Τις τελευταίες δεκαετίες η ταχεία πρόοδος της μοριακής βιολογίας και τα επιτεύγματα σε αυτόν τον επιστημονικό τομέα συνδέονται άμεσα με την πρόοδο στις επιστήμες των υπολογιστών και την ανάπτυξη νέων εργαλείων λογισμικού.

Βιολογικά συστήματα και τεχνολογίες Omics: Η μεγάλη εικόνα

Τις τελευταίες δεκαετίες η ταχεία πρόοδος της μοριακής βιολογίας και τα επιτεύγματα σε αυτόν τον επιστημονικό τομέα συνδέονται άμεσα με την πρόοδο στις επιστήμες των υπολογιστών και την ανάπτυξη νέων εργαλείων λογισμικού. Η εφαρμογή διαφόρων τεχνολογιών που σχετίζονται με την τεχνολογία omics (γονιδιωματική, επιγενωμική, μεταγραφική, πρωτεομική, μεταβολική, κ.λπ.) οδηγεί στη συσσώρευση ευέλικτων βιολογικών δεδομένων και η συνδυασμένη ερμηνεία τους ανοίγει νέες δυνατότητες στους επιστήμονες να μετακινηθούν από τη μελέτη απομονωμένων βιολογικών μορίων προς μια ευρεία ανάλυση μεγάλων συνόλων βιολογικών μορίων. Οι βιολογικές επιστήμες έχουν γίνει επιστήμες μεγάλων δεδομένων, οι οποίες έχουν αυξανόμενη σημασία για την επίλυση προβλημάτων που αφορούν την ανθρώπινη υγεία και το περιβάλλον. Οι μεγάλες προκλήσεις των δεδομένων δεν είναι μόνο το μέγεθός τους αλλά και η αυξανόμενη πολυπλοκότητά τους.

Η βιολογία των κυτταρικών συστημάτων έχει αναδειχθεί ως ένα νέο πεδίο διεπιστημονικής μελέτης που έχει κερδίσει τεράστια προσοχή τα τελευταία χρόνια. Παρόλο που ο όρος «βιολογία συστημάτων» έχει χρησιμοποιηθεί με διάφορους τρόπους, είναι γενικά κατανοητό ότι περιγράφεται η έρευνα που συνδυάζει τη βιολογία με φαινομενικά διαφορετικούς κλάδους όπως η φυσική, η βιοχημεία, η μηχανική, η βιοστατιστική, τα μαθηματικά, η επιστήμη των υπολογιστών, η βιοπληροφορική και άλλα. Ο κύριος σκοπός αυτού του διεπιστημονικού πεδίου είναι να αποκτήσει μια παράλληλη εικόνα των βιολογικών συστημάτων σε μοριακό επίπεδο και να κατανοήσει πώς λειτουργούν ως σύνολο αντί για άθροισμα τμημάτων. Διασαφηνίζοντας τους μοριακούς μηχανισμούς και διαδικασίες σε διαφορετικά επίπεδα συστήματος στον οργανισμό ή ένα κύτταρο, θα μπορούσε να προβλεφθεί πώς αυτά τα συστήματα αλλάζουν με την πάροδο του χρόνου και υπό διαφορετικές συνθήκες. Η μεγάλη ποσότητα πληροφοριών που λαμβάνονται σε μοριακές βάσεις κυτταρικής φυσιολογίας και οργάνωσης θα μπορούσε να δώσει λύσεις σχετικά με ασθένειες, τοξικότητες, θεραπείες, ανακάλυψη φαρμάκων κ.λπ.

Η βιολογία συστημάτων ξεκίνησε ως ξεχωριστός κλάδος τη δεκαετία του 1950 με το έργο των θεωρητικών συστημάτων των Mihajlo Mesarovic και Ludwig von Bertalanffy στη γενική θεωρία συστημάτων. Η βασική ιδέα αυτής της θεωρίας είναι ότι η δυναμική οποιουδήποτε συστήματος είναι αποτέλεσμα των σχέσεων μεταξύ των ξεχωριστών μονάδων του που καθορίζουν τη λειτουργία του. Εκείνη την εποχή, μελετώντας διεξοδικά τα ένζυμα και την κινητική των ενζυμικών αντιδράσεων, οι βιοχημικοί, οπαδοί της θεωρίας του συστήματος, προσπάθησαν να εξετάσουν τη συμπεριφορά των βιοχημικών οδών ως δίκτυο αντί για ένα σύνολο των μερών του. Απομακρυνόμενος από τη βιοχημική περιοχή, ο Reinhart Heinrich ανέπτυξε θεωρητικές προσεγγίσεις για την περιγραφή και την ποσοτική διερεύνηση των οδών σηματοδότησης και ανέπτυξε μια θεωρία μεταβολικού ελέγχου. Η ανάγκη για μια ολοκληρωμένη προσέγγιση για μια πιο λεπτομερή μελέτη και κατανόηση των πολύπλοκων βιολογικών διεργασιών έγινε εμφανής.

Η βιολογία των συστημάτων εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τις βιολογικές πληροφορίες που λαμβάνονται από τη μοριακή βιολογία και / ή μεμονωμένες προσεγγίσεις ομικών, αλλά συχνά είναι σε μεγάλο βαθμό υποθετικές ή αναγωγικές. Στην αναγωγική προσέγγιση μελετώνται οι λειτουργικές ιδιότητες των επιμέρους μοριακών συστατικών στα πολύπλοκα βιολογικά συστήματα. Μετά την ολοκλήρωση του Προγράμματος Ανθρώπινου Γονιδιώματος, η σύγχρονη επιστήμη αναπτύχθηκε πέρα ​​από τη γονιδιοκεντρική άποψη της προηγούμενης γονιδιωματικής εποχής. Αυτή η περίοδος που χαρακτηρίζεται ως μεταγενετική εποχή χαρακτηρίζεται από σημαντικές αλλαγές στην διεξαγωγή της επιστημονικής έρευνας και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων και σύμφωνα με τον Bloom αυτό είναι το τέλος του «αφελούς αναγωγισμού». Παρ ‘όλα αυτά, το γεγονός πως αυτές οι κλασικές μέθοδοι από μόνες τους δεν μπορούν να παρέχουν πλήρη κατανόηση των ζωντανών οργανισμών, θα συνεχίσουν να αποτελούν ουσιαστικό στοιχείο κάθε βιολογικής έρευνας. Σε αυτό το πλαίσιο, η βιολογία των συστημάτων προκάλεσε τη θεμελιώδη αλλαγή στις παραδοσιακές προσεγγίσεις. Χρησιμοποιεί μια νέα ολιστική προσέγγιση που δημιουργεί υποθέσεις, εστιάζει στη μελέτη των υποσυστημάτων, η οποία επιτρέπει βαθύτερη κατανόηση της όλης διαδικασίας. Η πορεία χρήσης γαλακτόζης (GAL) του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae είναι ένα παράδειγμα της εφαρμογής της προσέγγισης Systems biology για την ανάγνωση και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων που προκύπτουν από την αναγωγική προσέγγιση (ένα γονίδιο/μία πρωτεΐνη κάθε φορά). Με βάση πειραματικά δεδομένα που ελήφθησαν από αναλύσεις πρωτεΐνης και RNA, καθώς και αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης -πρωτεΐνης και πρωτεΐνης -DNA και την ενσωμάτωσή τους σε ένα ενιαίο μοντέλο, δόθηκε νέα υπόθεση για τη ρύθμιση της οδού GAL, η οποία επαληθεύτηκε πειραματικά στη συνέχεια.

Με τη χρήση υπολογιστικών και μαθηματικών εργαλείων συλλέγεται και ενσωματώνεται μεγάλη ποσότητα πειραματικών δεδομένων από τη βιολογία των συστημάτων για την αποκάλυψη άγνωστων προτύπων και δημιουργίας υποθέσεων. Αυτή είναι μια σημαντική στρατηγική για να αποκτηθούν νέες ιδέες για τα βιολογικά συστήματα και επίσης να βοηθηθεί ο πειραματικό σχεδιασμό.

Η προσέγγιση των βιολογικών συστημάτων σε επίπεδο συστημάτων αποσκοπεί στην αποσαφήνιση των ακόλουθων τριών θεμάτων στο πλαίσιο του μοριακού δικτύου: i) ποια είναι τα επιμέρους συστατικά του συστήματος. ii) πώς λειτουργούν χωριστά και iii) πώς συνεργάζονται αυτά τα στοιχεία για να ολοκληρώσουν μια εργασία (3). Στο πλαίσιο των μοριακών δικτύων, ο βασικός σκοπός της βιολογίας των συστημάτων μπορεί να συνοψιστεί ως εξής: (i) κατανόηση της δομής όλων των συστατικών ενός κυττάρου / οργανισμού μέχρι μοριακού επιπέδου, (ii) ικανότητα πρόβλεψης μελλοντική κατάσταση του κυττάρου / οργανισμού κάτω από ένα φυσιολογικό περιβάλλον, iii) την ικανότητα πρόβλεψης των αποκρίσεων εξόδου για ένα δεδομένο ερέθισμα εισόδου, και iv) την ικανότητα εκτίμησης των αλλαγών στη συμπεριφορά του συστήματος μετά από διαταραχή των συστατικών ή του περιβάλλοντος.

Ο όρος «συστήματα» στη βιολογία των συστημάτων ορίζει διαφορετικό εύρος πολυπλοκότητας που κυμαίνεται από δύο μακρομόρια που αλληλεπιδρούν για την εκτέλεση μιας συγκεκριμένης εργασίας σε ολόκληρους οργανισμούς (Εικ.1).

Εικόνα 1. Κύριοι τύποι βιολογικών δικτύων. A. Αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών- πρωτεϊνών, B. Ρυθμιστικό δίκτυο γονιδίων, C. Μεταβολικά δίκτυα, D. Διαφορετικού τύποι δικτύων στο κύτταρο (9).

Έτσι, η βιολογία των συστημάτων μοιράζεται έναν κοινό επιστημονικό στόχο με την επιστήμη της φυσιολογίας που είναι αφιερωμένη στη μελέτη της ολοκληρωμένης λειτουργίας ολόκληρου του πολύπλοκου βιολογικού συστήματος. Οι οργανισμοί είναι πολύ περισσότεροι από το άθροισμα των μερών τους και η πολυπλοκότητα των φυσιολογικών διεργασιών δεν μπορεί να γίνει κατανοητή απλώς μελετώντας πώς λειτουργούν τα συστατικά μεμονωμένα. Για παράδειγμα, τα γονίδια κωδικοποιούν την κύρια δομή των κυτταρικών πρωτεϊνών που με τη σειρά τους εκτελούν συγκεκριμένες λειτουργίες που υποστηρίζουν τον μεταβολισμό των κυττάρων και τη φυσιολογία και την ανάπτυξη του οργανισμού. Ταυτόχρονα, οι πρωτεΐνες σε κάθε κύτταρο δεν δρουν μεμονωμένα αλλά σε ένα πολύπλοκο δίκτυο του οποίου είναι σημαντικό να προσδιοριστούν οι φαινότυποι. Οι περισσότερες βιολογικές διεργασίες είναι πολύ δυναμικές και συχνά περιλαμβάνουν περισσότερους από έναν τύπους μορίων. Ταυτόχρονα, ένας φαινότυπος μπορεί να εξαρτάται από διάφορους μοριακούς και επιγενετικούς μηχανισμούς και ένας τύπος μορίου μπορεί να εμπλέκεται σε διαφορετικούς φαινότυπους. Στην πραγματικότητα, ακόμη και στον ίδιο οργανισμό, μια πρωτεΐνη μπορεί να παίζει διαφορετικούς ρόλους σε διαφορετικά κύτταρα. Οι παράγοντες που επηρεάζουν τη διαδρομή του σήματος μπορεί να προκαλέσουν διάφορες διαφοροποιήσεις σε διαφορετικές κυτταρικές γενεές. Επιπλέον, σε πολυκύτταρους οργανισμούς, τα μεμονωμένα κύτταρα δεν έχουν ύπαρξη ανεξάρτητη από ολόκληρο τον οργανισμό, είναι οντογενετικά συνδεδεμένα.

Ανεξάρτητα από τον κοινό στόχο τους, η βιολογία και η φυσιολογία των συστημάτων χρησιμοποιούν διαφορετικά εργαλεία και πειραματικές προσεγγίσεις, γεγονός που οδηγεί στην απόκτηση διαφορετικού συνόλου πειραματικών δεδομένων. Η διεπιστημονική βιολογία των συστημάτων είναι μια σύγχρονη ταχέως εξελισσόμενη επιστήμη λόγω του ότι χρησιμοποιεί μια ποικιλία μεθόδων και εργαλείων, συμπεριλαμβανομένης της μεγάλης κλίμακας λειτουργικής γονιδιωματικής και άλλων τεχνολογιών omics, βιοπληροφορικής και μοντελοποίησης υπολογιστών, τα οποία δεν αξιοποιούνται από τους φυσιολόγους. Ο ρόλος της υπολογιστικής βιολογίας στη βιολογία των συστημάτων είναι να επεξεργάζεται και να αναλύει τεράστιες ποσότητες εμπειρικών δεδομένων που παράγονται από διαφορετικά επίπεδα omics, τα οποία με τη σειρά τους οδηγούν στην ανακάλυψη βιολογικής γνώσης και στη δημιουργία ερευνητικής υπόθεσης. Η εφαρμογή αναλύσεων πυριτίου και προσομοίωσης δίνει ευκαιρίες για προβλέψεις οι οποίες επιβεβαιώνονται περαιτέρω με πειραματικές δοκιμασίες. Η ταχεία πρόοδος των τεχνολογιών της πληροφορικής, συμπεριλαμβανομένης και της βελτίωσης των δημόσιων βάσεων δεδομένων βιολογικών πληροφοριών, υποστηρίζει επίσης την ανάπτυξη μελετών omics και οδηγεί αντίστοιχα στην πρόοδο της βιολογίας συστημάτων.

Προκειμένου να μελετηθούν συνολικά οι βιολογικές διεργασίες, είναι κρίσιμο να κατανοηθεί πώς τα ξεχωριστά βιολογικά στρώματα (γονιδίωμα, επιγονιδίωμα, μεταγράφημα, πρωτεώμα, μεταβολόμα και ιονώμα) αλληλοσυνδέονται μεταξύ τους σε ένα κυτταρικό σύστημα και πώς λαμβάνει χώρα η ροή των βιολογικών πληροφοριών. Ο συνδυασμός διαφορετικών αναλύσεων omics που χρησιμοποιούν προσέγγιση πολλαπλών omics απαιτούνται για τον σχεδιασμό μιας ακριβούς εικόνας των ζωντανών οργανισμών. Τα δεδομένα μεταγραφικής, πρωτεομικής και μεταβολικής μπορούν να απαντήσουν σε βασικά βιολογικά ερωτήματα σχετικά με την έκφραση μεταγραφών, πρωτεϊνών και μεταβολιτών, ανεξάρτητα, αλλά μια συστηματική πολυ-omics ολοκλήρωση μπορεί να αφομοιώσει, να σχολιάσει και να μοντελοποιήσει αυτά τα μεγάλα σύνολα δεδομένων.

Η μεταφορά γενετικών πληροφοριών σε βιολογικά συστήματα πραγματοποιείται από το DNA στο mRNA στην πρωτεΐνη και αυτό δηλώνεται ως το κεντρικό δόγμα στη μοριακή βιολογία. Οι τρεις κύριες διαδικασίες σε κάθε κύτταρο είναι η αντιγραφή, η μεταγραφή και η μετάφραση. Η συνεχής ροή τους εξασφαλίζει τη διατήρηση και μετατροπή των γενετικών πληροφοριών, που κωδικοποιούνται στο DNA σε γονιδιακά προϊόντα, τα οποία είναι είτε RNA είτε πρωτεΐνες, ανάλογα με το γονίδιο. Η αντιγραφή είναι μια διαδικασία αντιγραφής του DNA ενός κυττάρου και αποτελεί τη βάση για τη βιολογική κληρονομικότητα. Διεξάγεται από το ένζυμο της DNA πολυμεράση που αντιγράφει ένα μόνο γονικό δίκλωνο μόριο DNA σε δύο θυγατρικά δίκλωνα μόρια DNA. Το ένζυμο RNA πολυμεράση δημιουργεί ένα μόριο RNA από το DNA και αυτή η διαδικασία είναι γνωστή ως μεταγραφή. Το νεοσυντιθέμενο μόριο RNA είναι συμπληρωματικό σε ένα τμήμα DNA που κωδικοποιεί γονίδιο. Η μετάφραση παράγει πρωτεΐνη από mRNA. Το ριβόσωμα παράγει μια πολυπεπτιδική αλυσίδα αμινοξέων χρησιμοποιώντας mRNA ως πρότυπο. Η πολυπεπτιδική αλυσίδα διπλώνεται για να γίνει πρωτεΐνη. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, ή εκείνα τα κύτταρα που έχουν πυρήνα, η αντιγραφή και η μεταγραφή λαμβάνουν χώρα εντός του πυρήνα ενώ η μετάφραση πραγματοποιείται έξω από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Στα προκαρυωτικά κύτταρα, ή εκείνα τα κύτταρα που δεν έχουν πυρήνα, και οι τρεις διαδικασίες συμβαίνουν στο κυτταρόπλασμα. Ο φαινότυπος των οργανισμών καθορίζεται από αυτό το παράδειγμα μεταφοράς πληροφοριών. Οι βιολόγοι έχουν τα έχουν μελετήσει για χρόνια με τη μορφή γονιδιωματικών, μεταγραφικών και πρωτεϊνομικών. Τα δεδομένα από αυτές τις πειραματικές προσεγγίσεις συμπληρώνονται από επιγονιδιωματική και μεταβολική που χρησιμοποιούνται πρόσφατα για την επίλυση συγκεκριμένων προβλημάτων που αφορούν πολλές λειτουργίες ενός οργανισμού. Η ταχεία ανάπτυξη και πρόοδος στις τεχνολογίες omics καθορίζουν την προοδευτική επέκταση του όγκου των πληροφοριών που μπορούν να συγκεντρωθούν σε μεμονωμένες μελέτες. Επιπλέον, η τρέχουσα φύση υψηλής απόδοσης αυτών των τεχνικών έχει αυξήσει την προσβασιμότητα σε αυτές τις πληροφορίες από άποψη χρόνου και κόστους. Πολλοί ερευνητές βρίσκονται σε μια κατάσταση όπου μπορούν να συλλέξουν πολλά σύνολα δεδομένων omics στα ίδια πειραματικά δείγματα. Προκειμένου να ληφθούν πιο ολοκληρωμένα συμπεράσματα σχετικά με τις βιολογικές διεργασίες, αυτά τα σύνολα δεδομένων πρέπει να ενσωματωθούν με την προσέγγιση πολλαπλών omics και να αναλυθούν ως ένα ολιστικό σύστημα (Εικ. 2).

Εικόνα 2. Ολοκληρωμένες προσεγγίσεις omics της βιολογίας συστημάτων

Ο όρος «Omics» που προέρχεται από ελληνική λέξη και η προσθήκη του επιθήματος -ome στα κυτταρικά μόρια, όπως γονίδιο, μεταγραφή, πρωτεΐνη, μεταβολίτης, δίνει νόημα σε «ολόκληρο», «όλα» ή «πλήρη». Τα διαφορετικά στρώματα του κυττάρου, που αποτελούνται από DNA και τροποποιήσεις (γονιδίωμα, επιγενώμα), περιεκτικότητα σε RNA και πρωτεΐνη (Transcriptome, Proteome), μικρά μόρια (μεταβολόμη, λιπιδώμα) και στοιχειακή σύνθεση (μετρημένη ως «ιονόμα»), μπορούν να αναλυθούν με τεχνολογίες omics. Ο συνδυασμός των στρωμάτων omics σε ένα σύνολο δεδομένων πολλαπλών omics ενσωματώνεται μέσω ισχυρής βιολογίας συστημάτων που είναι σε θέση να αποκαλύψει μηχανισμούς και αλληλεπιδράσεις μεταξύ των στρωμάτων καθώς και τη λειτουργία των ιστών, των οργάνων και ολόκληρου του οργανισμού των κυτταρικών πληθυσμών. Οι προσεγγίσεις Omics περιλαμβάνουν μεγαλύτερο αριθμό μετρήσεων ανά τελικό σημείο και παρόλο που ο αριθμός των παραμέτρων που μετρούνται ανά ανάλυση αυξάνεται, ο αριθμός των επαναλήψεων μειώνεται. Αυτό αφενός οφείλεται στην υπερεκτίμηση των μεθόδων αφού θεωρείται ότι περισσότερες μετρήσεις θα αντισταθμίσουν έναν μικρό αριθμό δειγμάτων και αφετέρου οφείλεται στο κόστος και το χρόνο των πειραμάτων omics.

Οι μονό-omics κλάδοι στοχεύουν στη μελέτη συγκεκριμένων βιολογικών θεμάτων χωρίς να απαιτείται προηγούμενη κατανόηση των βιολογικών βάσεων που εμπλέκονται. Ανάλογα με τον τύπο του βιομορίου στο οποίο επικεντρώνονται κυρίως σε ένα συγκεκριμένο βιολογικό δείγμα, οι τεχνολογίες omics χωρίζονται σε: γονιδιωματικά (γονιδίωμα / γονίδιο), μεταγονιδιωματικά (γονιδιώματα που ανακτήθηκαν απευθείας από περιβαλλοντικά δείγματα), επιγενωμικά (υποστηρικτική δομή του γονιδιώματος, συμπεριλαμβανομένων πρωτεϊνών και RNA συνδετικά, εναλλακτικές δομές DNA και χημικές τροποποιήσεις στο DNA), μεταγραφικά (mRNA), πρωτεομικά (πεπτίδια / πρωτεΐνες), μεταβολικά (μεταβολίτες), λιπιδωμικά (λιπίδια) γλυκόζες (υδατάνθρακες και σάκχαρα), ιονομικά (ιόντα).

Αν και καμία από τις τρέχουσες τεχνολογίες omics δεν είναι τέλεια, μερικές από αυτές καταφέρνουν να παρέχουν μια πιο ολοκληρωμένη εικόνα του βιολογικού στρώματος που σκοπεύουν να μελετήσουν από άλλες. Αυτό το γεγονός οφείλεται όχι μόνο στις διαφορές στην κατάσταση των τεχνολογικών εξελίξεων, αλλά μάλλον στις διαφορές στη χημική και φυσική πολυπλοκότητα κάθε βιολογικού επιπέδου.

Γονιδιωματικά

Η γονιδιωματική είναι η συστηματική μελέτη όλων των γονιδίων ενός οργανισμού (το γονιδίωμα), συμπεριλαμβανομένων των αλληλεπιδράσεων αυτών των γονιδίων μεταξύ τους και με το περιβάλλον του οργανισμού. Το γονιδίωμα είναι το βασικό βιολογικό στρώμα στο κύτταρο και αντιπροσωπεύει το συνολικό DNA ενός κυττάρου ή οργανισμού. Το δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA) είναι η χημική ένωση που περιέχει όλες τις απαραίτητες γενετικές πληροφορίες που απαιτούνται για την ανάπτυξη και την κατεύθυνση των δραστηριοτήτων σχεδόν όλων των ζωντανών οργανισμών. Τα μόρια του DNA αποτελούνται από δύο περιστρεφόμενους, συζευγμένους κλώνους, που συχνά αναφέρονται ως διπλή έλικα. Κάθε κλώνος DNA αποτελείται από τέσσερις νουκλεοτιδικές βάσεις – αδενίνη (Α), θυμίνη (Τ), γουανίνη (G) και κυτοσίνη (C) που ζευγαρώνουν ειδικά σε αντίθετα σκέλη: Το Α ζευγαρώνεται πάντα με ένα Τ. Το C ζευγαρώνεται πάντα με ένα G. Μια αλληλουχία τριών παρακείμενων νουκλεοτιδίων (κωδικόνιο) κωδικοποιεί ένα συγκεκριμένο αμινοξύ κατά τη σύνθεση ή τη μετάφραση της πρωτεΐνης. Η σειρά των νουκλεοτιδίων κατά μήκος των μορίων του DNA καθορίζει τον γενετικό κώδικα. Ο γενετικός κώδικας είναι καθολικός επειδή είναι ο ίδιος μεταξύ όλων των οργανισμών και είναι επίσης εκφυλισμένος επειδή 64 κωδικόνια κωδικοποιούν μόνο 22 αμινοξέα. Με τη γλώσσα των τεσσάρων γραμμάτων, το DNA περιέχει τις πληροφορίες που απαιτούνται για τη δημιουργία ενός ολόκληρου οργανισμού. Ένα γονίδιο αντιπροσωπεύει τη μονάδα του DNA που φέρει κωδικούς για την παραγωγή μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης ή ενός συνόλου πρωτεϊνών. Με βάση την εγγενή συμπληρωματικότητα των νουκλεοτιδικών βάσεων στο DNA, κατέστη δυνατή η ταχεία αλληλουχία ενός τεράστιου αριθμού γονιδιωμάτων με σχετικά χαμηλό κόστος. Από την αποτελεσματικά προσδιορισμένη αλληλουχία γονιδιωμάτων θα μπορούσαν να γίνουν προβλέψεις για αλληλουχίες RNA και πρωτεϊνών οι οποίες συνδυάζονται στις πολυ-ομικές προσεγγίσεις. Η ψηφιακή μορφή των αλληλουχιών DNA ως ένα είδος βιολογικής πληροφορίας omics θα μπορούσε εύκολα να αποθηκευτεί σε βιολογικές βάσεις δεδομένων και να μοιραστεί μεταξύ επιστημόνων σε όλο τον κόσμο. Η αλληλουχία του πρώτου ολόκληρου γονιδιώματος του βακτηρίου Haemophilus influenza το 1995 έκανε μια επανάσταση στη μοριακή βιολογία. Παρήχθη ο μεγάλος όγκος δεδομένων ακολουθιών που ήταν πέρα ​​από το να ερμηνευτεί πλήρως. Η αποκρυπτογράφηση σχετικών γενετικών πληροφοριών από το γενετικό υλικό υπόβαθρο ήταν σχεδόν αδύνατη εργασία. Για να ξεπεραστεί αυτό, απαιτούνταν πιο λεπτομερείς βιολογικές πληροφορίες. Οι πληροφορίες σχετικά με τη μεταγραφή του γενετικού υλικού και την επακόλουθη παραγωγή πρωτεϊνών ήταν απαραίτητες.

Μια βασική ερευνητική κατεύθυνση στον τομέα της βιολογίας συστημάτων είναι η λειτουργική γονιδιωματική. Αυτή η πειθαρχία αναπτύσσει και εκμεταλλεύεται μεθοδολογίες μεγάλης κλίμακας και υψηλής απόδοσης με στόχο τον καθορισμό και την ανάλυση της γονιδιακής λειτουργίας σε παγκόσμιο επίπεδο. Είναι πολύ σημαντικό για την ανάπτυξη μιας συστημικής κατανόησης μιας βιολογικής διαδικασίας για τον προσδιορισμό των γονιδίων και των πρωτεϊνών που κωδικοποιούν και οι οποίες συνεργάζονται για να δημιουργήσουν αυτή τη διαδικασία. Η λειτουργική γονιδιωματική είναι ένα ενσωματωμένο επιστημονικό πεδίο που συνδυάζει πολλαπλά σύνολα δεδομένων μεγάλης κλίμακας σε προσπάθειες δημιουργίας πληροφοριών για τη γονιδιακή λειτουργία. Στην αρχή, τα γονίδια αναλύθηκαν μεμονωμένα, αλλά η πρόοδος των τεχνολογιών τα τελευταία χρόνια καθιστά δυνατή την ταυτόχρονη ανάλυση χιλιάδων γονιδίων. Αυτή η μεγάλης κλίμακας ανάλυση της γονιδιακής λειτουργίας ονομάζεται τεχνολογία μικροσυστοιχιών DNA (Εικ. 3).

Εικόνα 3. Σχέδιο ανάλυσης μικροσυστοιχιών DNA

Οι μικροσυστοιχίες DNA μετρούν τις διαφορές στην αλληλουχία DNA μεταξύ ατόμων και αυτή η τεχνολογία μπορεί να παρέχει πληροφορίες για τη λειτουργία μη χαρακτηρισμένων γονιδίων και μπορεί επίσης να αποκαλύψει ομάδες αλληλεπιδρώντων γονιδίων που προκαλούν μια βιολογική διαδικασία ενδιαφέροντος. Οι αναλύσεις μικροσυστοιχιών μπορούν επίσης να παρέχουν πληροφορίες για τους μηχανισμούς ρύθμισης των γονιδίων, την εξέλιξη και την αιτιολογία της νόσου. Για παράδειγμα, η ανάλυση δεδομένων μικροσυστοιχίας θα μπορούσε να αποκαλύψει ανωμαλίες όπως χρωμοσωμικές εισαγωγές και διαγραφές ή μη φυσιολογικούς χρωμοσωμικούς αριθμούς σε μια διαδικασία που ονομάζεται συγκριτική γονιδιωματική υβριδοποίηση. Οι πιο συνηθισμένες παραλλαγές στις αλληλουχίες του DNA μεταξύ των ανθρώπων είναι οι πολυμορφισμοί μεμονωμένων νουκλεοτιδίων (SNPs), στους οποίους ένα νουκλεοτίδιο αντικαθίσταται από ένα άλλο. Αυτό μπορεί να έχει λειτουργική σημασία εάν η αλλαγή καταλήξει σε κωδικόνιο για ένα διαφορετικό αμινοξύ. Έχουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον όταν συνδέονται με ασθένειες με γενετικό προσδιορισμό. Ο σχηματισμός πολυμορφισμού μεμονωμένων νουκλεοτιδίων έχει επίσης ρόλο στη φαρμακογονιδιωματική στην διερεύνηση των επιμέρους αποκρίσεων των ασθενών στα φάρμακα.

Επιγενωμική

Οι επιγενετικές τροποποιήσεις όπως η μεθυλίωση του DNA, τοι ροποποιήσεις της ιστόνης, η ανάλυση 2D και 3D της δομής της χρωματίνης και του μη κωδικοποιητικού RNA μελετώνται με τις μεθόδους της επιγενωμικής. Αυτή επικεντρώνεται στην ανάλυση των συνολικών επιγενετικών αλλαγών που παρέχει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τους μηχανισμούς και τη λειτουργία της γονιδιακής ρύθμισης σε πολλά γονίδια σε ένα κύτταρο ή οργανισμό. Οι επιστήμονες έχουν καταλάβει ότι ο φαινότυπος του ατόμου δεν ελέγχεται μόνο από το γονιδίωμα αλλά και από τις αλλαγές στη ρύθμιση των γονιδιακών δραστηριοτήτων. Γενετικά πειράματα σε ανθρώπους και ζώα απέδειξαν ότι, εκτός από την αλληλουχία του DNA, επιγενετικά σημάδια μπορεί να μεταδοθούν από τον γονέα στους απογόνους μέσω των γαμετών και να επηρεάσουν τον φαινότυπο των απογόνων.

Η επιγενωμική ορίζει τις τροποποιήσεις στη ρύθμιση των γονιδιακών δραστηριοτήτων που δρουν χωρίς, ή ανεξάρτητα από, αλλαγές στις γονιδιακές αλληλουχίες. Ορισμένοι ορισμοί περιορίζουν την επιγενετική/επιγενεμική σε τροποποιήσεις του φαινοτύπου χωρίς αλλαγές στην αλληλουχία του DNA που μεταδίδονται στις επόμενες γενιές. Οι επιγενετικές τροποποιήσεις είναι χημικές τροποποιήσεις, οι οποίες δεν κωδικοποιούνται από το γονιδίωμα και συντονίζουν τον τρόπο και το πότε τα γονίδια εκφράζονται. Η επιγενωμική διερευνά κληρονομικές, αναστρέψιμες τροποποιήσεις του DNA και της χρωματίνης που δεν επηρεάζουν τις πρωτογενείς νουκλεοτιδικές αλληλουχίες. Ενώ ο όρος επιγενεμική θα περιγράψει την ανάλυση των επιγενετικών αλλαγών σε πολλά γονίδια σε ένα κύτταρο ή σε ολόκληρο τον οργανισμό, η επιγενετική επικεντρώνεται σε διαδικασίες που ρυθμίζουν τον τρόπο και τον τρόπο ενεργοποίησης και απενεργοποίησης συγκεκριμένων γονιδίων. Διάφοροι παράγοντες είναι γνωστό ότι επηρεάζουν την επιγενετική ρύθμιση: 1) Διατροφή (διαιτητικοί παράγοντες), 2) Περιβαλλοντικοί παράγοντες, 3) Έκθεση σε ακτινοβολία, 4) Μολυσματικοί παράγοντες, 5) Ανοσολογικοί παράγοντες, 6) Γενετικοί παράγοντες, 7) Τοξικοί παράγοντες, και 8) Μεταλλαξιογόνα.

Ευέλικτες μέθοδοι ανίχνευσης μπορούν να εφαρμοσθούν για την ανάλυση επιγενετικών τροποποιήσεων στο κύτταρο. Η μεθυλίωση του DNA αναλύεται με δοκιμασίες πέψης και αλληλουχία διθειώδους DNA. Στις δοκιμασίες πέψης, το γονιδιωματικό DNA κατακερματίζεται με ευαίσθητες σε μεθυλίωση και μη ευαίσθητες σε μεθυλίωση ενδονουκλεάσες. Τα ευαίσθητα στη μεθυλίωση περιοριστικά ένζυμα διασπούν μόνο το μη μεθυλιωμένο DNA και αφήνουν τα μεθυλιωμένα θραύσματα DNA άπεπτα. Το κατακερματισμένο DNA μπορεί να αναλυθεί με προσδιορισμό αλληλουχίας ή μικροσυστοιχία, και έτσι χαρτογραφούνται οι θέσεις μεθυλίωσης. Το μειονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι μελετά μόνο τις αλληλουχίες DNA κοντά στους στόχους των επιλεγμένων ενζύμων περιορισμού και συνήθως χρησιμοποιείται για τον χαρακτηρισμό μόνο των παγκόσμιων επιπέδων μεθυλίωσης του DNA αντί για την ταυτοποίηση του μεθυλιωμένου DNA στο επίπεδο ενός υπολείμματος. Η ανάλυση βελτιώνεται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο αλληλουχίας διθειώδους. Αυτή η συγκεκριμένη μέθοδος για το σκέλος χρησιμοποιείται για τη μετατροπή της μη μεθυλιωμένης κυτοσίνης σε ουρακίλη, ενώ τα υπολείμματα μεθυλιωμένης κυτοσίνης παραμένουν ανεπηρέαστα. Το προκύπτον DNA ενισχύεται σε PCR και μπορεί να αναλυθεί με προσδιορισμό αλληλουχίας των περιοχών ενδιαφέροντος. Η ανάλυση μπορεί επίσης να γίνει χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας MALDI-TOF ή μικροσυστοιχίες. Η μεθυλίωση του DNA μπορεί επίσης να μελετηθεί μέσω μεθόδων που βασίζονται στην αρχή της χρωματογραφίας συγγένειας. Το δείγμα που περιέχει κατακερματισμένο DNA φορτώνεται σε μια στήλη με δεσμευμένη περιοχή σύνδεσης μεθυλίου (MBD) του MeCP2, ειδικά για μεθυλιωμένο DNA. Τα μεθυλιωμένα κλάσματα DNA εκλούονται και αναλύονται με τεχνικές σε όλο το γονιδίωμα όπως MBDCap-seq/MethylCap-seq. Μια άλλη προσέγγιση είναι η ανοσοκαταβύθιση μεθυλιωμένου DNA (MeDIP), η οποία βασίζεται στη ειδική σύνδεση αντισωμάτων με τη μεθυλιωμένη κυτοσίνη (5mC) στο DNA. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται επίσης για την ανάλυση υδροξυλιωμένης μεθυλοκυτοσίνης (5hmC). Τα καθαρισμένα θραύσματα αναλύονται με PCR, προσδιορισμό αλληλουχίας ή μικροσυστοιχία.

Μια ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική για τον εντοπισμό τροποποιήσεων ιστόνης είναι η ανοσοκαταβύθιση της χρωματίνης (ChIP). Χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό τοπικών μετα -μεταφραστικών τροποποιήσεων των ουρών ιστόνης και για την παρακολούθηση των αλλαγών στις τροποποιήσεις ως απόκριση σε διαφορετικά ερεθίσματα. Αντισώματα έναντι συγκεκριμένων τροποποιήσεων ιστόνης (όπως τριμεθυλίωση ιστόνης Η3 λυσίνης Κ27) χρησιμοποιούνται για ανοσοκαταβύθιση αυτών των περιοχών χρωματίνης που έχουν αυτές τις τροποποιήσεις. Το ChIP μπορεί επίσης να εφαρμοστεί για τη μελέτη της σύνδεσης παραγόντων μεταγραφής και ενζύμων στη χρωματίνη, χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα κατά του παράγοντα που μας ενδιαφέρει. Οι σχετικές περιοχές χρωματίνης μπορούν να αναλυθούν είτε με PCR για τον εντοπισμό συγκεκριμένων θέσεων είτε για βαθιά αλληλουχία για μια πιο σφαιρική εικόνα, καθώς και με τη χρήση μικροσυστοιχιών (ChIP-chip), αλλά στην τελευταία περίπτωση η ανάλυση των δεδομένων είναι ασθενέστερη σε σύγκριση με την αλληλουχία. Κατά τη διάρκεια της τελευταίας δεκαετίας αναπτύχθηκε η βασική μέθοδος ChIP που οδηγεί στην εμφάνιση άλλων διαφορετικών μεθόδων ChIP όπως μChIP-seq για χαμηλή, μικροκλίμακα ανάλυση ποσότητας δείγματος και τη σύγχρονη αλληλουχία σε πραγματικό χρόνο ενός μορίου (SMRT; ” αλληλουχία τρίτης γενιάς ») δειγμάτων ChIP.

Οι επιγενετικές τροποποιήσεις μπορούν επίσης να μελετηθούν με μεθόδους ταυτοποίησης των ενεργών περιοχών της χρωματίνης. Στη μέθοδο DNase-seq, το ένζυμο DNase Ι χρησιμοποιείται για την πέψη του DNA που δεν προστατεύεται από δομή νουκλεοσωμάτων, οπότε οι περιοχές που είναι ευαίσθητες στη DNase σχετίζονται με ενεργά γονίδια. Για την ανάλυση και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων μπορούν να χρησιμοποιηθούν τεχνικές αλληλουχίας, μικροσυστοιχίας ή Southern Blot. Η ανοικτή χρωματίνη μπορεί να ανιχνευθεί επίσης με απομόνωση ρυθμιστικών στοιχείων με τη βοήθεια φορμαλδεhyδης (FAIRE), η οποία έχει ως αποτέλεσμα την απομόνωση ανοικτών περιοχών χρωματίνης που έχουν εξαντληθεί από νουκλεοσώματα. Η μέθοδος FAIRE βασίζεται στη διασταύρωση μεταξύ φορμαλδεhyδης και DNA, ιστονών και άλλων πρωτεϊνών που σχετίζονται με αυτήν. Το DNA υποβάλλεται σε υπερήχους για να κατακερματιστεί και μετά απομονωθεί με εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμίου. Μόνο το DNA που δεν δεσμεύεται από τα νουκλεοσώματα και τις σχετικές πρωτεΐνες παραμένει στην υδατική φάση κατά την εξαγωγή, με αποτέλεσμα να απομονώνεται η ανοικτή και ενεργή περιοχή του γονιδιώματος. Τα απομονωμένα θραύσματα μπορούν να αναλυθούν ξανά με διαφορετικές μεθόδους, όπως PCR, μικροσυστοιχία και αλληλουχία. Η χρωματίνη μπορεί επίσης να μελετηθεί με τεχνική σύλληψης διαμόρφωσης χρωματίνης (3C) που προσδιορίζει τις περιοχές χρωματίνης που συνδέονται σωματικά μαζί, όπως προαγωγείς με ενισχυτές. Το 3C συχνά αναλύεται με PCR, αλλά στις μέρες μας επίσης με βαθιά αλληλουχία των αλληλεπιδράσεων παγκοσμίως (Hi-C).

Τα μη κωδικοποιητικά RNA (ncRNA) δρουν ως επιγενετικοί τροποποιητές για να ρυθμίσουν έντονα την γονιδιακή έκφραση. Η παρεκκλίνουσα έκφραση τους κυρίως με τη μορφή microRNA (miRNA) και μακρών μη κωδικοποιητικών RNA, μπορεί να τροποποιήσει την γονιδιακή έκφραση και να προκαλέσει περίπλοκες ανοσολογικές διαταραχές. Η ανάλυση του συστατικού RNA της επιγενετικής γίνεται συχνότερα σε κλίμακα γενωμικού σχήματος χρησιμοποιώντας μεθόδους αλληλουχίας επόμενης γενιάς. Οι αλλαγές στο ncRNA και mRNA μπορούν να χαρακτηριστούν με βαθιά αλληλουχία. Η έκφραση των RNAs μπορεί να αναλυθεί επίσης με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR). Η ποσοτική PCR επίσης γνωστή ως PCR πραγματικού χρόνου είναι μια εργαστηριακή τεχνική στη μοριακή βιολογία, με την οποία η ποσότητα του προϊόντος PCR μπορεί να προσδιοριστεί σε πραγματικό χρόνο και είναι πολύ χρήσιμη για τη διερεύνηση της γονιδιακής έκφρασης.

Μεταγραφική

Όταν τα γονίδια εκφράζονται, οι γενετικές πληροφορίες που αποθηκεύονται στο DNA μεταφέρονται στο RNA (ριβονουκλεϊκό οξύ). Τα RNA είναι σημαντικά μακρομόρια, που αποτελούνται από γραμμικές αλυσίδες νουκλεοτιδίων (Εικ. 4), τα οποία παράγονται από την κυτταρική διαδικασία μεταγραφής. Τα RNA εκτελούν ποικίλες κυτταρικές και βιολογικές λειτουργίες είτε χρησιμεύουν ως πρότυπα για τη σύνθεση πρωτεϊνών είτε παίζουν κρίσιμους καταλυτικούς και ρυθμιστικούς ρόλους. Κατά τη μεταγραφή, οι γενετικές πληροφορίες μεταφέρονται από το DNA στο mRNA. Αυτή η διαδικασία διεξάγεται από ένα ένζυμο RNA πολυμεράση. Υπάρχουν αρκετές κατηγορίες RNA σε κύτταρα (αγγελιοφόρα RNA (mRNA), RNA μεταφοράς (tRNA), ριβοσωμικό RNA (rRNA), μικρό πυρηνικό RNA (snRNA), μικρό πυρηνικό RNA (snoRNA), σύντομο παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA), μικρο RNA ( miRNAs), μακρό μη κωδικοποιητικό RNA και ψευδογόνα), αλλά αυτά που συμμετέχουν στη σύνθεση πρωτεϊνών είναι το αγγελιοφόρο RNA (mRNA), το RNA μεταφοράς (tRNA) και το ριβοσωμικό RNA. Το RNA αγγελιοφόρου (mRNA) είναι ένα μονόκλωνο μόριο που μεσολαβεί στη μεταφορά γενετικών πληροφοριών στα ριβοσώματα όπου συντίθενται οι πρωτεΐνες. Στα ευκαρυωτικά, κάθε γονίδιο μεταγράφεται για να δώσει ένα μόνο mRNA, ενώ στα προκαρυωτικά, ένα μόριο mRNA μπορεί να μεταφέρει τη γενετική πληροφορία από πολλά γονίδια, δηλαδή αρκετές περιοχές κωδικοποίησης πρωτεϊνών. Υπάρχει μια γραμμική αντιστοιχία μεταξύ της βασικής αλληλουχίας ενός γονιδίου και της αλληλουχίας αμινοξέων ενός πολυπεπτιδίου. Κάθε ομάδα τριών διαδοχικών νουκλεοτιδίων κωδικοποιεί τη θέση ενός συγκεκριμένου αμινοξέος σε ένα μόριο πρωτεΐνης και κάθε τέτοια τριπλή βάση ονομάζεται κωδικόνιο. Τα κωδικόνια μεταφράζονται σε αλληλουχίες αμινοξέων από ριβοσώματα (τα οποία αποτελούνται από πρωτεΐνες και rRNA), tRNA και βοηθητικές πρωτεΐνες που ονομάζονται παράγοντες μετάφρασης.

Εικόνα 4. Μονόκλωνη δομή του RNA με τις τέσσερις νουκλεοτιδικές βάσεις – αδενίνη, ουρακίλη, γουανίνη, κυτοσίνη.

Ο όρος «μεταγράφημα» χρησιμοποιείται ευρέως για να ορίσει το πλήρες σύνολο όλων των μορίων του ριβονουκλεϊκού οξέος (RNA) σε ένα κύτταρο, ιστό ή οργανισμό. Το μεταγράφημα αντανακλά τη μοριακή δραστηριότητα στα κύτταρα, τα γονίδια που εκφράζονται ενεργά κάθε δεδομένη στιγμή. Περιλαμβάνει όλες τις μορφές μορίων RNA συμπεριλαμβανομένης της κωδικοποίησης πρωτεΐνης, της μη πρωτεϊνικής κωδικοποίησης, εναλλακτικά συνδεδεμένων, εναλλακτικά πολυαδενυλιωμένων, εναλλακτικά εκκινούμενων, αίσθησης, αντινόημα και μεταγραφής με επεξεργασία RNA. Αντίστοιχα, η μεταγραφική μελέτη μελετά όλους τους τύπους μεταγραφών εντός ενός κυττάρου ή ενός οργανισμού, συμπεριλαμβανομένων των mRNA, των miRNA και διαφορετικών τύπων μακρών μη κωδικοποιητικών RNA (lncRNA). Η μεταγραφική καλύπτει τα πάντα που σχετίζονται με τα RNA όπως τα επίπεδα μεταγραφής και έκφρασης, οι λειτουργίες, οι τοποθεσίες, η διακίνηση και η υποβάθμιση. Περιλαμβάνει επίσης τις δομές των μεταγραφών και τα γονικά γονίδια τους σε σχέση με τις θέσεις έναρξης, τις ακολουθίες 5 ′ και 3 ′, τα μοτίβα συγκόλλησης και τις μετα -μεταγραφικές τροποποιήσεις.

Οι κυριότερες μελέτες μεταγραφικής στοχεύουν:

• Στον χαρακτηρισμός διαφορετικών καταστάσεων κυττάρων (δηλαδή στάδια ανάπτυξης), ιστών ή φάσεων κυτταρικού κύκλου με μοτίβα έκφρασης.
• Στην διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τον φαινότυπο.
• Στις ταυτοποιήσεις βιοδεικτών που εκφράζονται διαφορετικά μεταξύ της ασθενούς και της υγιούς κατάστασης.
• Στη διαφοροποίηση σταδίων ή υποτύπων της νόσου (π.χ. στάδια καρκίνου).
• Στη δημιουργία της αιτιολογικής σχέσης μεταξύ γενετικών παραλλαγών και μοτίβων γονιδιακής έκφρασης για να φωτιστεί η αιτιολογία των ασθενειών.

Κατά τη διάρκεια των τελευταίων τριών δεκαετιών, η τεχνολογική πρόοδος έχει φέρει επανάσταση στη μεταγραφή προφίλ και επαναπροσδιορίζει τι είναι δυνατό να διερευνηθεί. Η ενσωμάτωση μεταγραφικών δεδομένων με άλλα ομόλογα δίνει μια ολοένα και πιο ολοκληρωμένη εικόνα των κυτταρικών περιπλοκών διευκολύνοντας τις ολιστικές προσεγγίσεις στη βιοϊατρική έρευνα.

Οι κυριότερες τεχνικές που εφαρμόζονται για τη μελέτη μεταγραφής είναι:

• Methods Μέθοδοι βασισμένες στην ετικέτα ακολουθίας (EST)
• SAGE
• Micro Μικροσυστοιχία με βάση τον υβριδισμό
• PC PCR σε πραγματικό χρόνο
• Methods Μέθοδοι αλληλουχίας RNA (RNA-seq) που βασίζονται σε NGS,
• Inter Παρεμβολή RNA
• Εργαλεία βιοπληροφορικής για ανάλυση μεταγραφών.

Η επιλογή της τεχνικής εξαρτάται από την αποδοτικότητα κόστους, την ευαισθησία, την υψηλή απόδοση και την ελάχιστη συγκέντρωση του αρχικού RNA. Η μεθοδολογία περιλαμβάνει απομόνωση RNA, καθαρισμό, ποσοτικοποίηση, κατασκευή βιβλιοθήκης cDNA και αλληλουχία υψηλής απόδοσης.

• Μέθοδοι εκφραζόμενης αλληλουχίας (EST): παρουσία της συγκεκριμένης αλληλουχίας κωδικοποίησης στο γονιδιωματικό DNA. Η αλληλουχία των EST δίνει μια επισκόπηση του επιπέδου έκφρασης του γονιδίου. Καθώς όλο και περισσότερα στοιχεία EST έχουν γίνει δημόσια διαθέσιμα, η χρήση των ESTs έχει επεκταθεί σε άλλους τομείς, όπως στην ανακάλυψη γενετικών δεικτών πυριτίου, στην ανακάλυψη γονιδίων πυριτίου, στην κατασκευή γενετικών μοντέλων, στην εναλλακτική πρόβλεψη συγκόλλησης, στον σχολιασμό του γονιδιώματος, στο προφίλ έκφρασης και συγκριτική γονιδιωματική. Σε σύγκριση με τον προσδιορισμό ολόκληρου του γονιδιώματος, η τεχνολογία EST είναι απλούστερη και λιγότερο δαπανηρή, ειδικά στην περίπτωση μεγάλων γονιδιωμάτων. Υπάρχουν βάσεις δεδομένων EST όπως το dbEST (NCBI EST) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/dbest/) που περιέχουν δεδομένα αλληλουχίας και άλλες πληροφορίες για αλληλουχίες cDNA “μονής διέλευσης” ή “Expressed Ετικέτες ακολουθίας “, από έναν αριθμό οργανισμών και έτσι χρησιμεύουν ως αναφορά για το προφίλ έκφρασης ενός οργανισμού.
• Η σειριακή ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης (SAGE) είναι μια μεταγραφική τεχνική που χρησιμοποιείται από τους επιστήμονες για να δημιουργήσει ένα στιγμιότυπο του πληθυσμού του αγγελιοφόρου RNA σε ένα δείγμα ενδιαφέροντος με τη μορφή μικρών ετικετών που αντιστοιχούν σε θραύσματα αυτών των μεταγραφών. Αυτή η τεχνική είναι πλεονεκτική έναντι του EST επειδή ακολουθούνται μόνο σύντομες “ετικέτες” περίπου 15 βάσεων. Τα σύντομα θραύσματα που δημιουργούνται στη συνέχεια ενώνονται και αλληλουχούνται. Μια δεξαμενή cDNA μπορεί να υποβληθεί σε NGS υψηλής απόδοσης γνωστό ως RNA-seq για ποσοτικοποίηση, ανακάλυψη νέων EST και προφίλ RNA.
• Το τσιπ DNA, το τσιπ γονιδίων, το βιοτσίπ ή η μικροσυστοιχία είναι μια συλλογή κηλίδων DNA, cDNA, ολιγονουκλεοτιδίων προσαρτημένων σε ένα στερεό υπόστρωμα όπως γυαλί ή τσιπ πυριτίου. Μέσω αυτής της μεθόδου που βασίζεται σε υβριδισμό, τα επίπεδα έκφρασης χιλιάδων γονιδίων παρακολουθούνται ταυτόχρονα. Ο κυριότερος περιορισμός αυτής της τεχνολογίας είναι ότι οι πληροφορίες αλληλουχίας του γονιδιώματος αποτελούν προϋπόθεση και επίσης απαιτείται υψηλότερο υπόβαθρο της τεχνικής υβριδοποίησης.
• Η ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο (qRT-PCR) είναι ένας τύπος PCR για αξιόπιστη ποσοτικοποίηση mRNA χαμηλής αφθονίας ή μεταγραφών χαμηλής αντιγραφής. Τα κυριότερα πλεονεκτήματα αυτής της τεχνικής είναι η υψηλή ευαισθησία, η καλύτερη αναπαραγωγιμότητα και το μεγάλο δυναμικό εύρος ποσοτικοποίησης. Διευκολύνει τις γονιδιακές εκφράσεις και τις μελέτες ρύθμισης ακόμη και σε ένα μόνο κύτταρο με βάση την ικανότητα εκθετικής ενίσχυσης. Η διαθεσιμότητα διαφόρων τύπων συστήματος παρακολούθησης φθορισμού που συνδέονται με την PCR οδήγησε στη δημοτικότητά του για μελέτες γονιδιακής έκφρασης. Τα προβλήματα της μη ειδικής ενίσχυσης, του σχηματισμού διμερών εκκινητών είναι μερικοί από τους περιορισμούς της qRT-PCR.
• Ο προσδιορισμός αλληλουχίας RNA είναι μία από τις προηγμένες τεχνολογίες υψηλής απόδοσης για μεταγραφικά. Το RNA-seq, επίσης γνωστό ως αλληλουχία κυνηγετικών όπλων ολόκληρου-μεταγραφικού, χρησιμοποιεί εργαλεία NGS. Τα πλεονεκτήματα του RNA-seq είναι ότι δεν βασίζεται στη διαθεσιμότητα της αλληλουχίας γονιδιώματος, δεν έχει ανώτερα ποσοτικά όρια, δείχνει υψηλή αναπαραγωγιμότητα και διαθέτει μεγάλο εύρος δυναμικής ανίχνευσης.

Η πρόοδος της μεταγραφικής οδήγησε σε μια σειρά βιολογικών ανακαλύψεων. Αυτή η τεχνολογία omics έθεσε τα θεμέλια των πρώτων πραγματικών πολυ-omics μελετών, βασισμένες στις συγκρίσεις μεταξύ αλληλουχίας DNA και έκφρασης mRNA. Σήμερα, η μεταγραφική ανάλυση εξακολουθεί να χρησιμοποιείται συχνότερα από τους περισσότερους βιολόγους, δεδομένου ότι τα δεδομένα που λαμβάνονται είναι ακόμη πιο εύκολα αναλύσιμα από άλλες τεχνικές όπως η πρωτεομική και η μεταβολική. Πιο πρόσφατα, η μεταγραφική απολαμβάνει μια δεύτερη αναβίωση, καθώς σε πολλές περιπτώσεις εφαρμόζεται σε μεμονωμένα κύτταρα.

Πρωτεομική

Οι πρωτεΐνες διοικούν την κυτταρική δομή και δραστηριότητα, παρέχουν τους μηχανισμούς σηματοδότησης μεταξύ κυττάρων και ιστών και καταλύουν χημικές αντιδράσεις που υποστηρίζουν τον μεταβολισμό. Η πρωτεϊνική δομή υπαγορεύει τη λειτουργία (ή τη δυσλειτουργία). Οι πρωτεΐνες μπορεί να είναι η βασική αιτία ασθενειών (όπως η νόσος του Αλτσχάιμερ ή του Χάντινγκτον) και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη θεραπεία της (π.χ., τα αντισώματα χρησιμοποιούνται ως θεραπευτικά ενάντια σε ιογενείς και βακτηριακές λοιμώξεις). Το σύνολο όλων των εκφρασμένων πρωτεϊνών σε ένα βιολογικό σύστημα υπό συγκεκριμένες, καθορισμένες συνθήκες είναι γνωστό ως πρωτεόμη. Η λέξη «πρωτεόμη» είναι ένας συνδυασμός πρωτεΐνης και γονιδιώματος και επινοήθηκε από τον Mark Wilkins το 1994.

Ο κύριος στόχος της πρωτεομικής είναι η πειραματική ανάλυση μεγάλης κλίμακας της δομής και της λειτουργίας ολόκληρου του συνόλου πρωτεϊνών που παράγονται από έναν ζωντανό οργανισμό. Ο όρος «πρωτεομικά» εμφανίστηκε για πρώτη φορά το 1997 και αναφέρεται σε μια βασική τεχνολογία στις προσεγγίσεις της βιολογίας συστημάτων που μελετά το πρωτέωμα. Η λειτουργία των κυττάρων εξαρτάται από τις πρωτεΐνες που υπάρχουν στον ενδο- και μεσοκυττάριο χώρο και την αφθονία τους. Η σύνθεση πρωτεϊνών στο κύτταρο βασίζεται σε πρόδρομους mRNA αλλά είναι αδύνατο να προβλεφθεί η αφθονία συγκεκριμένων πρωτεϊνών μόνο με βάση την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης. Ο λόγος για αυτό είναι ότι οι φυσικές πρωτεΐνες υφίστανται μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις (PTM) ή αλλοιώσεις ως απόκριση των αλλαγών στο περιβάλλον. Το πρωτεόμη είναι μια δυναμική αντανάκλαση τόσο των γονιδίων όσο και του περιβάλλοντος και είναι μια πολύτιμη πηγή για την ανακάλυψη των βιοδεικτών, επειδή οι πρωτεΐνες πιθανότατα επηρεάζονται στις ασθένειες και την ανταπόκριση της νόσου. Ο πλήρης χαρακτηρισμός όλων των πρωτεϊνών ήταν ο στόχος της πρωτεομικής από την έναρξή της πριν από σχεδόν 25 χρόνια. Τείνει να κάνει περισσότερα από την απλή ταυτοποίηση πρωτεϊνών που ενδέχεται να υπάρχουν σε ένα δείγμα, αλλά και την αξιολόγηση της αφθονίας της πρωτεΐνης, του εντοπισμού, των μεταφραστικών τροποποιήσεων, των ισομορφών και των μοριακών αλληλεπιδράσεων. Η πρωτεομική στοχεύει στη μελέτη της ροής βιολογικών πληροφοριών μέσω μονοπατιών και δικτύων πρωτεϊνών, με τελικό στόχο την κατανόηση της λειτουργικής συνάφειας των πρωτεϊνών. Αυτό απαιτεί την ανάπτυξη τεχνολογιών που μπορούν να ανιχνεύσουν ένα ευρύ φάσμα πρωτεϊνών σε δείγματα διαφορετικής προέλευσης. Διάφορες τεχνολογίες χρησιμοποιούνται στην πρωτεϊνομετρική και τις περισσότερες φορές εφαρμόζονται συνδυαστικά,  όπως για παράδειγμα η ηλεκτροφόρηση τρισδιάστατης ή δισδιάστατης γέλης με φασματομετρία μάζας (MS) ή η υγρή χρωματογραφία και MS.

Οι συμβατικές τεχνικές για την απομόνωση και τον καθαρισμό των πρωτεϊνών βασίζονται στη χρωματογραφία όπως η χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων (IEC), η υδροξυαπατίτη, χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (SEC) και η χρωματογραφία συνάφειας. Για ανάλυση εκλεκτικών πρωτεϊνών, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ενζυμικά ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA) και στύπωμα Western. Αυτές οι τεχνικές μπορούν να εφαρμοστούν για ανάλυση μεμονωμένων πρωτεϊνών αλλά δεν μπορούν να καθορίσουν το επίπεδο της έκφρασης πρωτεΐνης. Χρησιμοποιούνται η ηλεκτροφόρηση πηκτής νατρίου δωδεκυλ θειικού-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE), η ηλεκτροφόρηση τρισδιάστατης γέλης (2-DE) και η ηλεκτροδιάταξη διαφορικής τρισδιάστατης γέλης (2D-DIGE) για τον διαχωρισμό πολύπλοκων δειγμάτων πρωτεΐνης.

• Η φασματομετρία μάζας (MS) επιτρέπει την ανάλυση πρωτεωμάτων και συνήθως είναι η προτιμώμενη μέθοδος για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνών που υπάρχουν στα βιολογικά συστήματα. Οι τρεις κύριες εφαρμογές του MS στην πρωτεϊνομετρική είναι: η καταλογογράφηση της πρωτεϊνικής έκφρασης, ο ορισμός των αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών και ο εντοπισμός θέσεων τροποποίησης της πρωτεΐνης. Η φασματομετρία μάζας μετρά την αναλογία μάζας προς φορτίο (m/z) των ιόντων αερίου φάσης. Τα φασματόμετρα μάζας αποτελούνται από μια πηγή ιόντων που μετατρέπει τα μόρια της αναλυόμενης ουσίας σε ιόντα αερίου φάσης, έναν αναλυτή μάζας που διαχωρίζει ιονισμένες αναλύσεις με βάση την αναλογία m/z και έναν ανιχνευτή που καταγράφει τον αριθμό των ιόντων σε κάθε τιμή m/z. Η ανάπτυξη του ιονισμού με ηλεκτροψεκασμό (ESI) και την εκρόφηση/ιονισμό λέιζερ με τη βοήθεια μήτρας (MALDI), οι δύο τεχνικές μαλακού ιοντισμού ικανές να ιονίζουν πεπτίδια ή πρωτεΐνες, έφεραν επανάσταση στην πρωτεϊνική ανάλυση χρησιμοποιώντας MS. Ο αναλυτής μάζας είναι κεντρικός για την τεχνολογία MS. Για την έρευνα πρωτεομικής, χρησιμοποιούνται συνήθως τέσσερις τύποι αναλυτών μάζας: τετράπολο (Q), παγίδα ιόντων (τετραπολική παγίδα ιόντων, QIT; γραμμική παγίδα ιόντων, LIT ή LTQ), αναλυτής μάζας χρόνου πτήσης (TOF) και Fourier- αναλυτής μάζας μετασχηματισμού συντονισμού ιόντων κυκλοτρόνιο (FTICR). Διαφέρουν ως προς τις φυσικές αρχές και την αναλυτική τους απόδοση. Τα “υβριδικά” όργανα έχουν σχεδιαστεί για να συνδυάζουν τις δυνατότητες διαφορετικών αναλυτών μάζας και περιλαμβάνουν τα Q-Q-Q, Q-Q-LIT, Q-TOF, TOF-TOF και LTQ-FTICR.
• Η διαδοχική φασματομετρία μάζας είναι μια πρόσθετη πειραματική διαδικασία που είναι επίσης γνωστή ως MS/MS ή MS2. Αυτή είναι μια βασική τεχνική για τον προσδιορισμό αλληλουχίας πρωτεϊνών ή πεπτιδίων και ανάλυση PTM όπου δύο ή περισσότεροι αναλυτές μάζας συνδέονται. Τα μόρια ενός δεδομένου δείγματος ιονίζονται και το πρώτο φασματόμετρο (που ορίζεται ως MS1) διαχωρίζει αυτά τα ιόντα με την αναλογία μάζας προς φορτίο (συχνά δίνεται ως m/z ή m/Q). Επιλέγονται ιόντα συγκεκριμένης αναλογίας m/z που προέρχονται από MS1 και στη συνέχεια διαχωρίζονται σε μικρότερα ιόντα θραύσματος, π.χ. με διάσπαση που προκαλείται από σύγκρουση (CID), διάσπαση ηλεκτρονίων (ECD), διάσπαση μεταφοράς ηλεκτρονίων (ETD), αντίδραση μορίου ιόντων ή διάσπαση φωτογραφιών. Αυτά τα θραύσματα στη συνέχεια εισάγονται στο δεύτερο φασματόμετρο μάζας (MS2), το οποίο με τη σειρά του διαχωρίζει τα θραύσματα με την αναλογία m/z και τα εντοπίζει. Το βήμα κατακερματισμού καθιστά δυνατή την αναγνώριση και τον διαχωρισμό ιόντων που έχουν πολύ παρόμοιες αναλογίες m/z σε κανονικά φασματόμετρα μάζας.
  Η πολυπλοκότητα των βιολογικών συστημάτων απαιτεί τον διαχωρισμό του πρωτεώματος πριν από την ανάλυση. Τόσο οι διαχωρισμοί με βάση τη χρωματογραφία γέλης όσο και η υγρή χρωματογραφία έχουν αποδειχθεί χρήσιμοι από αυτή την άποψη. Τυπικά, μετά από αυτούς τους εκτεταμένους διαχωρισμούς, οι πρωτεΐνες χαρακτηρίζονται από ανάλυση MS είτε άθικτης πρωτεΐνης (από πάνω προς τα κάτω) είτε από πεπτίδια πρωτεΐνης με ενζυματική πέψη (από κάτω προς τα πάνω). Οι ταυτοποιήσεις πρωτεϊνών γίνονται συγκρίνοντας μετρημένες μάζες άθικτων πρωτεϊνών (από πάνω προς τα κάτω) ή πεπτιδίων πρωτεΐνης που έχουν υποστεί πέψη (από κάτω προς τα πάνω) με υπολογιζόμενες μάζες που λαμβάνονται από δεδομένα γονιδιώματος.
• Η Isobaric Taq Labeling (ITL) είναι μια κοινώς χρησιμοποιούμενη μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό των πρωτεϊνών. Στην πρωτεϊονική η ποσοτικοποίηση της αφθονίας των πρωτεϊνών είναι μια σημαντική εστίαση. Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών αντιπροσωπεύουν την ισορροπία μεταξύ της μετάφρασης και της αποδόμησης των πρωτεϊνών στα κύτταρα. Συνεπώς, θεωρείται ότι η αφθονία μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης σχετίζεται με το ρόλο της στη λειτουργία των κυττάρων. Η ITL παρέχει την ευκαιρία ταυτόχρονης ταυτοποίησης και ποσοτικοποίησης των πρωτεϊνών από πολλαπλά δείγματα σε μία μόνο ανάλυση. Για να μετρηθεί η ποσότητα των πρωτεϊνών σε ένα δεδομένο δείγμα, τα πεπτίδια επισημαίνονται με χημικές ετικέτες που έχουν την ίδια δομή και την ονομαστική μάζα, αλλά διαφέρουν στην κατανομή των βαρέων ισοτόπων στη δομή τους. Αυτές οι ετικέτες, κοινώς αναφερόμενες ως διαδοχικές ετικέτες μάζας, έχουν σχεδιαστεί έτσι ώστε η ετικέτα μάζας να διασπάται σε μια συγκεκριμένη περιοχή συνδέσμου σε υψηλότερη ενέργεια που προκαλείται από σύγκρουση που προκαλείται από σύγκρουση (HCD) κατά τη διάρκεια της φασματομετρίας μάζας παράλληλα, αποδίδοντας ιόντα αναφοράς διαφορετικών μαζών. Η ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης επιτυγχάνεται συγκρίνοντας τις εντάσεις των ιόντων αναφοράς στα φάσματα MS/MS. Άλλες ποσοτικές τεχνικές είναι η επισήμανση ICAT και η σταθερή ισοτοπική επισήμανση με αμινοξέα σε κυτταρική καλλιέργεια (SILAC). Το ICAT έχει επίσης διευρύνει το φάσμα των πρωτεϊνών που μπορούν να αναλυθούν και επιτρέπει την ακριβή ποσοτικοποίηση και ταυτοποίηση αλληλουχιών των πρωτεϊνών από πολύπλοκα μίγματα. Το SILAC είναι μια προσέγγιση βασισμένη στο MS για την ποσοτική πρωτεϊνομετρία που εξαρτάται από τη μεταβολική επισήμανση ολόκληρου του κυτταρικού πρωτεώματος. Τα πρωτεώματα των διαφορετικών κυττάρων που καλλιεργούνται σε κυτταρική καλλιέργεια επισημαίνονται με “ελαφριά” ή “βαριά” μορφή αμινοξέων και διαφοροποιούνται μέσω MS.
• Η κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ και η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) είναι δύο κύριες τεχνικές υψηλής απόδοσης που παρέχουν τρισδιάστατη (τρισδιάστατη) δομή πρωτεΐνης που μπορεί να είναι χρήσιμη για την κατανόηση της βιολογικής λειτουργίας της. Με την υποστήριξη τεχνολογιών υψηλής απόδοσης, συλλέγεται ένας τεράστιος όγκος δεδομένων πρωτεομικής. Δημιουργούνται βάσεις δεδομένων βιοπληροφορικής για τον χειρισμό τεράστιου όγκου δεδομένων και την αποθήκευσή τους. Διάφορα εργαλεία βιοπληροφορικής έχουν αναπτυχθεί για την πρόβλεψη της τρισδιάστατης δομής, την ανάλυση του πρωτεϊνικού πεδίου και μοτίβου, την γρήγορη ανάλυση αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης -πρωτεΐνης και την ανάλυση δεδομένων MS. Τα εργαλεία ευθυγράμμισης είναι χρήσιμα για την ευθυγράμμιση ακολουθίας και δομής για να ανακαλυφθεί η εξελικτική σχέση. Η ανάλυση πρωτεϊνών παρέχει την πλήρη απεικόνιση των δομικών και λειτουργικών πληροφοριών του κυττάρου, καθώς και τον μηχανισμό απόκρισης του κυττάρου έναντι διαφόρων τύπων στρες και φαρμάκων χρησιμοποιώντας μεμονωμένες ή πολλαπλές τεχνικές πρωτεομικής. Οι κύριες τεχνικές που χρησιμοποιούνται στην έρευνα πρωτεομικής δίνονται στο Εικ 5.

Εικόνα 5. Μέθοδοι που εφαρμόζονται στον τομέα της Πρωτεομικής για έρευνες μεγάλης κλίμακας πρωτεϊνών

Μεταβολική

Το μεταβόλωμα περιεγράφηκε για πρώτη φορά από τον Oliver και τους συνεργάτες του το 1998, κατά τη διάρκεια της πρωτοποριακής εργασίας τους στον μεταβολισμό της ζύμης, ως το πλήρες συμπλήρωμα μικρών μορίων σε ένα βιολογικό σύστημα ή υγρό. Περιλαμβάνει όλα τα μικρά μόρια όπως λιπίδια, αμινοξέα, λιπαρά οξέα, υδατάνθρακες και βιταμίνες τα οποία είναι γνωστά ως μεταβολίτες και παράγονται ως αποτέλεσμα του κυτταρικού μεταβολισμού. Συμμετέχουν στις μεταβολικές διεργασίες στα κύτταρα αλληλεπιδρώντας με άλλα βιολογικά μόρια ακολουθώντας μεταβολικές οδούς. Η κατάσταση των μεταβολιτών στα βιολογικά συστήματα είναι πολύ μεταβλητή και εξαρτάται από το χρόνο και παρατηρούνται αλλαγές στα επίπεδα των βασικών μεταβολιτών λόγω γενετικών, περιβαλλοντικών, διατροφικών και άλλων παραγόντων.
Η μεταβολική (ανάλυση μεταβολωμάτων) είναι η πιο πρόσφατη στρατηγική μεταξύ των omics που συστηματικά προσδιορίζει και ποσοτικοποιεί τους μεταβολίτες που υπάρχουν σε ένα κύτταρο, ιστό, όργανο, βιορευστά ή οργανισμό σε μια συγκεκριμένη χρονική στιγμή. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στη μεταβολική αποσκοπούν στη μέτρηση ενώσεων χαμηλού μοριακού βάρους (μεταβολίτες) με διαφορετικά φυσικά χαρακτηριστικά όπως πολικότητα ενώσεων, λειτουργικές ομάδες και δομική ομοιότητα. Με βάση αυτές τις ιδιότητες, το μεταβόλωμα χωρίζεται σε υποσύνολα διαφόρων μεταβολιτών και για τη διερεύνησή τους εφαρμόζονται αναλυτικές διαδικασίες βελτιστοποιημένες για κάθε τύπο μορίου στη μεταβολική.
Οι μεταβολίτες είναι προϊόντα βιοχημικών αντιδράσεων που πραγματοποιούνται με τη συμμετοχή πρωτεϊνών του πρωτεώματος (Εικ. 6). Οι συγκεντρώσεις τους εξαρτώνται από τις αλληλεπιδράσεις άλλων διαδικασιών (μεταγραφή, μετάφραση, κυτταρική σηματοδότηση κ.λπ.), έχουν ερευνηθεί ως ανταποκριτές για τον μεταβολισμό στην PD. Αυτό με τη σειρά του καθορίζει τη βιολογική δομή και λειτουργία του τελικού φαινοτύπου του οργανισμού. Επομένως, οι αλλαγές στην έκφραση γονιδίων, στη λειτουργία των πρωτεϊνών και στο περιβάλλον επηρεάζουν άμεσα τη συγκέντρωση των μεταβολιτών σε ένα βιολογικό σύστημα. Το μεταβόλωμα αποτελείται από έναν σχετικά μικρό αριθμό (περίπου 5000), αλλά διαφορετικούς τύπους μεταβολιτών που καθιστούν το μεταβόλωμα πιο πολύπλοκο από φυσική και χημική άποψη από το γονιδίωμα, το μεταγράφημα και το πρωτέομα. Επιπλέον, το γονιδίωμα, το μεταγράφημα και το πρωτέομα αποτελούνται από ενώσεις που αποτελούν μέρος του μεταβολισμού. Επιπλέον, τα συστατικά του μεταβολώματος διατηρούνται σε υψηλό βαθμό μεταξύ οργανισμών σε σύγκριση με το γονιδίωμα, το μεταγράφημα και το πρωτέομα και για αυτό θεωρείται ότι το μεταβόλωμα είναι εξελικτικά το παλαιότερο τμήμα του κυττάρου.

Fig.6. Προσεγγίσεις ενσωμάτωσης στα βιολογικά συστήματα

Η μεταβολική είναι η καταλληλότερη στρατηγική για τον προσδιορισμό των βιοδεικτών που σχετίζονται με τη νόσο. Η ολοκληρωμένη μελέτη των μεταβολιτών είναι ένα επιθυμητό εργαλείο για τη διάγνωση της νόσου, τον εντοπισμό νέων θεραπευτικών στόχων και την καθιέρωση κατάλληλων θεραπειών. Οι αναλύσεις μικρού αριθμού μεταβολιτών χρησιμοποιούνται στη διάγνωση ασθενειών για δεκαετίες, για παράδειγμα, η ανάπτυξη ταινιών δοκιμής γλυκόζης αίματος στη δεκαετία του 1950 για τον έλεγχο του διαβήτη ή ποσοτικοποίησης της φαινυλαλανίνης σε νεογέννητα για τον έλεγχο της φαινυλκετονουρίας.

Οι μεταβολικές αναλύσεις μπορούν να ομαδοποιηθούν σε δύο κύριες προσεγγίσεις: στοχευμένη και μη στοχευμένη μεταβολική. Σε στοχευμένη ανάλυση, οι μεταβολίτες που προσδιορίζονται είναι γνωστοί και αντιπροσωπεύουν συγκεκριμένη διαδρομή ή τάξη μορίων. Αντίθετα, η μη στοχευμένη μεταβολιμική στοχεύει στον ποσοτικό προσδιορισμό και τον προσδιορισμό όσο το δυνατόν περισσότερων μεταβολιτών. Η στοχευμένη μεταβολική αναφέρεται στην απόλυτη ποσοτικοποίηση (nΜ ή mg/ml) και χρησιμοποιεί ένα εσωτερικό πρότυπο και ημι ποσοτική ή ποσοτική ανάλυση για τον εντοπισμό γνωστών ενώσεων που σχετίζονται με συγκεκριμένες οδούς. Η μη στοχευμένη προσέγγιση μετρά όλους τους παρόντες μεταβολίτες σε ένα δείγμα και εφαρμόζει σχετική ποσοτικοποίηση (αλλαγή πτυχών) και σύγκριση μεταξύ των δειγμάτων. Ο βασικός ρόλος που διαδραματίζει η μεταβολική στην ολοκλήρωση πολυ-omics και στη μοντελοποίηση του συστήματος οφείλεται στο γεγονός ότι μπορεί να είναι ποσοτικός. Η μοντελοποίηση συστημάτων δεν μπορεί να πραγματοποιηθεί χωρίς ακριβείς τιμές ή ακριβείς συγκεντρώσεις ως εισόδους και, ομοίως, τα μοντέλα συστημάτων δεν μπορούν να επαληθευτούν εύκολα χωρίς ακριβείς, ποσοτικές συγκεντρώσεις ως εκροές. Η μεταβολική μπορεί να προσφέρει και τα δύο (ποσοτικά δεδομένα εισόδου και εξόδου), καθιστώντας τα εξαιρετικά πολύτιμα για τους μοντελιστές συστημάτων.

Λόγω της τεράστιας χημικής πολυπλοκότητας του μεταβολώματος, δεν μπορεί να μελετηθεί ολοκληρωμένα με μια μόνο τεχνολογία. Η παλαιότερη εφαρμογή της μεταβολικής χρονολογίας χρονολογείται από τη δεκαετία του 1970, όταν η αέρια χρωματογραφία -φασματομετρία μάζας χρησιμοποιήθηκε για τον σχηματισμό μεταβολιτών κλινικών δειγμάτων ούρων. Ο Nicholson και άλλοι στη δεκαετία του 1980 έκαναν ένα προφίλ κλινικών δειγμάτων με την εφαρμογή φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού. Η φασματομετρία μάζας σε συνδυασμό τόσο με υγρή χρωματογραφία όσο και με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση εφαρμόζονται επίσης στη μεταβολική για να συμπληρώσουν τις διαθέσιμες αναλυτικές τεχνικές. Ορισμένα από τα αναλυτικά εργαλεία που χρησιμοποιούνται για τους σκοπούς της μεταβολικής έρευνας εφαρμόζονται συχνά και τακτικά, ενώ άλλα έχουν συγκεκριμένους ρόλους και εφαρμόζονται λιγότερο συχνά.

• Αεριοχρωματογραφία- Φασματομετρία μάζας (GC-MS)- Μεταξύ των συνηθέστερα χρησιμοποιούμενων μεθόδων στη μεταβολική είναι η GC-MS. Όπως υποδηλώνει το όνομα, το GC-MS ενοποιεί δύο τεχνικές για να σχηματίσει μια ενιαία μέθοδο για την ανάλυση μιγμάτων χημικών. Η αέρια χρωματογραφία διαχωρίζει τα συστατικά ενός μίγματος και η φασματοσκοπία μάζας χαρακτηρίζει καθένα από τα συστατικά ξεχωριστά. Συνδυάζοντας τις δύο τεχνικές, κάθε μεταβολίτης σε ένα δείγμα μπορεί να αξιολογηθεί τόσο ποιοτικά όσο και ποσοτικά. Αυτή η χρωματογραφική τεχνική χρησιμοποιείται για τη μελέτη μεταβολιτών που έχουν χαμηλό σημείο βρασμού και οι οποίοι θα υπάρχουν στην αέρια φάση στο εύρος θερμοκρασιών 50-350 ° C. Αυτοί οι μεταβολίτες μπορεί να έχουν χαμηλό σημείο βρασμού στη βιολογικά φυσική τους μορφή ή το σημείο βρασμού ενός μεταβολίτη μπορεί να μειωθεί μέσω χημικής αλλοίωσης, γνωστής και ως χημική παραγοντοποίηση. Το δείγμα που περιέχει μεταβολίτες εισάγεται (εγχέεται) σε μια κινητή φάση, η οποία στην αέρια χρωματογραφία είναι ένα αδρανές αέριο όπως το ήλιο. Η κινητή φάση μεταφέρει το μίγμα δείγματος μέσω αυτής που αναφέρεται ως στάσιμη φάση. Οι μεταβολίτες διαχωρίζονται με βάση την προσρόφησή τους στη στατική φάση. Η στατική φάση περιέχεται συνήθως σε γυάλινη ή ανοξείδωτη στήλη και αντιπροσωπεύει μια χημική ουσία που μπορεί να προσροφήσει επιλεκτικά συστατικά σε ένα μείγμα δείγματος. Αλλάζοντας τα χαρακτηριστικά της κινητής φάσης και της στατικής φάσης, μπορούν να διαχωριστούν διαφορετικά μίγματα χημικών. Καθώς οι μεμονωμένοι μεταβολίτες εκλούονται από τη στήλη GC, εισέρχονται στον ανιχνευτή ιοντισμού ηλεκτρονίων (spec spec of mass). Εκεί, βομβαρδίζονται με ένα ρεύμα ηλεκτρονίων υψηλής ενέργειας (70 eV) που τους κάνουν να διασπώνται σε θραύσματα. Αυτά τα θραύσματα μπορεί να είναι μεγάλα ή μικρά κομμάτια των αρχικών μορίων. Το φάσμα μάζας που λαμβάνεται για μια δεδομένη χημική ένωση είναι βασικά το ίδιο κάθε φορά. Επομένως, το φάσμα μάζας είναι ένα δακτυλικό αποτύπωμα για το μόριο. Αυτό το δακτυλικό αποτύπωμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την οδοντοστοιχία της ένωσης.
• Υγρή χρωματογραφία-Φασματομετρία μάζας (LC-MS)-Η κύρια διαφορά μεταξύ GC-MS και LC-MS είναι ότι στην υγρή χρωματογραφία (LC), η κινητή φάση είναι ένας διαλύτης. Το LC διαχωρίζει μίγμα μεταβολιτών που είναι σε υγρή μορφή, συνήθως περιέχει μεθανόλη, ακετονιτρίλιο και νερό. Με τη χρήση διαφορετικών στηλών (διαφορετική στατική φάση) με υψηλή απόδοση μπορεί να διαχωριστεί μικρή ποσότητα σύνθετου μίγματος. Οι στήλες που χρησιμοποιούνται στο HPLC αποτελούνται από συσκευασίες Octadecyl (C18), Octyl (C8), Cyano, Amino, Phenyl και γενικά το μήκος τους είναι περίπου 50mm έως 300mm. Οι στήλες χρησιμοποιούνται με βάση τη φύση των ενώσεων που πρόκειται να διαχωριστούν. Αυτό το μείγμα συστατικών που περιέχει υγρό μεταφέρεται στην πηγή ιόντων φασματομέτρου μάζας όπου λαμβάνει χώρα η διαδικασία ιοντισμού και σχηματίζονται σταγονίδια που περιέχουν περίσσεια θετικού ή αρνητικού ηλεκτρικού φορτίου. Ο ιονισμός θα μπορούσε να επιτευχθεί με τη χρήση διαφορετικών τύπων πηγών ιονισμού και διεπαφών. Μετά τον ιονισμό τα ιόντα μεταφέρονται στον Αναλυτή μάζας όπου ο διαχωρισμός των ιόντων γίνεται σύμφωνα με την αναλογία μάζας προς φορτίο (m/z).
• Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση-φασματομετρία μάζας (CE-MS)-αυτή η αναλυτική τεχνική ονομάζεται επίσης ηλεκτροφόρηση τριχοειδούς ζώνης-φασματομετρία μάζας. Το CE-MS περιλαμβάνει τον διαχωρισμό ιοντικών ειδών στην υγρή φάση μέσω της εφαρμογής υψηλών τάσεων και συνήθως συνδέεται με φασματομετρία μάζας ηλεκτροψεκασμού. Η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση διαχωρίζει τους μεταβολίτες με βάση την ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα σε ένα υγρό διάλυμα ηλεκτρολυτών που λειτουργεί σε ηλεκτρικό πεδίο. Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα εξαρτάται από το φορτίο και το μέγεθος του μεταβολίτη και έτσι είναι δυνατός ο διαχωρισμός μεταβολιτών με διαφορετικά μεγέθη και/ή φορτία. Όλοι οι μεταβολίτες πρέπει να φορτιστούν για να επιτραπεί οποιαδήποτε κινητικότητα.
  Στα GC-MS, LC-MS και CE-MS υπάρχει διαχωρισμός των μεταβολιτών πριν από την ανίχνευσή τους με φασματομετρία μάζας. Αυτή η ιδιαιτερότητα παρέχει την ικανότητα ανίχνευσης μεταβολιτών σε χαμηλές συγκεντρώσεις, συνήθως νανομόρια/λίτρο (nM/L) ή μικρομόρια/λίτρο (μM/L).
• Η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) είναι τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα αναλυτικά όργανα στη μεταβολική έρευνα μαζί με τη φασματομετρία μάζας. Η φασματοσκοπία NMR εφαρμόζει τις μαγνητικές ιδιότητες των ατομικών πυρήνων σε έναν μεταβολίτη. Μόνο μερικά άτομα είναι NMR ενεργά και περιλαμβάνουν 1Η, 13C και 31P. πρωτόνιο (1 Η). Η τεχνική λειτουργεί με την τοποθέτηση υγρού δείγματος σε σωλήνα μικρής εσωτερικής διαμέτρου (για παράδειγμα σωλήνα 5 mm), ή περιστασιακά μελετάται ένα κομμάτι ιστού απευθείας με τη χρήση ειδικής υποδοχής δείγματος. Το δείγμα είναι παλλόμενο με μια σειρά ραδιοσυχνοτήτων που καλύπτουν όλες τις πιθανές ενέργειες που απαιτούνται για τη διέγερση του επιλεγμένου τύπου πυρήνων. Οι πυρήνες απορροφούν ενέργεια σε διαφορετικές ραδιοσυχνότητες ανάλογα με το χημικό τους περιβάλλον και στη συνέχεια μετριέται η απελευθέρωση αυτής της ενέργειας, σχηματίζοντας μια ελεύθερη σήψη επαγωγής (FID). Αυτό το FID μετατρέπεται από ένα σύνολο δεδομένων χρονικού πεδίου σε ένα πεδίο συχνοτήτων – χρησιμοποιώντας έναν μετασχηματισμό Fourier – και ένα φάσμα NMR κατασκευάζεται καθώς η χημική μετατόπιση (ουσιαστικά η ενέργεια απορρόφησης) σχεδιάζεται σε σχέση με την ένταση αιχμής.
• Τεχνικές δόνησης φασματοσκοπίας όπως η φασματοσκοπία μετασχηματισμού-υπέρυθρης ακτινοβολίας Fourier (FT-IR) και η φασματοσκοπία Raman εφαρμόζονται για την ανάλυση των μεταβολικών μεταβολών στα βιολογικά δείγματα. Η αρχή της τεχνικής βασίζεται στη μετάδοση υπεριώδους ή υπέρυθρου φωτός μέσω ενός δείγματος, ή μερικές φορές ανάκλαση του φωτός από το δείγμα, πριν από την ανίχνευσή του. Οι προσεγγίσεις μετρούν κυρίως τις δονήσεις και τις περιστροφές των δεσμών που σχετίζονται με διαφορετικές χημικές λειτουργικές ομάδες που προκύπτουν από την αλληλεπίδραση του δείγματος με το υπεριώδες ή το υπέρυθρο φως. Αυτές οι τεχνικές συνήθως στερούνται της ειδικότητας για την ανίχνευση κάθε μεταβολίτη ξεχωριστά, αλλά αντίθετα συγκεκριμένα μέρη του μορίου απορροφούν το υπεριώδες ή υπέρυθρο φως σε συγκεκριμένα μήκη κύματος. Για παράδειγμα, στο FT-IR, παρατηρούνται δονήσεις τεντώματος CH χαρακτηριστικές των αλυσίδων λιπαρών οξέων μεταξύ του εύρους του αριθμού κυμάτων 3100-2800 cm-1 και η περιοχή μεταξύ 1800 και 1500 cm-1 κυριαρχείται από ζώνες αμιδίου Ι και αμιδίου II που υποδεικνύουν την υπεροχή είτε δομές άλφα έλικας είτε βήτα φύλλων.

Στον τομέα της μεταβολικής, πολλές εκατοντάδες δείγματα αναλύονται τακτικά και συνήθως ανιχνεύονται τουλάχιστον μερικές εκατοντάδες μεταβολίτες. Τα δεδομένα που λαμβάνονται από την ανίχνευση μεταβολιτών σε δεδομένα βιολογικά δείγματα ακολουθούνται από περαιτέρω ανάλυση χρησιμοποιώντας στατιστικές μεθόδους πολλαπλών μεταβλητών (χημειομετρικά) για την εξαγωγή βιολογικών, φυσιολογικών και κλινικά σχετικών πληροφοριών.

Η εφαρμογή των τεχνολογιών omics και η ενσωμάτωση δεδομένων omics έχει πραγματοποιηθεί για ένα ευρύ φάσμα ερευνητικών τομέων, συμπεριλαμβανομένων των επιστημών τροφίμων και διατροφής, μικροβιολογίας συστημάτων, ανάλυσης μικροβιωμάτων, αλληλεπιδράσεων γονότυπου -φαινοτύπου, βιολογίας συστημάτων, ανακάλυψης φυσικών προϊόντων και βιολογίας ασθενειών. Πρόσφατα οι προσεγγίσεις βασισμένες σε omics βελτιώθηκαν σημαντικά με την προσθήκη νέων εννοιών όπως η έκθεση σε έκθεμα/εκθεματολογία (ο ρόλος του περιβάλλοντος στις ασθένειες του ανθρώπου), η επαγωγική (μελέτη ενώσεων που δεσμεύουν το DNA και προκαλούν βλάβες και μεταλλάξεις), πτητική (μελέτη πτητικών οργανικών ενώσεων στη μεταβολική/λιπιδωμική ανάλυση), nutrigenomics (μελέτη του τρόπου με τον οποίο τα τρόφιμα επηρεάζουν τα γονίδιά μας), κλπ. Ωστόσο, οι τεχνολογίες omics απευθύνονται κυρίως σε τέσσερα ερευνητικά πεδία omics – γονιδιωματικά, μεταγραφικά, πρωτεομικά και μεταβολικά. Τα παραδοσιακά ερευνητικά πεδία όπως η γενετική, η φαρμακογενετική και η τοξικογενετική που δεν εφαρμόζουν την έννοια της omics, παρέχουν τις στατικές ακολουθίες γονιδίων και πρωτεϊνών. Αντίθετα, οι τεχνολογίες omics παρέχουν ταυτόχρονη μέτρηση του αριθμού των πρωτεϊνών, των γονιδίων, των μεταβολιτών και καθιστούν δυνατή τη λήψη δεδομένων μεγάλης κλίμακας σε σύντομο χρονικό διάστημα. Η συλλογική ανάλυση των βιολογικών διεργασιών σε ένα βιολογικό σύστημα που παρέχεται από όλα τα ομόλογα είναι ένα πλεονέκτημα για τις προηγούμενες παραδοσιακές μεθόδους για την καλύτερη κατανόηση της συνολικής εικόνας του βιολογικού συστήματος. Αν και τα μεγάλης κλίμακας δεδομένα omics γίνονται πιο προσιτά, η ενσωμάτωση πραγματικών δεδομένων πολυ-omics εξακολουθεί να είναι πολύ δύσκολη. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι πολλά από τα συγκεκριμένα αναλυτικά εργαλεία και πειραματικά σχέδια που χρησιμοποιούνται συμβατικά για μεμονωμένους κλάδους omics (γονιδιωματική, μεταγραφική και πρωτεομική) δεν είναι επαρκώς κατάλληλα για να επιτρέψουν αξιόπιστες συγκρίσεις και ενσωμάτωση σε πολλαπλούς κλάδους omics. Για παράδειγμα, οι μέθοδοι συλλογής και αποθήκευσης δειγμάτων και η ποσότητα και ο τύπος των βιολογικών δειγμάτων που απαιτούνται σε μελέτες γονιδιωματικής, συχνά δεν είναι συμβατές με μεταβολικά, πρωτεομικά ή μεταγραφικά. Κατά τη συλλογή δεδομένων, υπάρχουν πολλά προβλήματα όπως η ετερογένεια των δεδομένων, το μικρό μέγεθος δείγματος σε σύγκριση με πολλές παραμέτρους, η επιβεβαίωση και η ερμηνεία των δεδομένων λόγω πολλών αλληλεπιδράσεων στο βιολογικό σύστημα και ελλιπών πληροφοριών για αυτά τα συστήματα. Σχεδόν σε όλα τα πειράματα omics μετρούνται εκατοντάδες έως χιλιάδες μόρια και μεταβλητές στόχοι (μεταβολίτες, πρωτεΐνες, γονίδια, μεταγραφές και SNPs). Αυτό απαιτεί τη διερεύνηση επαρκούς αριθμού βιολογικών δειγμάτων με στόχο την παροχή στατιστικά αξιόπιστων αποτελεσμάτων. Επιπλέον, τα δεδομένα πολυ-omics πρέπει να δημιουργηθούν από το ίδιο σύνολο δειγμάτων για να επιτρέψουν την άμεση σύγκριση υπό τις ίδιες συνθήκες. Ωστόσο, αυτό δεν είναι πάντα δυνατό λόγω περιορισμών στη βιομάζα δειγμάτων, στην πρόσβαση δείγματος ή στους οικονομικούς πόρους. Σε πειράματα μεμονωμένων omics, συχνά απαιτούνται μεγαλύτερα μεγέθη δειγμάτων για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα. Επιπλέον, τα ενσωματωμένα δεδομένα πολλαπλών omics πρέπει να αναλυθούν ως ενιαία σύνολα δεδομένων πριν από την κατάθεσή τους σε συγκεκριμένες βάσεις δεδομένων omics, προκειμένου να είναι διαθέσιμα στο κοινό. Αυτά τα ζητήματα τονίζουν ότι για τις υψηλής ποιότητας μελέτες μεγάλης κλίμακας είναι απαραίτητο: 1) να σχεδιαστεί σωστά ένα πείραμα, 2) να συλλεχθούν, να προετοιμαστούν και να αποθηκευτούν τα βιολογικά δείγματα με προσοχή, 3) να συλλεχθούν ποσοτικά δεδομένα πολύ-omics και συναφή μετα-δεδομένα 4) va χρησιμοποιηθούν κατάλληλα εργαλεία για την ενσωμάτωση και την ερμηνεία των δεδομένων.

Ορισμένα από τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα των κύριων τεχνολογιών omics συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Πίνακας 1. Πλεονεκτήματά και μειονεκτήματα των κυριότερων τεχνολογιών έρευνας omics

Τα σύνολα δεδομένων πολλαπλών omics μπορούν να παρέχουν μεγαλύτερο βάθος κατανόησης σε ορισμένα σενάρια, αλλά αυτό δεν είναι χωρίς κόστος. Αυτές οι μελέτες βασίζονται συχνά σε μεγάλο αριθμό συγκρίσεων, σωστού τύπου δεδομένων, σχετικών στατιστικών αναλύσεων, ειδικού εξοπλισμού και εξειδικευμένου προσωπικού και σημαντικής επένδυσης χρόνου και χρημάτων. Κατά τον σχεδιασμό ενός πειράματος πρέπει να ληφθούν υπόψη οι τύποι των δεδομένων omics που μπορούν και πρέπει να ενσωματωθούν για να αποκτήσουν ισχυρές βιολογικές γνώσεις του συστήματος που μελετάται. Η εφαρμογή πλατφορμών omics υψηλής απόδοσης δεν είναι πάντα απαραίτητη για να απαντήσει το ερευνητικό ερώτημα. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από τις παραδοσιακές τεχνικές, όπως η ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR), η ενζυματική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA), η ανοσοϊστοχημεία (IHC), μερικές φορές μπορεί να είναι αρκετά για να κατανοηθούν οι βιολογικοί μηχανισμοί. Αυτές οι τεχνικές συχνά συμπληρώνουν τα ευρήματα από μια μεγαλύτερη μελέτη omics καθώς εφαρμόζονται για να επαληθεύσουν ότι το σημαντικό μόριο που εντοπίστηκε από δεδομένα omics είναι ένα πραγματικό θετικό αποτέλεσμα.