През последните десетилетия бързият напредък на молекулярната биология и постиженията в тази научна област са пряко свързани с напредъка в компютърните науки и разработването на нови софтуерни инструменти.

Системна биология и Омикс технологии: Голямата картина

През последните десетилетия бързият напредък на молекулярната биология и постиженията в тази научна област са пряко свързани с напредъка в компютърните науки и разработването на нови софтуерни инструменти. Прилагането на различни омикс технологии (геномика, епигеномика, транскриптомика, протеомика, метаболомика и др.), води до натрупване на разнообразни биологични данни и тяхната комбинирана интерпретация отваря нови възможности за учените да преминат от изучаване на изолирани биологични молекули към анализ на широк набор от биологични молекули. Биологичните науки се превърнаха в науки на големи множества биологични данни, които имат все по-голямо значение за решаване на проблеми, свързани с човешкото здраве и околната среда. Предизвикателствата на големите биологични данни са не само техният размер, но и нарастващата им сложност.

Системната биология възниква като нова интердисциплинарна област на изследване, която спечели огромно внимание през последните няколко години. Въпреки че терминът „системна биология“ е използван в различни случаи, по принцип той описва изследвания, които комбинират биологията с на пръв поглед различни дисциплини като физика, биохимия, инженерство, биостатистика, математика, компютърни науки, биоинформатика и други. Основната цел на тази интердисциплинарна област е да се получат паралелни знания за биологичните системи на молекулярно ниво и да се разбере как те функционират като цяло вместо като сума от отделни компоненти. Чрез изясняване на молекулярните механизми и процеси на различни системни нива в организма или клетката, може да се предвиди как тези системи се променят с течение на времето и при различни условия. Голямото количество информация, получена на молекулярно ниво относно клетъчната физиология и организация, би могла да предостави решения, касаещи заболявания, токсичност, терапии, откриване на лекарства и др.

Системната биология стартира като отделна дисциплина през 50-те години на миналия век, с работата на системните теоретици Михайло Месарович и Лудвиг фон Берталанфи върху общата теория на системите. Основната концепция на тази теория е, че динамиката на всяка система е резултат от взаимодействието между отделните й единици, които определят нейната функция. По това време, чрез задълбочено изучаване на ензимите и кинетиката на ензимните реакции, биохимици, последователи на системната теория, се опитват да изследват поведението на биохимичните пътища като единна мрежа вместо като сума от отделни части. Извън полето на биохимията, Райнхарт Хайнрих разработва теоретични подходи за описание и количествено изследване на сигналните пътища и създава теория за метаболитния контрол. Необходимостта от интегриран подход за по-подробно проучване и разбиране на сложните биологични процеси става очевидна. Системната биология е силно зависима от биологичната информация, получена чрез молекулярно-биологични и / или индивидуални омикс методи, но те често се определят като редукционистки подходи и се базират до голяма степен на хипотези. В редукционисткия подход се изследват функционалните свойства на отделните молекулни компоненти в сложните биологични системи. След приключването на проекта за човешкия геном, съвременната наука се развива отвъд ген-центрираните възгледи на по-ранната геномна ера. Този период, определен като постгеномна ера, се характеризира със значителни промени в научните изследвания и интерпретацията на резултатите и според Блум това е краят на „наивния редукционизъм“. Независимо от това, че само тези класически методи не могат да осигурят пълно разбиране за живите организми, те ще продължат да бъдат съществен елемент от всички биологични изследвания. В този контекст системната биология е причина за коренната промяна в традиционните подходи. Тя използва нов холистичен подход, генериращ хипотези, като се фокусира върху изучаването на подсистемите, което позволява по-задълбочено разбиране на целия процес. Пътят на усвояване на галактоза (GAL) при дрожди Saccharomyces cerevisiae е един пример за прилагане на подхода на системната биология с цел препрочитане и интерпретация на резултатите, получени чрез редукционисткия подход (един ген / един протеин). Въз основа на експериментални данни, получени от анализи на нивата на протеини и РНК, както и на взаимодействия протеин-протеин и протеин-ДНК и тяхното интегриране в единен модел, е представена нова хипотеза за регулацията на GAL пътя, която след това е е потвърдена експериментално. Чрез използването на изчислителни и математически инструменти се събират и интегрират голямо количество експериментални данни от системната биология, за разкриване на неизвестни модели и генериране на хипотези. Това е важна стратегия за получаване на нови познания за биологичните системи и също така за подпомагане дизайна и разработването на експерименти.

Системният подход, който се прилага при изучаване на биологичните системи има за цел да изясни следните три въпроса в контекста на молекулярната мрежа: i) какви са отделните компоненти на системата; ii) как работят поотделно? и iii) как тези компоненти работят заедно, за да осъществят съответна функция? В контекста на молекулярните мрежи основната цел на системната биология може да бъде обобщена, както следва: (i) разбиране на структурата на всички компоненти на клетка / организъм до молекулярно ниво, (ii) способност да се предскаже бъдещото състояние на клетката / организма при нормални условия, iii) способност да се предскажe отговор към даден входящ стимул и iv) способност да се оценят промените в поведението на системата при смущение на отделните компоненти или обкръжаващата среда. Терминът “система” в системната биология дефинира различен диапазон на сложност, вариращ от две макромолекули, които взаимодействат за изпълнение на определена задача до цели организми (Фиг. 1).

Фиг. 1. Основни видове биологични мрежи. A. Протеин-протеин взаимодействие; B. Генна регулаторна мрежа; C. Метаболитна мрежа; D. Различни видове мрежи в клетката

По този начин системната биология споделя обща научна цел с дисциплината физиология, която е посветена на изучаването на интегрираната функция на цялата сложна биологична система. Организмите са много повече от сумата от техните части и комплексността на физиологичните процеси не може да бъде разбрана само чрез изучаване на функцията на индивидуалните компоненти. Например, гените кодират първичната структура на клетъчните протеини, които от своя страна изпълняват специфични функции, поддържащи клетъчния метаболизъм и физиологията и развитието на организма. В същото време протеините във всяка клетка не действат изолирано, а в сложна мрежа, която има важно значение за определяне на даден фенотип. Повечето биологични процеси са силно динамични и често включват повече от един тип молекули. В същото време един фенотип може да бъде обусловен от няколко различни молекулярни и епигенетични механизми и един тип молекула може да бъде включена в различни фенотипи. Всъщност, дори в един и същ организъм, даден протеин може да изпълнява различна функция в различни клетки; или ефекторите на сигналния път могат да индуцират различни диференциращи програми в различни клетъчни линии. Нещо повече, отделните клетки в многоклетъчните организми не могат да съществуват независимо от целия организъм, те са онтогенетично свързани.

Независимо от общата им цел, системната биология и физиологията използват различни инструменти и експериментални подходи, което води до получаване на различен набор от експериментални данни. Интердисциплинарната системна биология е съвременно бързо развиващо се направление поради факта, че използва различни методи и инструменти, включително мащабна функционална геномика и други омикс технологии, биоинформатика и компютърно моделиране, които не се от физиолозите. Ролята на изчислителната биология в системната биология е да обработва и анализира огромни количества емпирични данни, получени от различни омикс нива, което от своя страна води до натрупване на нови биологични знания и генериране на изследователска хипотеза. Прилагането на in silico анализи и такива, базирани на симулация дава възможност да се правят прогнози, които допълнително се потвърждават с експериментални анализи. Бързият напредък на информационните технологии, включително и подобряването на публичните уеб бази данни с биологична информация, също подпомага развитието на омикс изследванията и съответно води до прогрес в системната биология.

От решаващо значение за цялостното изучаване на биологичните процеси е да се разбере как отделните биологични нива (геном, епигеном, транскриптом, протеом, метаболом и йоном), взаимодействат помежду си в рамките на една клетъчна система, и как се осъществява потокът от биологична информация. За създаването на детайлна и точна картина на живите организми се изисква комбинираното прилагане на различни омикс анализи, използвайки мулти-омикс подход. Данните от транскриптомиката, протеомиката и метаболомиката, независимо едни от други,  могат да отговорят на ключови биологични въпроси, свързани с експресията на транскрипти, протеини и метаболити, но системната мулти-омикс интеграция може цялостно да асимилира, анотира и моделира тези големи масиви от данни.

Преносът на генетична информация в биологичните системи се осъществява от ДНК към иРНК към протеин и това се посочва като Централна догма в молекулярната биология. Трите основни процеса във всяка клетка са репликация, транскрипция и транслация. Техният постоянен поток осигурява поддържането и превръщането на генетичната информация, кодирана в ДНК в генни продукти, които са или РНК, или протеини, в зависимост от гена. Репликацията е процес на удвояване на ДНК в клетката и е в основата на биологичното унаследяване. Той се осъществява от ензима ДНК полимераза, който копира единична родителска двуверижна ДНК молекула в две дъщерни двуверижни ДНК молекули. Ензимът РНК полимераза създава молекула РНК от ДНК и този процес е известен като транскрипция. Новосинтезираната РНК молекула е комплементарна на ген- кодиращ участък от ДНК. При транслацията се осъществява синтеза на протеин, направлявано от молекула иРНК. Рибозомата генерира полипептидна верига от аминокиселини, използвайки иРНК като матрица. Полипептидната верига се нагъва, за да стане протеин. В еукариотните клетки (клетки, които имат ядро), репликацията и транскрипцията се извършват в ядрото, докато транслацията се извършва извън ядрото в цитоплазмата. В прокариотните клетки или тези клетки, които нямат ядро, и трите процеса протичат в цитоплазмата. Фенотипът на организмите се определя от тази парадигма за предаване на информация. Години наред биолозите изучават тези „омикс“ нива под формата на геномика, транскриптомика и протеомика. Данните от тези експериментални подходи се допълват от епигеномика и метаболомика, които наскоро бяха използвани за решаване на специфични проблеми, свързани с много функции на организма. Бързото развитие и напредък в „омикс“ технологиите определят постепенното разширяване на обема информация, която може да бъде събрана при отделни изследвания.

В допълнение, високопроизводителния характер на тези техники увеличи достъпността до тази информация по отношение на време и разходи. Много изследователи са поставени в ситуация, в която могат да съберат няколко набора от омикс данни за едни същи експериментални проби. С цел да се получат по-всеобхватни заключения относно биологичните процеси, тези масиви от данни трябва да бъдат интегрирани чрез мулти-омикс подход и анализирани като холистична система (Фиг. 2).

Фиг. 2. Интегрирани омикс подходи в системната биология

Терминът „Омикс“ произлиза от гръцка дума и добавянето на наставката -ome към наименованието на клетъчни молекули, като ген, транскрипт, протеин, метаболит, придава значението на „цяло“, „всичко“ или „пълно“. Различните нива в клетката, състоящи се от ДНК и модификации (геном, епигеном), РНК и протеини (транскриптом, протеом), малки молекули (метаболом, липидом) и елементи (обозначени като „йоном“), могат да бъдат анализирани чрез омикс технологии. Интегрирането на „омикс“ нивата в мулти-омикс набор от данни се осъществява чрез системната биология, която е в състояние да разкрие механизмите и взаимодействията между отделните нива, както и функцията на тъканите, органите и целия организъм. Омикс подходите включват по-голям брой измервания за крайна точка и въпреки че броят на измерените параметри за анализ се увеличава, броят на повторенията намалява. Това, от една страна, се дължи на прецизността на методите, тъй като се счита, че повече измервания биха компенсирали малкия брой проби, а от друга страна се дължи на цената и времето на омикс експериментите.

Индивидуалните омикс дисциплини са насочени към изучаване на специфични биологични проблеми, без да се изисква предварително разбиране на биологичните основи, които са включени. В зависимост от вида на биомолекулата, върху която основно се фокусират в конкретна биологична проба, омикс технологиите се делят на: геномика (геном / ген), метагеномика (геноми, получени директно от проби от околната среда), епигеномика (поддържаща структура на генома, включително протеин и РНК свързващи вещества, алтернативни структури на ДНК и химически модификации на ДНК), транскриптомика (иРНК), протеомика (пептиди / протеини), метаболомика (метаболити), липидомика (липиди) гликомика (въглехидрати и захари), йономика (йони).

Въпреки че нито една от съвременните омикс технологии не е съвършена, някои от тях успяват да предоставят по-цялостна картина на съответното биологично ниво, което изучават, за разлика от други. Този факт се дължи не само на различия в нивото на технологично развитие, но и на разлики в химичната и физична сложност на всяко биологично ниво.

Геномика

Геномиката е систематично изследване на всички гени на даден организъм (геном), включително взаимодействието на тези гени помежду им и с обкръжаващата среда на организма. Геномът е основното биологично ниво в клетката и представлява общата ДНК на клетка или организъм. Дезоксирибонуклеиновата киселина (ДНК) е химичното съединение, което съдържа цялата генетична информация, необходима за развитието и функционирането на почти всички живи организми. ДНК молекулите са изградени от две усукани, сдвоени вериги, често наричани двойна спирала. Всяка ДНК верига е изградена от четири нуклеотидни бази – аденин (А), тимин (Т), гуанин (G) и цитозин (С), които се сдвояват специфично в противоположните вериги: А винаги се сдвоява с Т; a C винаги се сдвоява с G. Последователността от три съседни нуклеотида (кодон) кодира специфична аминокиселина по време на белтъчната синтеза или транслация. Редът на нуклеотидите по протежение на ДНК молекулите определя генетичния код. Генетичният код е универсален, тъй като е един и същ сред всички организми и също е дегенеративен, защото 64 кодона кодират само 22 аминокиселини. Със своя четирибуквен език ДНК съдържа информацията, необходима за изграждането на цял организъм. Генът представлява единица ДНК, която носи кодове за синтезата на специфичен протеин или набор от протеини. Въз основа на присъщата комплементарност на нуклеотидните бази в ДНК стана възможно бързото секвениране на огромен брой геноми на относително ниска цена. От ефективно секвенираните геноми могат да се направят прогнози за РНК и протеинови последователности, които се комбинират в мулти-омикс подходи. Дигиталната форма на ДНК последователностите, като вид биологична омикс информация, може лесно да се съхранява в биологични бази данни и да се споделя между учени по целия свят. Секвенирането на първия цял геном на бактерията Haemophilus influenza през 1995 г. направи революция в молекулярната биология. Натрупа се значителен обем от данни за нуклеотидни последователности, които не бяха напълно интерпретирани. Дешифрирането на съответната генетична информация от фоновия генетичен материал беше почти невъзможна задача. За да се преодолее това, беше необходима по-подробна биологична информация за транскрипцията на генетичния материал и последващата продукция на протеини.

Основно изследователско направление в областта на системната биология е функционалната геномика. Тази дисциплина разработва и използва мащабни и високопроизводителни методологии с цел определяне и анализ на генната функция на глобално ниво. За изучаването и разбирането на даден биологичен процес на ниво „система“ е много важно да се идентифицират гените и кодираните от тях протеини, които работят заедно, за да възникне този процес. Функционалната геномика е интегрираща научна област, която комбинира множество мащабни масиви от данни в опити да генерира представа за генната функция. Първоначално гените бяха анализирани индивидуално, но напредъкът на технологиите през последните години дава възможност за експресията на хиляди гени, които да бъдат анализирани едновременно. Този мащабен анализ на генната функция се нарича ДНК микроарей технология (Фиг. 3).

Фиг. 3. Схема на ДНК Микроарей анализ

ДНК микроарей анализът отчита разлики в нуклеотидната последователност на ДНК между индивидите и тази технология може да предостави информация за функцията на нехарактеризирани гени, а също така може да разкрие клъстери от взаимодействащи гени, които пораждат биологичен процес от интерес. Микроарей анализите може също да осигурят информация за механизмите на генна регулация, еволюция и етиологията на дадено заболяване. Например, анализът на данните от микрочипове може да разкрие аномалии като хромозомни инсерции и делеции или анормален хромозомен брой в процес, наречен сравнителна геномна хибридизация. Най-често срещаните вариации в ДНК последователностите между хора са единичните нуклеотидни полиморфизми (SNPs), при които един нуклеотид е заместен с друг; това може да има функционално значение, ако промяната доведе до кодон за различна аминокиселина. Те са от особен интерес, когато са свързани с генетично детерминирани заболявания. Профилирането на единичен нуклеотиден полиморфизъм също има роля във фармакогеномиката при изследване на индивидуалните реакции на пациентите към лекарства.

Епигеномика

Епигенетичните модификации като ДНК метилиране, хистонови модификации, 2D и 3D анализ на хроматиновата структура и некодираща РНК се изучават посредством методите на епигеномиката. Това -омикс направление се фокусира върху анализа на цялостните епигенетични промени, които предоставят важна информация относно механизмите и функцията на генната регулация при много гени в клетка или организъм. Учените са разбрали, че фенотипът на индивида не се контролира само от генома, но и от промените в регулацията на генната активност. Генетичните експерименти при хора и животни са доказали, че в допълнение към последователността на ДНК, епигенетичните белези могат да се предават от родител на потомство чрез гаметите и да влияят върху фенотипа на потомството.

Епигеномиката определя модификациите в регулацията на генните активности, които действат без или независимо от промени в секвенцията на гените. Някои определения ограничават епигенетиката / епигеномиката до модификации на фенотипа без промени в ДНК нуклеотидната последователност, които се предават на следващите поколения. Епигенетичните модификации са химични модификации, които не са кодирани от генома и те координират как и кога се експресират гените. Епигеномиката изследва наследствени, обратими модификации на ДНК и хроматин, които не влияят върху първичните нуклеотидни последователности. Докато терминът епигеномика би описал анализа на епигенетичните промени в много гени в клетка или в целия организъм, епигенетиката се фокусира върху процеси, които регулират как и кога специфичните гени се включват и изключват. Известно е, че няколко фактора влияят върху епигенетичната регулация: 1) Хранене (хранителни фактори); 2) Фактори на околната среда; 3) Излагане на радиация; 4) Инфекциозни агенти; 5) Имунологични фактори; 6) Генетични фактори; 7) Токсични агенти; 8) Мутагени.

За анализ на епигенетичните модификации в клетката се прилагат разнообразни методи за детекция. ДНК метилирането се анализира чрез първоначално срязване и бисулфитно секвениране на ДНК. При срязването геномната ДНК се фрагментира с чувствителни към метилиране и нечувствителни към метилиране ендонуклеази (рестриктази). Чувствителните към метилиране рестрикционни ензими разкъсват само неметилирана ДНК и оставят неразградени метилирани фрагменти от ДНК. Фрагментираната ДНК може да се анализира чрез секвениране или микрочипове и по този начин местата на метилиране се картографират. Недостатъкът на този метод е, че той изучава само ДНК последователностите близо до местата за срязване на избрани рестрикционни ензими и обикновено се използва за характеризиране на общите нива на ДНК метилиране, вместо за идентифициране на метилирана ДНК само при един остатък. Разделителната способност се подобрява чрез използване на метода на бисулфитно секвениране. Този специфичен за дадена ДНК верига метод се прилага за превръщане на неметилиран цитозин в урацил, докато остатъците от метилиран цитозин остават незасегнати. Получената ДНК се амплифицира чрез PCR и целевите фрагменти може да се анализират чрез секвениране. Анализът може да се извърши и с помощта на MALDI-TOF масспектрометрия или микрочипове. ДНК метилирането може да се изследва и чрез методи, базирани на принципа на афинитетна хроматография. Пробата, съдържаща фрагментирана ДНК, се зарежда в колона със свързан метил-свързващ домен (MBD) на MeCP2, специфичен за метилираната ДНК. Метилираните ДНК фракции се елуират и анализират с техники, като MBDCap-seq / MethylCap-seq. Друг подход е имунопреципитация на метилирана ДНК (MeDIP), която се основава на специфичното свързване на антитела към метилирания цитозин (5mC) в ДНК. Този метод се използва и за анализ на хидроксилиран метилцитозин (5 hmC). Пречистените фрагменти се анализират чрез PCR, секвениране или микрочипове.

Широко използвана техника за откриване на хистонови модификации е имунопреципитацията на хроматин (ChIP). Този метод се използва за идентифициране на локални посттранслационни модификации на хистоновите опашки и за наблюдение на промените в модификациите в отговор на различни стимули. Антитела срещу специфични хистонови модификации (като триметилиране на хистон Н3 лизин К27) се използват за имунопреципитация на тези хроматинови области, които имат тези модификации. ChIP може да се приложи и за изследване на свързването на транскрипционни фактори и ензими към хроматина, като се използва специфично антитяло срещу съответния транскрипционен фактор. Свързаните хроматинови региони могат да бъдат анализирани или чрез PCR за откриване на специфични локуси или пълно секвениране за по-глобален изглед, както и чрез използване на микрочип (ChIP-чип), но в последния случай разделителната способност на данните е по-слаба в сравнение със секвенирането. През последното десетилетие е разработен основният ChIP метод, който води до появата на други разнообразни ChIP методи, като μChIP-seq за микромащабен анализ на проби в малко количество и модерното едномолекулно секвениране в реално време (SMRT; “ трето поколение секвениране ”) на ChIP-проби.

Епигенетичните модификации също могат да бъдат изследвани чрез методи, идентифициращи активните области на хроматина. При метода DNase-seq ензимът ДНаза I се използва за срязване на ДНК, която не е защитена от нуклеозомна структура, така че регионите, които са чувствителни към ДНаза, са свързани с активни гени. Технологиите за секвениране, микрочипове или Southern Blot могат да се използват за анализ и интерпретация на резултатите. Отвореният хроматин може да бъде детектиран и чрез формоалдехид – свързано изолиране на регулаторни елементи (FAIRE), което води до изолиране на отворени хроматинови области, без нуклеозомни структури. Методът FAIRE (formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements) се основава на омрежването между формалдехид и ДНК, хистони и други протеини, свързани с нея. ДНК се обработва с ултразвук, за да се фрагментира и след това се изолира с екстракция с фенол-хлороформ. Само ДНК, която не е свързана с нуклеозоми и свързани протеини, остава във водната фаза при екстракцията, което води до изолиране на отворените и активните области на генома. Изолираните фрагменти могат да бъдат анализирани отново с различни методи, като PCR, микрочипове и секвениране. Хроматинът може също да бъде изследван чрез техника за улавяне на хроматинова конформация (3С), идентифицираща хроматинови области, които са физически свързани заедно, като промотори с енхансери. 3C често се анализира чрез PCR, но в днешно време и чрез дълбоко секвениране на взаимодействията в общ план (Hi-C).

Некодиращите РНК (ncRNAs) действат като епигенетични модификатори за силно регулиране на генната експресия. Тяхната „нетипична“експресия главно под формата на микроРНКи (miRNAs) и дълги некодиращи РНК-и може да промени генната експресия и да предизвика сложни нарушения в имунната система. За анализиране на РНК компонентата на епигенетиката най-често се използват геномни подходи, като се използват методи за секвениране от следващо поколение. Промените в ncRNA и иРНК могат да се изследват с помощта на дълбоко секвениране. Експресията на РНК може да се анализира и чрез количествена полимеразна верижна реакция (qPCR). Количественият PCR, известен също като PCR в реално време, е лабораторна техника в молекулярната биология, чрез която количеството на PCR продукта може да бъде определено в реално време и е много приложимо при изследване на генната експресия.

Транскриптомика

Когато се експресират гени, генетичната информация, съхранявана в ДНК, се прехвърля върху молекула РНК (рибонуклеинова киселина). РНК-ите са важни макромолекули, изградени от линейни вериги от нуклеотиди (Фиг. 4), които се синтезират в хода на клетъчния процес на транскрипция. РНК-ите изпълняват различни клетъчни и биологични функции, като могат да служат като матрица за синтеза на протеини, или да изпълняват важни каталитични и регулаторни функции. При транскрипцията генетичната информация се прехвърля от ДНК върху иРНК. Този процес се осъществява от ензим РНК полимераза. В клетките съществуват няколко класа РНК-и (матрична или информационна РНК (иРНК), транспортна РНК (тРНК), рибозомна РНК (рРНК), малка ядрена РНК (snRNA), малка нуклеоларна РНК (snoRNA), къса интерферираща РНК (siRNAs), микро РНК (miRNAs), дълга некодираща РНК (ncRNA) и псевдогени), но тези, които участват в синтезата на протеини, са иРНК, тРНК и рРНК. Информационната РНК (иРНК) е едноверижна молекула, която опосредства преноса на генетична информация към рибозомите, където се осъществява синтезата на протеините. При еукариотите всеки ген се транскрибира, за да се получи единична иРНК, докато при прокариотите една молекула иРНК може да носи генетичната информация от няколко гена, или за няколко белтък-кодиращи области. Съществува линейно съответствие между основната последователност на даден ген и аминокиселинната последователност на полипептид. Всяка група от три последователни нуклеотида кодира местоположението на определена аминокиселина в протеинова молекула и всеки такъв триплет от нуклеотидни бази се нарича кодон. Кодоните се транслират в аминокиселинни последователности от рибозомите (които сами по себе си са изградени от протеини и рРНК), тРНК-и и помощни протеини, наречени транслационни фактори.

Фиг. 4. Едноверижна структура на РНК с четирите нуклеотидни бази – Aденин, Гуанин, Цитозин и Урацил

Терминът „транскриптом“ се използва широко за обозначаване на пълния набор от всички молекули на рибонуклеиновата киселина (РНК) в клетка, тъкан или организъм. Транскриптомът отразява молекулярната активност в клетките, гените, които се експресират активно във всеки един момент. Той обхваща всички форми на РНК молекули, включително кодиращи протеини, некодиращи протеини, преминали алтернативен сплайсинг, алтернативно полиаденилирани, алтернативно инициирани, смислени, антисмислени и редактирани РНК транскрипти. Съответно, транскриптомиката изучава всички видове транскрипти в клетка или организъм, включително иРНК, miРНК и различни видове дълги некодиращи РНК (lncRNAs). Транскриптомиката обхваща всичко, свързано с РНК, като нива на транскрипция и експресия, функции, местоположения, пренос и разграждане. Тя също така включва структурите на транскриптите и техните родителски гени по отношение на началните сайтове, 5 ′ и 3 ′ крайните последователности, моделите на сплайсинг и посттранскрипционните модификации.

Основните изследвания на транскриптомиката са насочени към:

• характеризиране на различни състояния на клетките (т.е. етапи на развитие), тъкани или фази на клетъчния цикъл чрез експресионни модели;
• изследване на молекулярните механизми, обуславящи даден фенотип;
• идентифициране на биомаркери, които се експресират различно при нормално и болестно състояние;
• диференциация на етапи или подтипове на заболяването (например стадии на рак);
• установяване на причинно-следствената връзка между генетичните варианти и моделите на генна експресия, за да се изясни етиологията на заболяванията.

През последните три десетилетия технологичният напредък революционизира профилирането на транскриптоми и предефинира това, което е възможно да се изследва. Комбинирането на данни от транскриптомиката с данни от други омикс направления дава все по-интегрирана представа за клетъчната сложност, улеснявайки прилагането на холистичните подходи за биомедицинските изследвания.

Основните техники, прилагани за изследване на транскриптома, включват:

• Методи, базирани на експресирани секвенционни тагове (EST -Expressed Sequence Taq)
• Сериен анализ на генната експресия (SAGE – Serial Аnalysis of Gene Expression)
• ДНК чип, енен чип, биочип или микрочип анализ, базиран на хибридизация – (DNA microaaray)
• Real-Time PCR
• Полимеразна верижна реакция в реално време (RT PCR)
• РНК интерференция
• Биоинформатични инструменти за анализ на транскриптоми

Изборът на техниката зависи от ефективността на разходите, чувствителността, високата производителност и минималната концентрация на изходната РНК. Методологията включва изолиране на РНК, пречистване, количествено определяне, конструиране на библиотека от кДНК и високопроизводително секвениране.

• Методи, базирани на експресирани секвенционнни тагове – експресираните секвенционни тагове са относително къси ДНК последователности (около 200-300 нуклеотида), които обикновено се генерират от 3′ края на кДНК клоновете. От които могат да бъдат конструирани праймери за PCR, за откриване присъствието на специфична кодираща последователност в геномната ДНК. Секвенирането на експресираните тагове (EST) дава представа за нивото на генна експресия. Тъй като все повече данни за EST стават публично достъпни, използването на EST навлиза и в други области, като например in silico откриване на генетични маркери и гени, конструиране на генни модели, прогнозиране на алтернативен сплайсинг, анотация на генома, експресионни профили и сравнителна геномика. В сравнение със секвенирането на целия геном, EST технологията е по -проста и по -евтина, особено в случаите, когато се работи с големи геноми. Съществуват EST бази данни като dbEST (NCBI EST) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/dbest/), които съдържат данни за секвенции и друга информация за „еднопроходни“ cDNA последователности или „експресирани последователности“, от редица организми и по този начин служат като отправна точка за профила на експресия на организъм.
• Сериен Анализ на Генна Експресия (SAGE) е транскриптомна техника, използвана от учените за създаване на моментна снимка на популацията от иРНК в дадена проба под формата на малки тагове, които съответстват на фрагменти от тези транскрипти. Тази техника е с предимство пред EST (expressed sequenced tags), тъй като се секвенират само къси „тагове“, съставени от около 15 бази. Генерираните къси фрагменти се съединяват и се секвенират. Проба от кДНК може да бъде подложена на секвениране с висока точност, известно като RNA-seq, за количествено определяне, откриване на нови EST и профилиране на РНК.
• ДНК чип, генен чип, биочип или микрочип представлява съвкупност от ДНК, кДНК, олигонуклеотидни петна, прикрепени към твърда подложка като стъклен или силициев чип. Този метод се базира на хибридизацията и позволява да се следят едновременно нивата на експресия на хиляди гени. Основното му ограничение е, че информацията за нуклеотидната последователност на генома е необходимо условие, както и познания отнсно техниката на хибридизация.
• Количествен PCR анализ в реално време (qRT-PCR) е вид PCR за надеждно количествено определяне на ниски концентрации от иРНК или транскрипти в малък брой копия. Основните предимства на тази техника са нейната висока чувствителност, по-добра възпроизводимост и широк диапазон на динамично количествено определяне. qRT-PCR улеснява изследванията на генната експресия и регулация дори в една клетка, въз основа на експоненциалната му амплификация. Наличието на различни видове системи за наблюдаване на флуоресценция, свързани с PCR апарата, доведе до широкото използване на qRT-PCR при проучвания на генната експресия. Проблеми като неспецифичното амплифициране и образуване на димери от праймери, са някои от ограниченията на тази техника.
• РНК-секвенирането е една от модерните високопроизводителни технологии, прилагани в транскриптомиката. RNA-seq, известно също shotgun секвениране на цял транскриптом, използва инструменти за секвениране с висока точност (Next Generation Sequences). Предимствата на RNA-seq са, че то не разчита на наличността на геномни последователности, няма горни граници за количествено определяне, показва висока възпроизводимост и притежава голям диапазон на детекция.

Напредъкът на транскриптомиката доведе до редица биологични открития. Тази омикс технология постави основата на първите истински мулти-омикс изследвания, базирани на сравнения между ДНК последователност и експресия на иРНК. В днешно време транскрипционният анализ остава по-често използван от повечето биолози, тъй като получените данни все още се анализират и споделят по-лесно от „следващите по веригата омикс направления“ като протеомика и метаболомика. Съвсем наскоро транскриптомиката ще се радва на втори възход, тъй като в много случаи тя е приложима за единични клетки.

Протеомика

Протеините „дирижират“ клетъчната структура и активност, осигуряват механизмите за сигнализация между клетките и тъканите и катализират химичните реакции, които подпомагат метаболизма. Протеиновата структура диктува функцията (или дисфункцията). Протеините могат да бъдат основната причина за заболявания (като болестта на Алцхаймер или Хънтингтън) и могат да се използват за лечение (напр. антителата се използват като терапевтични средства срещу вирусни и бактериални инфекции). Наборът от всички експресирани протеини в дадена биологична система, при определени специфични условия, е известен като протеом. Думата „протеом“ е комбинация от протеин и геном и е въведена от Марк Уилкинс през 1994 г.

Основната цел на протеомиката е мащабен експериментален анализ на структурата и функцията на целия набор от протеини, синтезирани от всеки жив организъм. Терминът „протеомика“ се появява за първи път през 1997 година и се отнася до основна технология в подходите на системната биология, която изучава протеома. Функцията на клетките зависи от протеините, които присъстват във вътрешното и междуклетъчното пространство и тяхната концентрация. Синтезата на протеини в клетката се основава на прекурсори на иРНК, но е невъзможно да се предвиди изобилието на специфични протеини само въз основа на анализ на генната експресия. Причината за това е, че нативните протеини претърпяват посттранслационни модификации (PTM) или изменения в отговор на промените в околната среда. Протеомът е динамично отражение както на гените, така и на околната среда и е ценен източник за откриването на биомаркери, тъй като протеините е най-вероятно да се повлияят повсеместно при заболяване или в отговор към него. Пълното характеризиране на всички протеини е цел на протеомиката от нейното създаване преди почти 25 години. Тя се стреми не само да идентифицира протеините, които потенциално се откриват в дадена проба, но също така да ги оценява по отношение на концентрация, локализация, посттранслационни модификации, изоформи и молекулярни взаимодействия. Протеомиката има за цел да изследва потока от биологична информация чрез протеинови пътища и мрежи, с крайната цел да се разбере функционалното значение на протеините. Това изисква разработването на технологии, които могат да детектират широк спектър от протеини в проби от различен произход. В протеомиката се използват различни технологии и най-често се прилагат в комбинация, например едно- или двуизмерна гел електрофореза с масспектрометрия (МS) или течна хроматография и МS.

Конвенционалните техники за изолиране и пречистване на протеини са на базата на хроматография, като йонообменна хроматография (IEC), хидроксиапатитна хроматография, гел хроматография и афинитетна хроматография. За анализ на определени протеини може да се използва ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) и Western blotting анализ. Тези техники могат да се прилагат за анализ на отделни протеини, но те не могат да определят нивото на експресия на даден протеин. За разделяне на смеси от протеини (пептиди и белтъци) се използват натриев додецил сулфат-полиакриламидна гел електрофореза (SDS-PAGE), двуизмерна гел електрофореза (2-DE) и двуизмерна диференциална гел електрофореза (2D-DIGE).

• Масспектрометрията (MS) позволява анализ на протеоми и обикновено е предпочитаният метод за идентифициране на протеини, присъстващи в биологичните системи. Трите основни приложения на МS в протеомиката са: създаване на каталог на протеиновата експресия, определяне на протеиновите взаимодействия и идентифициране на местата в протеиновата молекула, претърпяли модификация. Масспектрометрията измерва съотношението маса към заряд (m/z) на йони в газова фаза. Масспектрометрите се състоят от: йонен източник, който превръща молекулите на аналита в йони в газова фаза; масов анализатор, който разделя йонизираните вещества в зависимост от m/z съотношението; детектор, който записва броя йони при всяка стойност на съотношението m/z. С развитието на електроспрей йонизацията (ESI) и лазерната десорбционна йонизация с помощта на матрица (MALDI), две техники за мека йонизация, способни да йонизират пептиди или протеини, настъпи революция в протеиновия анализ с помощта на МS. Масовият анализатор заема централно място в MS. За изследвания в протеомиката обикновено се използват четири типа масови анализатори: квадруполни (Q), йонен капан (квадруполни с йонен капан (QIT); линейни с йонен капана (LIT) или квадруполни – линейни с йонен капан (LTQ), време на летене (TOF) и циклотрон-резонансен йон-трансформиращ масанализатор на Фурие (FTICR). Те се различават по своите физични принципи и аналитични показатели. Проектирани са „хибридни“ инструменти, които комбинират възможностите на различни масанализатори и включват Q-Q-Q, Q-Q-LIT, Q-TOF, TOF-TOF и LTQ-FTICR.
• Тандем масспектрометрията е допълваща експериментална процедура, известна още като MS/MS или MS². Това е ключова техника за секвениране на протеини или пептиди и анализ на пост-транслационните модификации, при която се свързват два или повече масанализатора. Молекулите в дадена проба са йонизирани и първият масанализатор (обозначен като MS1) разделя тези йони въз основа на тяхното съотношение маса/заряд (често дадено като m/z или m/Q). Йоните с определено съотношение m/z, които постъпват от MS1, се изолират и фрагментират до по-малки фрагментни йони, напр. чрез дисоциация, индуцирана от сблъсък (CID), дисоциация с улавяне на електрони (ECD), дисоциация чрез електронен трансфер (ETD), реакция на йон-молекула или фотонна дисоциация. След това фрагментните йони се въвеждат във втория масанализатор (MS2), който от своя страна разделя фрагментите според тяхното съотношение m/z, като се измерва тяхната молекулна маса в MS/MS режим. Етапът на фрагментиране дава възможност за идентифициране и разделяне на йони, които имат много сходни m/z-съотношения в обикновените масови спектрометри.Сложността на биологичните системи изисква протеините, съставящи протеомът да бъдат разделени преди анализ. Разделянето на протеините чрез гел или течна хроматография се оказва полезно за тази цел. Обикновено, след разделянето, протеините се характеризират чрез МS анализ или като интактни протеини, или като ензимно разградени протеинови пептиди. Идентификацията на протеините се осъществява чрез сравняване на измерените маси на интактните протеини или разградени протеинови пептиди с изчислените маси, получени от данните за генома.
• Изобарно Tag белязване (ITL) е често използван метод за количествено определяне на протеините. В протеомиката количественото определяне на изобилието на протеините заема основно място. Нивата на експресията им представят баланса между транслацията и разграждането на протеините в клетките. Следователно се приема, че изобилието на специфичен протеин е свързано с неговата роля в клетъчната функция. ITL предоставя възможност за едновременно идентифициране и количествено определяне на протеини от множество проби в един анализ. За да се измери количеството протеини в дадена проба, пептидите се белязват с химични маркери– етикети, тагове (tags), които имат еднаква структура и номинална маса, но варират в разпределението на тежките изотопи в тяхната структура. Тези тагове, обикновено наричани тандемни масови тагове, са конструирани така, че по време на тандемна масспектрометрия при дисоциация, предизвикана от сблъсък с по-висока енергия (HCD), масовият таг да се разцепи в специфична линкерна област, в резултат на което се получават репортерни йони с различна маса. Количественото определяне на протеина се осъществява чрез сравняване на интензитетите на репортерните йони в MS/MS спектрите. Други количествени техники са ICAT (Изотопно афинитетно белязване) и SILAC (Стабилно Изотопно Белязване с Аминокиселини в Клетъчна Култура). ICAT също разшири диапазона от протеини, които могат да бъдат анализирани и позволява точното количествено определяне и идентифициране на аминокиселинната последователност на протеини в сложни смеси. SILAC е MS-базиран подход за количествена протеомика, който зависи от метаболитното белязване на целия клетъчен протеом. Протеомите от различни клетки, инкубирани в клетъчна култура, се белязват с „лека“ или „тежка“ форма на аминокиселини и се диференцират чрез масспектрометрия.
• Рентгеновата кристалография и спектроскопията с ядрено-магнитен резонанс (ЯМР) са две основни високопроизводителни техники, осигуряващи информация за триизмерната (3D) структура на протеина, която може да бъде приложима при разбиране на неговата биологична функция. С подкрепата на високопроизводителните технологии се събира огромен обем от протеомни данни. Биоинформатичните бази данни са създадени за обработка на огромно количество данни и тяхното съхранение. Разработени са различни биоинформатични инструменти, за предсказване на 3D структура, анализ на протеинов домейн и мотив, бърз анализ на протеин -протеин взаимодействия и анализ на данни от масспектрометрия. Инструментите за сравняване на протеинови секвенции са приложими при сравняване на последователности и структури на протеини, с цел да се открие еволюционната връзка между тях. Протеомният анализ осигурява пълна информация за структурата и функцията на клетката, както и за механизмите, участващи в клетъчния отговор към различни видове стрес и лекарства, използвайки една или множество протеомни техники. Основните техники, използвани в протеомните изследванията са представени на Фиг. 5.

Фиг. 5. Методи, прилагани в протеомиката за широкомащабно изследване на протеини

Метаболомика

Метаболомът е описан за първи път от Оливър и сътрудници през 1998 г., по време на първоначалните им изследвания върху метаболизма на дрожди, като пълен набор от малки молекули в биологична система или течност. Той включва всички малки молекули като липиди, аминокиселини, мастни киселини, въглехидрати и витамини, които са известни като метаболити и се синтезират в резултат на клетъчния метаболизъм. Те участват в метаболитните процеси в клетките, като взаимодействат с други биологични молекули, в хода на метаболитните пътища. Състоянието на метаболитите в биологичните системи е силно вариабилно и зависещо от времето, като се наблюдават промени в нивата на ключови метаболити в резултат на генетични, екологични, хранителни и други фактори.

Метаболомиката (Метаболомен анализ) е най-скоро въведената стратегия сред останалите омикс дисциплини, която систематично идентифицира и количествено определя метаболитите, присъстващи в дадена клетка, тъкан, орган, биофлуиди или организъм, в определен момент от време. Методите, използвани в метаболомиката, имат за цел да измерват съединения с ниско молекулно тегло (метаболити), с различни физични характеристики като полярност на съединението, функционални групи и структурно сходство. Въз основа на тези свойства метаболомът се разделя на подгрупи от различни метаболити и за тяхното изследване се прилагат аналитични процедури, оптимизирани за всеки тип молекула в метаболомиката.

Метаболитите са продукти на биохимични реакции, които се провеждат с участието на протеини от протеома (Фиг. 6). Това от своя страна определя биологичната структура и функция на крайния фенотип на организма. Тяхната концентрация зависи от взаимовръзките на други процеси (транскрипция, транслация, клетъчно сигнализиране и т.н.), поради което те са изследвани като репортери за метаболизма при болестта на Паркинсон (PD). Следователно промените в генната експресия, функцията на протеините и околната среда влияят пряко върху концентрацията на метаболитите в биологичната система. Метаболомът е съставен от сравнително малък брой (около 5000), но различни видове метаболити, което го прави по-сложен от генома, транскриптома и протеома във физично и химично отношение. Освен това геномът, транскриптомът и протеомът се състоят от съединения, които са част от метаболома. В допълнение, компонентите на метаболома са силно консервативни между организмите в сравнение с генома, транскриптома и протеома, поради което се счита, че метаболомът е еволюционно най -старата част в клетката.

Фиг.6. Данни от интегрирани подходи в системната биология

Метаболомиката е най-подходящата стратегия за определяне на биомаркерите, свързани с дадено заболяване. Цялостното изследване на метаболитите е желателно средство за диагностициране на болестта, идентифициране на нови терапевтични мишени и позволява избор на подходящо лечение. В продължение на десетилетия, анализите на малък брой метаболити се използват в диагностиката на заболявания, например разработването на тест ленти за кръвна захар през 50-те години на 20 век, за тестване за диабет или количествено определяне на фенилаланин при неонатален скрининг за фенилкетонурия.

Метаболомните анализи могат да бъдат групирани в два основни подхода: целева и нецелева метаболомика. При целевия подход метаболитите, които се определят, са известни и представляват молекули от специфичен метаболитен път (пътища) или клас (класове). За разлика он него, нецелевият метаболомен подход има за цел количествено да определи и идентифицира възможно най-много метаболити. Целевата метаболомика се отнася до абсолютно количествено определяне (nmol или mg/ml) и използва вътрешен стандарт и полуколичествен или количествен анализ за откриване на известни съединения, свързани със специфични пътища. Нецелевият подход измерва всички присъстващи метаболити в дадена проба и прилага относително количествено определяне и сравнение между пробите. Ключовата роля, която метаболомиката играе в интегрирането на омикс дисциплините (мулти-омикс подход) и системното моделиране, се дължи на факта, че тя може да бъде количествена. Системното моделиране не може да се извършва без точни стойности или точни концентрации като входящи данни и също така моделите на системите не могат да бъдат лесно проверени без точни, количествени концентрации като изходящи данни. Метаболомиката може да достави и двете (количествени входящи и изходящи данни), което я прави изключително ценна за системните моделисти.

Поради огромната химична комплексност на метаболома, той не може да бъде изследван цялостно с една технология. Най-ранното приложение на метаболомиката датира от 70-те години на 20-ти век, когато се използва газова хроматография -масспектрометрия за профилиране на метаболити в проби от клинична урина. Никълсън и сътрудници през 80 -те години на 20-ти век направиха профил на клинични проби чрез прилагане на ядрено -магнитен резонанс спектроскопия. Масспектрометрията, съчетана както с течна хроматография, така и с капилярна електрофореза, също се прилага в метаболомиката, за да допълни наличните аналитични техники. Някои от аналитичните инструменти, използвани за целите на метаболомните изследвания, се прилагат често и рутинно, докато други имат специфични роли и се прилагат по-рядко.

• Газ-хроматография – мас спектрометрия (GC-MS – Gas Chromatography-Mass Spectrometry) – Сред често използваните методи в метаболомиката е GC-MS. Както показва наименованието, GC-MS обединява две техники, като се формира един метод за анализ на смес от химични вещества. Газовата хроматография разделя компонентите в сместа, докато масспектроскопията характеризира всеки от компонентите поотделно. Чрез комбиниране на двете техники, всеки метаболит в дадена проба може да бъде оценен както качествено, така и количествено. Тази хроматографска техника се използва за изследване на метаболити, които имат ниска точка на кипене и ще присъстват в газовата фаза в температурния диапазон 50-350°C. Тези метаболити могат да имат ниска точка на кипене в нативната си биологична форма или тяхната точка на кипене може да бъде понижена чрез химична промяна, известна още като химична дериватизация. Пробата, съдържаща смес от метаболити, се въвежда (инжектира) в подвижна фаза, която в газовата хроматография представлява инертен газ, например хелий. Подвижната фаза пренася пробата през неподвижна фаза. Метаболитите се разделят въз основа на адсорбцията им върху неподвижната фаза. Тази фаза обикновено се съдържа в колона от стъкло или неръждаема стомана и представлява химичен носител, който може селективно да адсорбира компоненти от дадена проба. Чрез промяна на характеристиките на подвижната и неподвижната фаза, могат да се разделят смеси от различни химични съединения. Тъй като отделните метаболити се елуират от GC колоната, те влизат в детектора за електронна йонизация. Там те се бомбардират с поток от високоенергийни електрони (70 eV), което води до разпадането им до фрагменти. Тези фрагменти могат да бъдат големи или малки парчета от оригиналните молекули. Масспектърът, получен за дадено химично съединение, е почти един и същ всеки път. Следователно мас спектърът е пръстов отпечатък на дадена молекула. Този пръстов отпечатък може да се използва за идентификация на съединението.
• Течна хроматография – мас спектрометрия (LC-MS – Liquid chromatography-Mass spectrometry) – Основната разлика между GC-MS и LC-MS е, че при течната хроматография (LC) подвижната фаза е разтворител. При течната хроматография става разделяне на смес от метаболити, които обикновено са разтворени най-често във вода, ацетонитрил и / или метанол. Чрез използване на колони, съдържащи различни твърди адсорбентни носители (различна неподвижна фаза), може да се разделят компоненти в малко количество сложна смес с висока ефективност. Колоните, използвани във високо ефективната течна хроматография – (HPLC – High Performance Liquid Chromatography), съдържат октадецил (С18), октил (С8), циано, амино или фенилови групи, свързани нъй-често към силикагелен носител и обикновено дължината им е около 50 мм до 300 мм. При избор на подходяща колона се взимат предвид молекулното тегло на пробата, разтворимостта ѝ във вода или органичен разтворител, както и режима на разделяне. Комбинацията от течна хроматография и масова спектроскопия (LC-MS) е разработена за количествен анализ на избрани биомолекули и представлява високочувствителна, точна и специфична процедура за анализ. Получената проба, съдържаща разтворени компоненти, се прехвърля към йонния източник на масспектрометър, където протича процес на йонизация и се формират капчици, носещи излишък от положителен или отрицателен електрически заряд. Йонизацията може да бъде постигната чрез използване на различни видове йонизационни източници и интерфейси. След йонизацията йоните се прехвърлят в масов анализатор, където става разделянето им според съотношението им маса към заряд (m/z).
• Капилярна електрофореза – масспектрометрия (CE-MS) – тази аналитична техника се нарича още капиляр зонална електрофореза – масспектрометрия. Тя включва разделяне на йони в течна фаза чрез прилагане на високо напрежение и обикновено е свързвана с масспектрометрия с йонизация с електроспрей. Капилярната електрофореза разделя метаболитите въз основа на тяхната електрофоретична подвижност в разтвор на течен електролит, под влияние на електрическо поле. Електрофоретичната мобилност зависи от заряда и размера на метаболита, така че е възможно отделяне на метаболити с различни размери и/или заряди. Всички метаболити трябва да бъдат заредени, за да се осигури подвижност.
  В GC-MS, LC-MS и CE-MS става разделяне на метаболитите преди тяхното идентифициране с масспектрометрия. Тази особеност осигурява възможност да се откриват метаболити в ниски концентрации, обикновено наномол/литър (nmol/L) или микромол /литър (µmol/L).
• Спектроскопия на Ядрено-магнитния резонанс (ЯМР спектроскопия) е най -широко използвания аналитичен инструмент в изследванията на метаболомиката, заедно с масспектрометрията. ЯМР спектроскопията използва магнитните свойства на атомните ядра в даден метаболит. Само някои атоми са ЯМР активни и включват 1Н, 13С и 31Р, 15N и 17O. Техниката се основава на поставяне на течна проба в тънка тръба (например епруветка с диаметър 5 или 10 мм) или понякога се изследва директно парче тъкан, с помощта на специален държач за проба. Пробата се третира с диапазон от радиочестоти, обхващащи всички възможни енергии, необходими за възбуждане на избрания тип ядра. Различните ядра поглъщат енергия при различни радиочестоти, в зависимост от химичното им обкръжение, като се измерва освободената енергия с формиране на свободен индукционен разпад (FID). Данните от FID се преобразуват от времева област в честотна област – използвайки преобразуване на Фурие – и ЯМР спектър се конструира като химично отместване (ефективно абсорбираната енергия), спрямо най-високата стойност на интензитета.
• Вибрационни спектроскопски техники като Фурие-преобразуваща-инфрачервена (FT-IR) спектроскопия и Раманова спектроскопия, се използват за анализ на метаболитните промени в биологичните проби. Принципът на техниките се основава на пропускането на на ултравиолетова или инфрачервена светлина през дадена проба, или понякога отразяване на светлината от пробата преди нейната детекция. Подходите измерват предимно вибрациите и ротациите на връзките, свързани с различни химични функционални групи, в резултат на взаимодействието на пробата с ултравиолетовата или инфрачервената светлина. Тези техники обикновено нямат специфичност за откриване на всеки метаболит поотделно, но вместо това специфични части от молекулата абсорбират ултравиолетовата или инфрачервената светлина при определени дължини на вълните. Например, при FT-IR се наблюдават вибрации на разтягане на С-Н връзки, характерни за веригите на мастните киселини, между диапазона на вълновите числа 3100-2800 cm-1. Областта между 1800 и 1500 cm-1 е доминирана от амид I и амид II ивици, което показва преобладаване на алфа спирала или бета лист структури.

В областта на метаболомиката рутинно се анализират стотици проби и обикновено се откриват минимум няколко стотици метаболити. Данните, получени от откриването на метаболити в дадени биологични проби, са последвани от по-нататъшен анализ, използвайки статистически многовариационни хемометрични подходи (хемометрия) за извличане на биологична, физиологична и клинично значима информация.

Въвеждането на омикс технологии и интегрирането на омикс данни е реализирано за широк кръг изследователски области, включително наука за храните и храненето, системна микробиология, анализ на микробиоми, взаимодействия генотип-фенотип, системна биология, откриване на природни продукти и биология на заболяванията. Напоследък омикс-базираните подходи бяха значително подобрени с добавянето на нови концепции като: експозомикс (exposome / exposomics) (ролята на околната среда за човешките заболявания), адуктомикс (adductomics) (изследване на съединения, които свързват ДНК и причиняват увреждане и мутации), волатиломикс (volatilomics) (изследване на летливи органични съединения към метаболомния / липидомния анализ), нутригеномика (изследване на това как храните влияят върху човешките гени) и др. Омикс технологиите обаче, са насочени предимно към четири омикс изследователски области – геномика, транскриптомика, протеомика и метаболомика. Традиционните области на изследване като генетика, фармакогенетика и токсикогенетика, които не прилагат омикс концепцията, осигуряват статични последователности на гени и протеини. За разлика от тях, омикс технологиите осигуряват едновременно измерване на броя на протеините, гените, метаболитите и позволяват да се получат мащабни данни за кратко време. Комбинираният анализ на биологичните процеси в дадена биологична система, предоставен от всички омикс подходи, е предимство пред традиционни методи, тъй като осигурява данни, позволяващи по-добро разбиране на цялостната картина на всяка биологична система. Въпреки че мащабните омикс данни стават все по-достъпни, интегрирането им все още е предизвикателство. Това се дължи на факта, че много от специфичните аналитични инструменти и експериментални подходи, които обикновено се прилагат за целите на индивидуални омикс дисциплини (геномика, транскриптомика и протеомика), не са достатъчно подходящи, така че да позволят надеждни сравнения и интегриране при мулти –омикс подхода. Например, методите за събиране и съхранение на проби, както и количеството и вида на биологичните проби, необходими за изследванията в областта на геномиката, често не са съвместими с метаболомиката, протеомиката или транскриптомиката. По време на събирането на данни, има много проблеми като хетерогенност на данните, малък обем на пробата в сравнение с много параметри, потвърждаване и тълкуване на данните, поради много взаимодействия в биологичната система и недостатъчна информация за тези системи.

Почти във всички омикс експерименти се измерват стотици до хиляди целеви молекули и променливи (метаболити, протеини, гени, транскрипти, единичен нуклеотиден полиморфизъм (SNPs) ). Това изисква изследване на достатъчен брой биологични проби, за да се получат статистически надеждни резултати. Освен това, данните от мулти-омикс подхода трябва да бъдат генерирани от един и същ набор от проби, за да позволят директно сравнение при същите условия. Това обаче не винаги е възможно поради ограничения в размера на пробата, достъп до нея или финансови ресурси. В експериментите на индивидуалните омикс дисциплини често се изисква по-голям размер на пробата, за да се преодолее този проблем. В допълнение, интегрираните мулти-омикс данни трябва да бъдат анализирани като единични набори от данни, преди да бъдат депозирани в специфични омикс бази данни, с цел да станат публично достъпни. Тези въпроси подчертават, че за висококачествените мащабни омикс изследвания е необходимо: 1) правилно да се планира експеримент; 2) внимателно да се събират, подготвят и съхраняват биологични проби; 3) внимателно да се събират количествени мулти-омикс данни и свързани метаданни; 4) да се използват подходящи инструменти за интегриране и тълкуване на данните.

Някои от предимствата и недостатъците на основните омикс технологии са обобщени в Таблица 1.

Таблица 1. Предимства и недостатъци на основните омикс изследователски технологии

Данните от мулти-омикс подхода осигуряват по-задълбочено разбиране в определени случаи, но това е свързано с разходи. Тези проучвания често се основават на голям брой сравнения, коректен тип данни, статистически значими анализи, специфично оборудване и квалифициран персонал, и значителни инвестиции на пари и време. При конструирането на експеримент трябва да се вземе предвид, какви видове омикс данни могат и трябва да бъдат интегрирани, така че да се получи ефективна представа за изследваната система. Приложението на високопроизводителни омикс платформи не винаги е необходимо за отговор на изследователски въпрос. Резултатите, получени от традиционните техники, като количествена полимеразна верижна реакция (qPCR), ензимно свързан имуносорбентен анализ (ELISA), имунохистохимия (IHC), понякога може да са достатъчни, с цел да осигурят разбиране на биологичните механизми. Тези техники често допълват откритията на по-големите омикс проучвания, като те се прилагат да потвърдят, че идентифицирата от омикс данните важна молекула, е действителен положителен резултат