetischen, Umwelt-, Ernährungs- und anderen Faktoren beobachtet.
Metabolomics (Metabolomanalyse) ist die jüngste Strategie unter den Omics, die systematisch die in einer Zelle, einem Gewebe, einem Organ, einer Bioflüssigkeit oder einem Organismus vorhandenen Metaboliten zu einem bestimmten Zeitpunkt identifiziert und quantifiziert. Die in der Metabolomik verwendeten Methoden zielen darauf ab, niedermolekulare Verbindungen (Metaboliten) mit unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften wie Verbindungspolarität, funktionelle Gruppen und strukturelle Ähnlichkeit zu messen. Anhand dieser Eigenschaften wird das Metabolom in Teilmengen verschiedener Metaboliten unterteilt und zu deren Untersuchung werden in der Metabolomik für jeden Molekültyp optimierte analytische Verfahren eingesetzt.
Die Metabolite sind Produkte von biochemischen Reaktionen, die unter Beteiligung von Proteinen des Proteoms ablaufen (Abb. 6). Ihre Konzentrationen sind abhängig von den Wechselwirkungen anderer Prozesse (Transkription, Translation, zelluläre Signalübertragung usw.), sie wurden als Reporter für den Metabolismus bei PD untersucht. Dieser wiederum bestimmt die biologische Struktur und Funktion des endgültigen Phänotyps des Organismus. Daher wirken sich Veränderungen in der Genexpression, der Funktion von Proteinen und der Umwelt direkt auf die Konzentration von Metaboliten in einem biologischen System aus. Das Metabolom besteht aus einer relativ kleinen Anzahl (ca. 5000), aber unterschiedlichen Arten von Metaboliten, die das Metabolom physikalisch und chemisch komplexer machen als Genom, Transkriptom und Proteom. Außerdem bestehen das Genom, Transkriptom und Proteom aus Verbindungen, die Teil des Metaboloms sind. Außerdem sind die Komponenten des Metaboloms im Vergleich zu Genom, Transkriptom und Proteom zwischen Organismen hoch konserviert, weshalb man davon ausgeht, dass das Metabolom evolutionär der älteste Teil der Zelle ist.

Abb.6. Integrationsansätze Daten in der Systembiologie

Die Metabolomik ist die am besten geeignete Strategie zur Bestimmung von krankheitsassoziierten Biomarkern. Die umfassende Untersuchung von Metaboliten ist ein wünschenswertes Werkzeug für die Diagnose von Krankheiten, die Identifizierung neuer therapeutischer Ziele und die Ermöglichung geeigneter Behandlungen. Die Analyse einer kleinen Anzahl von Metaboliten wird seit Jahrzehnten in der Krankheitsdiagnostik eingesetzt, z. B. bei der Entwicklung von Blutzuckerteststreifen in den 1950er Jahren zum Testen auf Diabetes oder bei der Quantifizierung von Phenylalanin bei Neugeborenen zum Screening auf Phenylketonurie.

Metabolomics-Analysen können in zwei Hauptansätze eingeteilt werden: gezielte und ungezielte Metabolomics. Bei der gezielten Analyse sind die Metaboliten, die bestimmt werden, bekannt und repräsentieren spezifische Stoffwechselwege oder Molekülklassen. Im Gegensatz dazu zielt die ungezielte Metabolomik darauf ab, so viele Metaboliten wie möglich zu quantifizieren und zu identifizieren. Die gezielte Metabolomik bezieht sich auf die absolute Quantifizierung (nM oder mg/ml) und verwendet einen internen Standard und eine halbquantitative oder quantitative Analyse, um bekannte Verbindungen, die mit bestimmten Stoffwechselwegen in Verbindung stehen, zu erkennen. Der ungezielte Ansatz misst alle vorhandenen Metaboliten in einer Probe und wendet relative Quantifizierung (Fold Change) und Vergleiche zwischen Proben an. Die Schlüsselrolle, die Metabolomics bei der Multi-omics-Integration und der Systemmodellierung spielt, ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass sie quantitativ sein kann. Systemmodellierung kann nicht ohne genaue Werte oder genaue Konzentrationen als Eingaben durchgeführt werden und ebenso können Systemmodelle nicht ohne genaue, quantitative Konzentrationen als Ausgaben leicht verifiziert werden. Metabolomics kann beides liefern (quantitative Eingangs- und Ausgangsdaten), was sie für Systemmodellierer äußerst wertvoll macht.

Aufgrund der enormen chemischen Komplexität des Metaboloms kann es nicht mit einer einzigen Technologie umfassend untersucht werden. Die früheste Anwendung der Metabolomik geht auf die 1970er Jahre zurück, als die Gaschromatographie-Massenspektrometrie zur Erstellung von Metabolitenprofilen klinischer Urinproben verwendet wurde. Nicholson und andere erstellten in den 1980er Jahren ein Profil von klinischen Proben durch die Anwendung der Kernspinresonanzspektroskopie. Massenspektrometrie gekoppelt mit Flüssigchromatographie und Kapillarelektrophorese werden ebenfalls in der Metabolomik eingesetzt, um die verfügbaren analytischen Techniken zu ergänzen. Einige der analytischen Instrumente, die für die Metabolomics-Forschung verwendet werden, werden häufig und routinemäßig eingesetzt, während andere spezifische Aufgaben haben und weniger häufig eingesetzt werden.

• Gaschromatographie – Massenspektrometrie (GC-MS) – Eine der am häufigsten verwendeten Methoden in der Metabolomik ist GC-MS. Wie der Name schon sagt, vereinigt GC-MS zwei Techniken zu einer einzigen Methode für die Analyse von Chemikaliengemischen. Die Gaschromatographie trennt die Komponenten einer Mischung und die Massenspektroskopie charakterisiert jede der Komponenten einzeln. Durch die Kombination der beiden Techniken kann jeder Metabolit in einer Probe sowohl qualitativ als auch quantitativ bewertet werden. Diese chromatographische Technik wird verwendet, um Metaboliten zu untersuchen, die einen niedrigen Siedepunkt haben und die in der Gasphase im Temperaturbereich von 50-350°C vorhanden sind. Diese Metaboliten können in ihrer biologisch nativen Form einen niedrigen Siedepunkt haben oder der Siedepunkt eines Metaboliten kann durch eine chemische Veränderung, auch chemische Derivatisierung genannt, herabgesetzt werden. Die Probe, die Metaboliten enthält, wird in eine mobile Phase eingebracht (injiziert), die in der Gaschromatographie ein inertes Gas wie Helium ist. Die mobile Phase führt das Probengemisch durch eine so genannte stationäre Phase. Die Metaboliten werden aufgrund ihrer Adsorption an der stationären Phase getrennt. Die stationäre Phase befindet sich in der Regel in einer Glas- oder Edelstahlsäule und stellt eine Chemikalie dar, die selektiv Komponenten in einem Probengemisch adsorbieren kann. Durch Veränderung der Eigenschaften der mobilen Phase und der stationären Phase können verschiedene Chemikaliengemische getrennt werden. Wenn die einzelnen Metaboliten von der GC-Säule eluieren, gelangen sie in den Elektronenionisationsdetektor (Massenspektrometer). Dort werden sie mit einem Strom von hochenergetischen Elektronen (70 eV) beschossen, wodurch sie in Fragmente zerfallen. Diese Fragmente können große oder kleine Teile der ursprünglichen Moleküle sein. Das Massenspektrum, das man für eine bestimmte chemische Verbindung erhält, ist im Grunde jedes Mal gleich. Daher ist das Massenspektrum ein Fingerabdruck für das Molekül. Dieser Fingerabdruck kann verwendet werden, um die Verbindung zu identifizieren.
• Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) – Der Hauptunterschied zwischen GC-MS und LC-MS besteht darin, dass bei der Flüssigkeitschromatographie (LC) die mobile Phase ein Lösungsmittel ist. Die LC trennt Gemische von Metaboliten, die in flüssiger Form vorliegen, meist mit Methanol, Acetonitril und Wasser. Durch die Verwendung verschiedener Packungen von Säulen (unterschiedliche stationäre Phase) können mit hoher Effizienz kleine Mengen komplexer Gemische getrennt werden. Die in der HPLC verwendeten Säulen bestehen aus Octadecyl- (C18), Octyl- (C8), Cyano-, Amino- und Phenyl-Packungen und haben in der Regel eine Länge von 50 mm bis 300 mm. Die Säulen werden auf der Grundlage der Art der zu trennenden Verbindungen verwendet. Die Flüssigkeit, die die Mischung der Komponenten enthält, wird in die Ionenquelle des Massenspektrometers überführt, wo der Prozess der Ionisierung stattfindet und Tröpfchen mit einem Überschuss an positiver oder negativer elektrischer Ladung gebildet werden. Die Ionisierung kann durch den Einsatz verschiedener Arten von Ionisationsquellen und Schnittstellen erreicht werden. Nach der Ionisierung werden die Ionen in den Massenanalysator transferiert, wo die Trennung der Ionen nach ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) erfolgt.
• Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) – diese Analysetechnik wird auch Kapillarzonen-Elektrophorese-Massenspektrometrie genannt. CE-MS beinhaltet die Trennung von ionischen Spezies in der Flüssigphase durch Anlegen von Hochspannungen und ist in der Regel mit einer Elektrospray-Massenspektrometrie gekoppelt. Die Kapillarelektrophorese trennt Metaboliten aufgrund ihrer elektrophoretischen Mobilität in einer flüssigen Elektrolytlösung, die in einem elektrischen Feld arbeitet. Die elektrophoretische Mobilität ist abhängig von der Ladung und Größe des Metaboliten, so dass eine Trennung von Metaboliten mit unterschiedlichen Größen und/oder Ladungen möglich ist. Alle Metaboliten müssen geladen sein, damit eine Mobilität stattfinden kann.
  Bei GC-MS, LC-MS und CE-MS erfolgt eine Abtrennung von Metaboliten vor deren Nachweis mit Massenspektrometrie. Diese Besonderheit bietet die Möglichkeit, Metaboliten in niedrigen Konzentrationen, üblicherweise Nanomol/Liter (nM/L) oder Mikromol/Liter (µM/L), nachzuweisen.
• Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) ist neben der Massenspektrometrie das am häufigsten verwendete analytische Instrument in der Metabolomics-Forschung. Die NMR-Spektroskopie nutzt die magnetischen Eigenschaften der Atomkerne in einem Metaboliten. Nur einige Atome sind NMR-aktiv und umfassen 1H, 13C und 31P; Proton (1H). Die Technik funktioniert, indem eine flüssige Probe in ein Röhrchen mit kleinem Innendurchmesser (z. B. ein 5 mm-Röhrchen) gegeben wird, oder gelegentlich wird ein Gewebestück direkt mit einem speziellen Probenhalter untersucht. Die Probe wird mit einer Reihe von Radiofrequenzen gepulst, die alle möglichen Energien abdecken, die für die Anregung der ausgewählten Art von Kernen erforderlich sind. Die Kerne absorbieren je nach ihrer chemischen Umgebung Energie bei unterschiedlichen Radiofrequenzen und die Abgabe dieser Energie wird gemessen, wobei ein freier Induktionszerfall (FID) entsteht. Dieser FID wird von einem Zeitbereich-Datensatz in einen Frequenzbereich umgewandelt – unter Verwendung einer Fourier-Transformation – und ein NMR-Spektrum wird als chemische Verschiebung (effektiv die Absorptionsenergie) aufgetragen gegen die Peak-Intensität konstruiert.
• Schwingungsspektroskopische Techniken wie die Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie (FT-IR) und die Raman-Spektroskopie werden zur Analyse der Stoffwechselveränderungen in biologischen Proben eingesetzt. Das Prinzip dieser Techniken basiert auf der Übertragung von ultraviolettem oder infrarotem Licht durch eine Probe, oder manchmal auch auf der Reflexion des Lichts von der Probe, bevor es detektiert wird. Die Ansätze messen vorwiegend die Schwingungen und Rotationen von Bindungen, die mit verschiedenen chemischen Funktionsgruppen verbunden sind und aus der Wechselwirkung der Probe mit dem ultravioletten oder infraroten Licht resultieren. Diesen Techniken fehlt in der Regel die Spezifität, um jeden Metaboliten einzeln zu detektieren, stattdessen absorbieren bestimmte Teile des Moleküls das ultraviolette oder infrarote Licht bei bestimmten Wellenlängen. Im FT-IR werden beispielsweise C-H-Streckschwingungen, die für Fettsäureketten charakteristisch sind, zwischen dem Wellenzahlbereich 3100 – 2800 cm-1 beobachtet, und der Bereich zwischen 1800 und 1500 cm-1 wird von Amid-I- und Amid-II-Banden dominiert, was auf die Vorherrschaft von entweder Alpha-Helix- oder Beta-Sheet-Strukturen hinweist.

Auf dem Gebiet der Metabolomik werden routinemäßig viele Hunderte von Proben analysiert, wobei in der Regel mindestens mehrere Hundert Metaboliten nachgewiesen werden. Die aus dem Nachweis von Metaboliten in einer gegebenen biologischen Probe gewonnenen Daten werden anschließend mit statistischen multivariaten Methoden (Chemometrie) weiter analysiert, um biologische, physiologische und klinisch relevante Informationen zu extrahieren.

Die Implementierung von Omics-Technologien und die Integration von Omics-Daten wurde für ein breites Spektrum von Forschungsbereichen realisiert, darunter Lebensmittel- und Ernährungswissenschaften, Systemmikrobiologie, Analyse von Mikrobiomen, Genotyp-Phänotyp-Interaktionen, Systembiologie, Naturproduktentdeckung und Krankheitsbiologie. In jüngster Zeit wurden omics-basierte Ansätze durch die Hinzunahme neuartiger Konzepte wie Exposome/Exposomics (Rolle der Umwelt bei menschlichen Krankheiten), Adductomics (Untersuchung von Verbindungen, die DNA binden und Schäden und Mutationen verursachen), Volatilomics (Untersuchung flüchtiger organischer Verbindungen zur Metabolomics/Lipidomics-Analyse), Nutrigenomics (Untersuchung der Auswirkungen von Lebensmitteln auf unsere Gene) usw. erheblich verbessert. Die Omics-Technologien zielen jedoch in erster Linie auf vier Omics-Forschungsfelder – Genomics, Transcriptomics, Proteomics und Metabolomics. Die traditionellen Forschungsfelder wie Genetik, Pharmakogenetik und Toxikogenetik, die das Omics-Konzept nicht anwenden, liefern die statischen Sequenzen von Genen und Proteinen. Im Gegensatz dazu bieten die Omics-Technologien die gleichzeitige Messung der Anzahl von Proteinen, Genen und Metaboliten und ermöglichen die Gewinnung großer Datenmengen in kurzer Zeit. Die kollektive Analyse der biologischen Prozesse in einem biologischen System, die durch alle Omics bereitgestellt wird, ist ein Vorteil gegenüber den bisherigen traditionellen Methoden, um das Gesamtbild des biologischen Systems besser zu verstehen. Obwohl große Omics-Daten immer besser zugänglich sind, ist die Integration von echten Multi-Omics-Daten immer noch eine große Herausforderung. Das liegt daran, dass viele der spezifischen Analysewerkzeuge und experimentellen Designs, die konventionell für einzelne Omics-Disziplinen (Genomics, Transcriptomics und Proteomics) verwendet werden, nicht ausreichend geeignet sind, um zuverlässige Vergleiche und Integration über mehrere Omics-Disziplinen hinweg zu ermöglichen. Zum Beispiel sind die Methoden zur Probensammlung und -lagerung sowie die Menge und Art der biologischen Proben, die in Genomics-Studien benötigt werden, oft nicht mit Metabolomics, Proteomics oder Transcriptomics kompatibel. Bei der Datenerhebung gibt es viele Probleme, wie z. B. Datenheterogenität, geringe Stichprobengröße im Vergleich zu vielen Parametern, Bestätigung und Interpretation der Daten aufgrund vieler Wechselwirkungen im biologischen System und unzureichender Informationen über diese Systeme. Fast in allen Omics-Experimenten werden hunderte bis tausende von Zielmolekülen und Variablen gemessen (Metabolite, Proteine, Gene, Transkripte und SNPs). Dies erfordert die Untersuchung einer ausreichenden Anzahl von biologischen Proben, um statistisch zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Außerdem müssen die Multi-omics-Daten aus demselben Probensatz generiert werden, um den direkten Vergleich unter gleichen Bedingungen zu ermöglichen. Dies ist jedoch aufgrund von Einschränkungen bei der Probenbiomasse, dem Probenzugang oder den finanziellen Ressourcen nicht immer möglich. In einzelnen Omics-Experimenten werden oft größere Probenmengen benötigt, um dieses Problem zu überwinden. Darüber hinaus müssen die integrierten Multi-omics-Daten als einzelne Datensätze analysiert werden, bevor sie in omics-spezifischen Datenbanken abgelegt werden, um sie öffentlich zugänglich zu machen. Diese Probleme unterstreichen, dass für die qualitativ hochwertigen Large-Scale-omics-Studien notwendig ist, : 1) ein Experiment richtig zu planen, 2) biologische Proben sorgfältig zu sammeln, vorzubereiten und zu lagern, 3) quantitative Multi-omics-Daten und zugehörige Metadaten sorgfältig zu sammeln, 4) geeignete Werkzeuge für die Integration und Interpretation der Daten zu verwenden.

Einige der Vor- und Nachteile der wichtigsten Omics-Technologien sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Tabelle 1. Vor- und Nachteile der wichtigsten Omics-Forschungstechnologien

Multi-omics-Datensätze können in bestimmten Szenarien eine größere Verständnistiefe bieten, aber das ist nicht ohne Kosten. Diese Studien basieren häufig auf einer großen Anzahl von Vergleichen, dem richtigen Datentyp, relevanten statistischen Analysen, spezifischer Ausrüstung und geschultem Personal sowie erheblichen Investitionen von Zeit und Geld. Bei der Planung eines Experiments muss berücksichtigt werden, welche Arten von Omics-Daten integriert werden können und sollten, um aussagekräftige biologische Erkenntnisse über das untersuchte System zu erhalten. Die Anwendung von Hochdurchsatz-omics-Plattformen ist nicht immer notwendig, um die Forschungsfrage zu beantworten. Die Ergebnisse traditioneller Techniken wie der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), des Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) oder der Immunhistochemie (IHC) können manchmal ausreichen, um ein Verständnis für biologische Mechanismen zu erhalten. Diese Techniken ergänzen oft die Ergebnisse einer größeren Omics-Studie, da sie angewandt werden, um zu verifizieren, dass das signifikante Molekül, das aus Omics-Daten identifiziert wurde, ein echtes positives Ergebnis ist.