Напредъкът в „ОМИКС“ технологиите позволиха и създаването на медицински практики на молекулярно ниво. Бързо намаляващите разходи за високопроизводително секвениране и други паралелни технологии, като мас спектрометрия, доведоха до масовото им използване в различни клинични изследвания и клиничната практика.

„ОМИКС“ технологиите за подобряване качеството на живот

Напредъкът в „ОМИКС“ технологиите позволиха и създаването на медицински практики на молекулярно ниво. Бързо намаляващите разходи за високопроизводително секвениране и други паралелни технологии, като мас спектрометрия, доведоха до масовото им използване в различни клинични изследвания и клиничната практика. Секвенирането на екзома и генома вече се прилага в диагностиката, особено на редки заболявания, както и при избора на лечение на ракови заболявания и при създаването на прогнозни модели при здрави индивиди. Усилията на многобройните изследователи и компании са фокусирани върху използването на различни геномни, експресионни и други „ОМИКС“ данни, включително човешкия микробиом, като биомаркери за заболяване. Тези техники също се прилагат и при идентифициране на рискови локуси за заболяване, дефиниране на точна патофизиология на заболяването, както и извършване на изследвания в областта на безопасността и здравето на работното място.

В идеалния случай различни технологии биха били комбинирани както за подпомагане на диагностицирането на заболяването, така и за създаване на холистична картина на човешките фенотипове и болести. Въпреки това, прилагането на мулти-“ОМИКС“ данни въвежда нови предизвикателства в областта на информатиката и интерпретацията. Какви са начините, по които интегративните „ОМИКС“ технологии могат да повлияят на медицината, така че да подпомагат здравните практики, както и процесите за диагностициране и лечение на болести? Всъщност, за подобряване на резултатите от лечението и намаляване на нежеланите събития, които имат значение както за медицинското лице, така и за пациента, едно от перспективните решения е да се разработи персонализирана медицина – персонализирано медицинско лечение, създадено така, че да отговаря на индивидуалните характеристики, нужди и уникален молекулен и генетичен профил на пациента (Фиг. 1).

Фиг. 1. Персонализирана медицина през целия живот

„ОМИКС“ технологиите в диагностиката

Пренатална диагностика

Близо 10% от детските заболявания и 20% от смъртните случаи на бебета се дължат на болести с Менделово унаследяване. Генетичните дефекти могат да бъдат сериозна заплаха за здравето на бебето. За да се преодолее този проблем, последните разработки в областта на „ОМИКС“ технологиите се прилагат в живота на човек още преди раждането. Пренаталният скрининг стана широко разпространен в много страни за изследване не само на аномалии на плода, но и на възможните рискове от заболявания или анормални състояния след раждането. Когато съществува генетична предразположеност, като кистозна фиброза или мускулна дистрофия, консултацията с медицински специалист или компания за генетична диагностика става от голямо значение. Последните иновации в молекулярната и клетъчната биология позволиха прилагането на различни генетични изследвания за фетуса. Доскоро се използваха различни инвазивни технологии като амниоцентеза и проби от хорионни въси. Въпреки че процедурите са подобрени, все още съществува риск от спонтанен аборт и сериозни странични ефекти. Един от иновативните опити за избягване на страничните ефекти на конвенционалните инвазивни технологии е да се изолират и анализират фетални ядрени клетки от кръвта на майката.

За съжаление, броят на феталните клетки, които могат да бъдат изолирани, е около 3-5 клетки на 30 мл кръв на майката. Огромният скок в областта на неинвазивното пренатално тестване е направен след напредъка на „ОМИКС“ технологиите и тяхното комбиниране с различни експериментални подходи. Използването на техниката за амплификация на ДНК, комбинирана със секвениране от следващо поколение (NGS), позволява директното откриване на феталната ДНК в кръвта на майката. Понастоящем такъв подход се използва за определяне на пола и Rh кръвна група и за анализ на хромозомни анеуплоидии. Безклетъчната фетална ДНК обикновено се освобождава в кръвта на майката по време на процеса на апоптоза на плацентарните клетки. Фрагментираната безклетъчна фетална ДНК е дълга ∼200 bp и има полуживот от ∼16 минути и може да бъде открита в майчината плазма от ранна бременност (5-7 седмици). В допълнение към феталната ДНК, феталните РНКи могат да се използват и за неинвазивно пренатално изследване. Например, фетална тризомия 21 може да бъде диагностицирана чрез проверка на алелното съотношение на PLAC4 иРНК, произведена от хромозома 21 в плацентата. Ако бебето получи хетерогенни алели от родителите, неравномерно алелно съотношение (2 : 1) предполага тризомия.

Интегрирането на геномни, транскриптомни, протеомни, метаболомни и епигенетични данни на плода ще помогне за напредъка на пренаталната генетична диагностика. По този начин всяко генетично заболяване може да бъде идентифицирано в началото на бременността чрез прилагане на неинвазивни подходи. Въпреки това възникват някои опасения по отношение на сериозни етични проблеми, когато се използват усъвършенствани геномни технологии. Ето защо следва да се обмислят по-нататъшни проучвания за въздействието на новите технологии върху обществото, като възможна дискриминация въз основа на генетична информация, неопределени вредни ефекти на нанотехнологиите върху хората и природата и нарушения на авторските права, дължащи се на развитието на информационните технологии (вж. ОР8).

Технологията „Лаборатория върху чип“ в диагностиката

Скоро след разработването на микро-електромеханичните системи (MEMС), бяха установени и различни възможности за потенциалното приложение на тези миниатюрни платформи. През последните няколко десетилетия интересът към биологичните или биомедицинските MEMС (БиоMEMС) е нараснал значително и той е намерил широко приложение в различни области на науката за живота, включително диагностика, терапия, разработка на лекарства, биосензори и тъканно инженерство. Тези интегрирани системи са известни още като „лаборатория върху чип“ (ЛОЧ) или „микросистеми за цялостен анализ“ (μTAS) и осигуряват солиден подход за миниатюризация, интеграция, автоматизация и паралелизиране на химически процеси.

Устройствата „лаборатория върху чип“ интегрират множество лабораторни функции на един чип (от няколко квадратни милиметра до няколко квадратни сантиметра с размер). Тези платформи предоставят сложни химични и/или биологични анализи, които са по-евтини, по-бързи, лесно контролирани, с по-добри показатели и в много малък мащаб в сравнение с конвенционалните лабораторни тестове. Те са в състояние да обработват изключително малки обеми течности до по-малко от няколко пиколитра (няколко микрокапчици кръв, плазма, слюнка, сълза, урина или пот). Този факт е много важен в много клинични проучвания, където обикновено са налични много малки обеми от проби от пациенти. Освен това автоматизацията с елиминиране на параметрите на човешката намеса може да повиши надеждността на анализа.

ЛОЧ е използван в различни приложения, като: извличане и пречистване на ДНК, PCR, qPCR, молекулярна детекция, електрофоретичен анализ и др.

ЛОЧ за извличане и пречистване на ДНК: Често за диагностични анализи нуклеиновата киселина трябва да бъде пречистена от клетките. Процесът на извличане на ДНК обикновено включва две стъпки: клетъчен лизис чрез разрушаване на клетъчната и ядрена мембрана и пречистване на ДНК от мембранни липиди, протеини и РНК. Клетъчен лизис на ЛОЧ устройства може да се постигне чрез няколко вида методи за лизис: химичен, термичен, ултразвуков, електрически, механичен или някакъв друг вид. Тези добре известни методи за пречистване на ДНК чрез колони за екстракция, използващи адсорбцията на ДНК върху силициев диоксид при определени буферни условия, също са адаптивни към микрофлуидни техники.

ЛОЧ устройства за PCR, qPCR и молекулярна детекция: След извличане на ДНК, най-честият анализ е PCR. Значението на PCR в геномния анализ доведе до разработването на множество ЛОЧ устройства. Миниатюризирането на обема и високото съотношение повърхност към обем определя бърз термичен трансфер и по-точен PCR. Обикновено, след провеждането на PCR анализа се извършва допълнителна обработка на получените данни и откриване на размера на ампликоните, което найючесто се извършва чрез електрофореза. Всъщност, ДНК електрофорезата беше един от първите молекулярни процеси, които бяха интегрирани в чип. С тази миниатюризация се намалява още повече общото време на процеса и консумацията на реагенти.

Фиг. 2. „Лаборатория върху чип“ устройство

qPCR е друга техника, която е модифицирана за ЛОЧ устройства. Използвайки ултра-бърз контролер на налягане и флуоресцентен четец, беше разработена ултра-бърза qPCR микрофлуидна система за молекулярно откриване на заболявания като антракс и ебола. Ефективността на откриване е идентична с комерсиалните системи и резултатите са постижими за по-малко от 8 минути, което е 7-15 пъти по-бързо от традиционно използваните. Друга обещаваща област е цифровата микрофлуидика, която се занимава с емулсии и капчици в ЛОЧ устройства. Изключително малко количество ДНК може да бъде уловено в капчици, а границите на откриване могат да бъдат подобрени до установяване на едно копие ДНК с qPCR в рамките на капчица течност.

Геномно приложение: Поради многобройните проекти за секвениране, като например проекта за човешкия геном, областта на геномиката привлече огромно внимание през последните години. Техниките за секвениране на ДНК от следващо поколение, които в момента са в процес на разработка, включват секвениране чрез хибридизация (SBH), секвениране на нанопори и секвениране чрез синтез (SBS), последният от които включва много различни стратегии, зависими от ДНК полимеразата. Използването на ЛОЧ подход позволява драстично намаляване на разходите и продължителността на високопроизводителното секвениране.

При изследване на експресията на комплексни ДНК проби е необходима интеграцията на множество биосензори във ДНК микрочиповете. Най-съществените характеристики на тези ЛОЧ са миниатюризация, скорост и прецизност. Тази технология предлага огромни възможности за бърз мултиплексен анализ на проби от нуклеинови киселини, включително диагностициране на генетични заболявания, откриване на инфекциозни агенти, измерване на диференциална генна експресия, скрининг на лекарства или криминалистичен анализ.

Биохимични приложения: ЛОЧ стратегията е приложима и при провеждане на ензимни и имунологични анализи на едно-канално микрофлуидно устройство. Типичен пример е едновременното измерване на глюкоза и инсулин. Ключът за ефективното осъществяване на такъв мониторинг на глюкоза/инсулин е интегрирането на съответните процедури за предварителна обработка/почистване на пробата, които са от съществено значение за анализа на цялата кръв. Този иновативен подход на ЛОЧ може да бъде приложим за включване на други анализи и допълнителни стъпки за обработка на проби, както е препоръчително при създаването на миниатюрни клинични инструменти.

Протеомика: Протеомиката е едно от големите научни предизвикателства в съвременната епоха, след геномиката. ЛОЧ устройствата са полезни за създаване на усъвършенствани техники за отговор на сложни аналитични проблеми, като профилиране на протеома. Те могат да бъдат приложени в четири ключови области на протеомиката: химическа обработка, предварителна концентрация и пречистване на пробата, химическо разделяне и интерфейси с мас-спектрометрия. ЛОЧ като миниатюрно устройство може да се използва за разделяне и откриване на протеини. Този процес се характеризира с по-малка консумация на реагент, лесна работа и много бърз анализ. Друго предимство е, че данните от ЛОЧ устройствата могат лесно да бъдат сравнени с тези, получени с помощта на 2D-PAGE. За да се определят количествено протеините, е разработено ЛОЧ – мас-спетрометрично устройство. Някои автори описват ЛОЧ устройства, които се използват за директна инфузия в мас-спектрометъра, включително разделяне с капилярна електрофореза (СЕ), разграждане на пробата върху чип и последващ мас-спектрометричен анализ. Изследователите използват електроспрей йонизираща мас-спектрометрия и се фокусират върху дизайна на интерфейса между ЛОЧ и мас-спектрометъра.

Биосензори: За откриване на целеви аналити са разработени и ЛОЧ биосензори. Такива устройства свързват елемент за биологично разпознаване с физически преобразувател, трансформиращ събитието на биоразпознаване в електрически сигнал. Има два вида ЛОЧ биосензори: биоафинитетни и биокаталитични устройства. Биоафинитетните устройства се основават на селективно свързване на целевия аналит към повърхностно разположен лиганд (например антитяло, олигонуклеотид). Например, в хибридизационните биосензори има имобилизирани едноверижни ДНК сонди върху повърхността на трансдюсера. Когато се образува дуплекс, той може да бъде открит след свързването на подходящ индикатор за хибридизация. От друга страна, в биокаталитичните устройства се използва имобилизиран ензим за разпознаване на целевия субстрат. Например сензорни ленти с имобилизирана глюкозооксидаза за детекция и мониторинг на диабетни състояния (за повече информация вижте ОР3).

Клетъчни изследвания: Използвайки ЛОЧ устройства, може да се извършат и различни клетъчни експерименти. Единичната клетка е позиционирана в микроканала на предварително определено място, което улеснява нейната работа и манипулация. Микросистемата позволява работа с малки обеми течност, съдържаща малки количества аналит. ЛОЧ системите също така осигуряват прецизен контрол на локалната среда около клетката, като наблюдават физичната или химичната природа на повърхността, към която клетката се придържа, локалното рН и температура. Когато клетката трябва да бъде изложена на различен тип стимули, могат да се използват многобройни и често сложни компоненти за работа с течности. Ако клетката е обект на допълнителен анализ, лизисът и необходимите аналитични методи също могат да бъдат въведени на същата платформа. По този начин се избягва загубата или разреждането на пробата, което неизбежно би настъпило, ако се използват множество устройства.

Разработване на лекарства: Индустрията има нужда както от разработването на нови лекарства, така и от прогнозирането на тяхното потенциално поведение в живите системи. Имено във връзка с това са намерени и редица аналитични приложения на ЛОЧ системите: например аналитични системи за наблюдение и оптимизиране на производството на протеинови лекарства като терапевтични антитела; анализи, базирани на първични човешки клетки, които биха могли да предскажат ефективността при клинични изпитвания при хора. Тези ЛОЧ системи са доказано високо възпроизводими, лесни за манипулиране и могат да се използват рутинно.

„ОМИКС“ анализи за разкриване на генетична архитектура на често срещании заболявания

Идентифицирането на генетични маркери, които са свързани със специфична характеристика на дадено заболяване, е ключов въпрос при оценката на риска от заболяване. Тъй като генетичната информация на индивида остава предимно непроменена, мутиралите последователности могат да бъдат надеждни маркери за определени заболявания. В това отношение едно от важните приложения на „ОМИКС“ технологииите са пълногеномни изследвания на асоциации (GWAS). Те могат да идентифицират общи генетични варианти, обикновено единични нуклеотидни полиморфизми (SNP), свързани с определени характеристики на заболяването. Като цяло информацията за SNP се събира от две групи, група пациенти и здрава контролна група. След това се анализира статистически и се идентифицират единичните нуклеотидни полиморфизми, свързани със специфичните характеристики на заболяването на съответната група пациенти.

Например, вариациите в гена на аполипопротеин Е (APOE) са добре познат генетичен фактор, който е свързан с късното начало на болестта на Алцхаймер. След оценката на 502,627 единичните нуклеотидни полиморфизмa при 1086 пациенти с Алцхаймер, беше показано, че rs4420638 на хромозома 19 е най-силният маркер, диференциращ пациентите с Алцхаймер от контролната група. Друг важен успех се постига при изследване на наследствени ракови заболявания. BRCA1 и BRCA2 гените са едни от най-важните генетични маркери за наследствен рак на гърдата и яйчниците. Тези гени кодират туморни супресорни протеини, които помагат за възстановяване на увредената ДНК чрез хомоложна рекомбинация. Някои мутации в BRCA1 и/или BRCA2 значително повишават риска от развитие на рак на гърдата и/или яйчниците. За BRCA1 са открити две мутации: 185delAG и 5382insC. Приблизително 55–65% от жените, които наследяват една от вредните мутации на BRCA1, и около 45% от жените, които носят BRCA2 мутация, са развили рак на гърдата до 70-годишна възраст. С помощта на секвениране от следващо поколение са идентифицирани успешно и редица други маркери за заболявания като автозомно-доминантен колоректален рак, синдром на Ли—Фраумени, муколипидоза IV и хипертрофичната кардиомиопатия.

Въпреки това, за най-често срещаните заболявания като диабет, затлъстяване, шизофрения и аутизъм е отговорна комбинация от множество генетични фактори, както и фактори на околната среда. Все по-голям брой доказателства сочат, че генетичните маркери обикновено обясняват само част от общата вариация на заболяването. Един от липсващите решаващи фактори са епигенетичните вариации. В литературата вече има съпбщения, че различни епигенетични модификации са свързани с ранния стадий на различни видове рак. Освен това е добре известно, че колоректален рак се идентифицира по-често при мъжете, отколкото при жените. Ето защо се предполага, че естрогенът може да помогне за потискане на този тип раково заболяване. В допълнение, епигенетичните профили на съседна лигавица и проби от несъседна лигавица на 95 пациенти с колоректален рак разкриват, че промоторът на гена MGMT, кодиращ протеин отговорен за репариране на ДНК, често е метилиран. Понастоящем са идентифицирани хиляди геномни локуси, които са свързани с различни човешки заболявания. Трудностите обаче възникват, когато тези гени трябва да бъдат характеризирани в контекста на молекулярната патофизиология и съответните взаимодействащи гени и пътища.

Прилагане на „ОМИКС“ подход в лечението на заболявания

Основната цел на персонализираната медицина е да вземе решение за най-ефективния вариант за лечение на индивида. В тази връзка, едновременното количествено определяне на множество протеинови маркери може да играе важна роля при подтипирането на тумори и избора на оптимизирани терапии за всеки подтип. Високопроизводителните техники, базирани на количествено определяне на протеини в единични клетки, като CyTOF, могат да бъдат отлични алтернативи на имунохистохимичните подходи.

Например, през последното десетилетие се появи нов подход за лечение на рак – позволяващ на имунната система на пациента да се бори с неговия или нейния рак, наречен трансфер на осиновителни клетки. Мултиформеният глиобластом (GBM) е най-честият и агресивен вид злокачествен мозъчен тумор. Въпреки че GBM се лекува с хирургично отстраняване, лъчетерапия и химиотерапевтични методи, не се наблюдават забележими ефекти. През последните 20 години бяха проведени множество клинични проучвания за използване на имунната система за лечение на рак като GBM. Сред многобройните подходи за трансфер на осиновителни клетки, особено внимание се обръща на ваксините, базирани на дендритни и Т-клетки. Те могат да проникнат и да предизвикат противотуморен отговор в мозъка и показват голям потенциал за ефективно убиване на различни видове рак, включително злокачествени и напреднали видове. Автоложните дендритни клетки, получени от туморна тъкан или под формата на туморен лизат на пациент, могат да се култивират in vitro в присъствието на тумор-асоциирани антигени (TAAs), метод, наречен „пулсиране“. Импулсните автоложни дендритни клетки се въвеждат отново в пациента, за да стимулират специфична, клетъчно медиирана, антитуморна цитотоксичност срещу мултиформения глиобластом и други злокачествени ракови заболявания. По-революционни подходи, също са били прилагани като напр. опити за конструиране на специфични имунни клетки с помощта на нуклеази с цинкови пръсти (ZFNs) и CRISPR технология.

Всяка година хиляди пациенти се подлагат на трансплантация на органи или хемопоетични стволови клетки. Въпреки това, смъртността сред такива пациенти остава много висока. Стандартната процедура за съпоставяне на донори с реципиенти включва типизиране на човешки левкоцитен антиген (HLA). Въпреки това вече е ясно, че не-HLA фактори също могат значително да повлияят върху приемането / отхвърлянето на транспланта. За да се преодолее това, могат да се използват много от „ОМИКС“ приложенията за определяне на оптимални съвпадения донор-реципиент, както и за изследване на различни маркери на отхвърляне. Например, може да се използва секвенирането на ДНК за оценка на тежестта на отхвърлянето на орган, както и за едновременно откриване на евентуалното присъствие на вирусна ДНК като маркер за инфекция. За оценка на съвместимостта донор-реципиент могат да се използват и допълнителни „ОМИКС“ данни, като експресия на РНК или протеин. По този начин интеграцията между няколко „ОМИКС“ технологии може да се използва като полезен инструмент в трансплантационната биология.

Освен това микробиомът много често също е причина за редица човешки заболявания. Докато причинно-следствената връзка е проста в геномните данни, където ДНК влияе на фенотипа, много по-трудно е да се разгадае дали съставът на микробиома е причина или следствие от заболяване. Въпреки това е очевидно, че пациентите с възпалително заболяване на червата, диабет тип 2 и затлъстяване имат различни микробиомни профили от тези на здрави контроли. В допълнение, микробиомът има голямо влияние върху имунната функция, която в някои случаи е предполагаемо причинно свързана с болестта при животински модели. Тъй като нашето разбиране за микробиома напредва, интегративната оценка на тези и други данни за „ОМИКС“ технологиите ще помогне за по-доброто ни разбиране на човешките заболявания. Наскоро беше доказано, че човешките генетични профили влияят на цялостния състав на чревната микробиота. Освен това е доказано, че взаимодействията между човешката генетика и микробиомите влияят върху проявата на различни заболявания. По същия начин, метаболитното сигнализиране между гостоприемниците и техните микробиоми се превърна в област на активно изследване и има все повече доказателства, че редица метаболити, секретирани от чревни бактерии, могат да играят роля в заболяванията при хората. Следователно е очевидно, че интегрираният анализ на генома, метаболома, микробиома и други „ОМИКС“ профили ще осигури средства за подобряване на здравето и борба с болестите.

„ОМИКС“ технологиите за борба със заболяванията – бъдещи преспективи

Друга важна цел на персонализираната медицина е да предотврати развитието на различни заболявания преди появата им. Настоящите превантивни лечения са ограничени до хирургия – отстраняване на тъкан или орган, ако човек притежава съответните ракови маркери. Този подход обаче не е приложим за заболявания като Алцхаймер, болест на Хънтингтън и вродена мускулна дистрофия. Един от последните подходи за справяне с подобни проблеми е диетичното лечение, базирано на нутригеномика. „ОМИКС“ профилирането може да бъде ефективен подход при откриване на мащабни метаболитни промени, може да покаже специфични за пациента тенденции и да осигури статистически значими данни чрез многократни измервания.

Използването на „ОМИКС“ инструментите за оценка на състояние на околната среда става все по-важно в процесите на управление и оценката на риска. „ОМИКС“ подходите позволяват свързване на молекулярни събития и неблагоприятни ефекти с биологични нива на организация, подходящи за схемите за оценка на риска. Анализът на нивото на РНК транскриптите или клетъчната протеомика вече придоби особен интерес. Тези проучвания помогнаха за по-доброто разбиране на взаимодействията между стресовите фактори и организма, но също така и за разкриването на начините на действие на различни токсични вещества. Следователно, от токсикологична гледна точка, „ОМИКС“ техниките позволяват ефективно и точно генериране на важна информация за индуцирани от веществото молекулярни смущения в клетките и тъканите, които са свързани с неблагоприятни крайни резултати.

Клетъчните регулаторни пътища включват набор от различни (био)молекули, които се характеризират с различни физикохимични свойства и показват сложни нелинейни взаимодействия. Прилагането на само на един „ОМИКС“ подход може да позволи измерването на биомолекули от специфичен тип, РНК или протеини, и често те дори не са съвкупността от биомолекули от един тип, а по-малка подгрупа от тях. Например, откриването на къси и дълги РНК или къси пептиди и протеини изисква различни транскриптомни или протеомни подходи. Само използването на мулти-“ОМИКС“ анализи, известни също като подходи за кръстосани „ОМИКС“ изследвания, позволява директно да се идентифицира отговора на живите системи към дадена химическа експозиция. Поради това използването имено на мулти-“ОМИКС“ стратегии има важно значение при осъществяване на токсикологични изследвания.

Прилагането на такъв системен токсикологичен подход, интегриращ класическата токсикология с количествен анализ на големи молекулярни мрежи и функционални промени, настъпващи на множество нива на биологична организация, е обещаващ при анализиране на пълния спектър от токсичност на различните ксенобиотици. Подходът при системната токсикология включва следните елементи:

• Абсорбция и разпределение на ксенобиотика в биологичната система.
• Трансформация на ксенобиотика и генериране на токсични и/или нетоксични междинни продукти.
• Взаимодействие на ксенобиотика и/или неговите продукти с клетъчните мишени.
• Модификации в клетъчните молекули, включително гени, протеини и липиди.
• Структурни прояви на токсичност за целеви органи.
• Функционални прояви на токсичност.
• Елиминиране на ксенобиотика и/или неговите междинни продукти от биологичната система.

Токсикологични изследвания с „ОМИКС“ анализи

За по-добро разбиране на клетъчния отговор при излагането на дадено химическо вещество, изследванията трябва да бъдат фокусирани върху различни нива: транскриптомика, протеомика, фосфопротеомика и метаболомика. В поределени конкретни случаи трябва да се има предвид и епигеномиката.

Транскриптомика. Основната цел на транскриптомиката е цялостното откриване на РНК в клетката. При прилагане на транскриптомен анализ, специфичният метаболитен отговор се открива на базата на изследването на известен набор от целеви гени, като се проследява тяхната специфична експресия. Прилаганите техники за определяне на промените в генната експресия в отговор на излагане на ксенобиотик включват: хибридизация (Northern blot), количествен PCR в реално време (QRT-PCR), субтрактивна хибридизация, сериен анализ на генната експресия, микрочип анализ и следващо поколение секвениране (NGS). В зависимост от целта на изследването, една или повече от тези техники могат да бъдат приложени за дефиниране на частични или глобални профили на експресия в тестваната биологична проба. Въпреки това, най-често използваните техники за профилиране на генна експресия са QRT-PCR, микрочип анализ и NGS. Ако целта е да се изследва експресионния профил на единичен или ограничен брой транскрипти, QRT-PCR анализът е методът на избор. QRT-PCR анализът е сравнително проста техника, която включва обратна транскрипция на иРНК, последвана от PCR амплификация на получените кДНК, като се използват праймери, специфични за целевия ген. Количеството на PCR амплифицираните генни продукти се определя количествено. Тъй като QRT-PCR може точно да определи експресията на единичен или ограничен брой транскрипти, той има някои ограничения от гледна точка на системната токсикология. За да се проучи токсичността на системно ниво на даден ксенобиотик, е необходимо да се използват техники с висока възпроизводимост, които са в състояние да определят нивата на експресия на целия транскриптом. Ето защо микрочип анализът и секвенирането от следващо поколение са най-популярните глобални техники за анализ на транскриптоми, прилагани в токсикологичните изследвания.

Микрочип техниката представлява основен пробив в анализите в ерата на секвениране на генома. Подобно на техниката на ДНК хибридизация (Southern blot), микрочип подходът се основава на способността на ДНК молекулите да се свързват или хибридизират по начин, специфичен за нуклеотидната им последователност. Микрочиповете може да се разглежда като хибридизация с висока производителност, при която почти всички гени, които се експресират в биологичната проба в даден момент, могат да бъдат открити едновременно. Следователно, този тип анализ позволява да се открият малки разлики в глобалните профили на генна експресия в дадена биологична проба в отговор на излагане на ксенобиотик(ци). Техниката на микрочиповете включва изолиране на висококачествена РНК, обратна транскрипция на иРНК за синтезиране на кДНК, синтез на кРНК и маркиране за генериране на „сонди“, хибридизация на „сондите“ с „мишени“, присъстващи в микрочипа, откриване на интензитета на сигнала на хибридизирания комплекс проба-мишена и анализ на получените данни, за да се определят нивата на експресия на интересуващите ни гени. Анализът, базиран на микрочипове, се използва в различни области като токсикология на околната среда и работно място, разработване на лекарства и др. Получените данни предоставят моментна снимка на всички гени, чиито нива на експресия са засегнати в отговор на излагане на ксенобиотика.

Секвенирането от следващо поколение (NGS) е най-скоро разработеният глобален транскриптомен анализ. Тази техника може да се приложи за определяне на глобален профил на генна експресия в РНК, получена от различни биологични проби. Ключовите стъпки, включени в NGS, са изолиране на РНК, отстраняване на РНК молекули като рибозомна и глобинова, подготовка на секвенционни библиотеки, PCR амплификация и секвениране на библиотеките. Получените данни се анализират и се определя количеството на отделните транскрипти.
Протеомика: Транскриптомиката често е първият избор за изследвания на ниво система, тъй като през годините са разработени множество утвърдени методи за измерване. Въпреки това, протеиновите промени могат да се считат за по-близки до съответното функционално въздействие на изследван стимул. Въпреки че експресията на иРНК и протеин са тясно свързани чрез процеса транслация, тяхната корелация е ограничена. Нивата на иРНК транскрипти обясняват само около 50% от вариацията на нивата на протеин. Това се дължи на наличието на допълнителни нива на регулиране на протеините, включително скоростта им на транслация и разграждане. Освен това, регулирането на протеиновата активност не спира на ниво експресия, а често се контролира допълнително чрез посттранслационни модификации. От гледна точка на токсикологията такива примери за важна пост-транскрипционна регулация включват: строгата регулация на протеиновите нива на р53 и индуцирания от хипоксия-фактор (HIF). За тях е характерна бърза пост-транскрипционна стабилизация, например при увреждане на ДНК и хипоксични състояния. Друг пример е регулирането на няколко клетъчни реакции в отговор на стрес (например оксидативен стрес) на ниво транслация на протеини; и регулиране на реакцията на клетъчния стрес чрез каскади на фосфорилиране на протеини. Най-често прилаганите протеомни анализи, които са от ключово значение за токсикологията, включват: 2D – електрофореза в полиакриламиден гел, течна хроматография, мас спектрометрия и анализ на посттранслационните модификации.

2D полиакриламидната гел електрофореза (2DGE) се използва за изследване на промени в протеома въз основа на промени в експресията на дадени протеини. Техниката 2DGE разчита на разделянето на протеини въз основа на тяхното pH (заряд), както и техния размер. Тя може да раздели и визуализира до 2000 протеина в рамките на един гел. Първото измерение, което е известно като изоелектрично фокусиране (IEF), разделя протеините по тяхната изоелектрична точка (pI). Второто измерение допълнително разделя протеините по тяхната молекулна маса. Най-съвременният софтуер за получаване и анализ на изображения позволява сравняването на контролни и третирани проби, като помага диференциално по техния относителен интензитет да се идентифицират протеините, подложени на специфична регулация при дадените условия. Вариант на 2DGE е диференциалната гел електрофореза (DIGE), която се основава на маркиране на протеини с флуоресцентни цианинови багрила (Cy2, Cy3 и Cy5). Въпреки че 2DGE е мощен инструмент за идентифициране на много протеини, подходът има своите ограничения. Основният недостатък е, че не всички протеини могат да бъдат разделени чрез IEF, като например мембранни, основни, малки (< 10 kDa) и големи (> 100 kDa) протеини. Второто ограничение е, че протеини в по-ниски концентрации често са маскирани от тези с висока концентрация в сместа.
Други често използвани техники са мас-спектрометрия с течна хроматография (LC MS/MS). LC подходът използва разликите във физикохимичните свойства на протеините и пептидите, т.е. размер, заряд и хидрофобност. 2D-LC може да се приложи за фракциониране на протеинови смеси на две колони с различни физикохимични свойства за максимално разделяне на протеини и пептиди в сложни смеси. Счита се, че мас спектрометрията е ключова технологична платформа за токсикопротеомиката. Основните му предимства включват ненадмината чувствителност, подобрена скорост и способност за създаване на масиви от данни с висока пропускателна способност. Поради високата прецизност на MS, в тъканите и биологичните матрици могат да бъдат открити пептиди в фемтомоларния (10-15) до атомоларния (10-18) диапазон. Това е изключително полезно при сравнителния анализ, при който се извършва едновременен анализ на контролни и третирани проби. По този начин може да се постигне цялостно разбиране за това как стимулите влияят на протеома с последващото идентифициране на потенциални биомаркери.

Тъй като системната биология изисква точно количествено определяне на определен набор от пептиди/протеини в множество проби, са разработени и целеви подходи за количествено определяне на биомаркери. Такава техника е мониторингът на избрана реакция (SRM). SRM измерва пептиди, получени от ензимното разграждане на протеома с помощта на тройно – квадруполен MS. Протеомният експеримент, базиран на SRM, започва с избор на списък от целеви протеини, получени от предходни експерименти или търсене на данни, като например метаболитна карта или налична литература. Тази стъпка е последвана от 1) избор на целевите пептиди, които оптимално и уникално представляват зададената цел, 2) избор на набор от подходящи SRM преходи за всеки целеви пептид, 3) откриване на избраните пептидни преходи в пробата, 4) оптимизиране на параметрите на SRM анализа и 5) прилагане на анализите за откриване и количествено определяне на протеините/пептидите. Основните предимства на SRM техниката са: 1) възможности за наблюдение на десетки до стотици протеини по време на една и съща серия, 2) възможности за абсолютно и относително количествено определяне, 3) висока възпроизводимост на данните и 4) получаване на абсолютна молекулярна специфичност. Съществуват обаче и някои ограничения на тази техника: 1) само ограничен брой измерими протеини могат да бъдат включени в една и съща серия и 2) дори с високата си чувствителност тази техника не може да открие всички протеини, присъстващи в организма.
Използван е и друг целеви подход, базиран на MS, известен като наблюдение на паралелни реакции (PRM). Той е съсредоточен върху използването на следващо поколение, оборудвани с четириполюсен, с висока разделителна способност и точни инструменти мас спектрометри (главно системата Orbitrap MS). Тази техника е тясно свързана със SRM, но позволява паралелно измерване на всички продукти на фрагментация на даден пептид.
Друг ключов подход е анализът на посттранслационните модификации (PTM), възникнали поради токсичното излагане. Те представляват основен механизъм за регулиране на клетъчния протеом. PTMs са химични модификации, които имат важна роля в регулирането на активността, локализацията и взаимодействията на клетъчните биомолекули. Идентифицирането и характеризирането на протеините и техните посттранслационни места са много важни за биохимичното разбиране на PTM пътищата. Това знание дава по-задълбочена представа за възможната регулация на клетъчната физиология, предизвикана от постранслационни модификации. Някои примери за PTMs включват фосфорилиране, гликозилиране, убиквитиниране, нитрозилиране, метилиране, ацетилиране, липидиране и протеолиза. През последното десетилетие протеомиката, базирана на MS, се оказа мощен инструмент за идентифициране и картографиране на PTM. Освен това, базираните на MS подходи се възползваха значително от напредъка в инструментариума на MS, което прави анализа по-чувствителен, точен и с по-висока разделителна способност за откриване на протеини в по-ниски концентрации.

Метаболомика: Метаболомиката е анализ различен от другите „ОМИКС“ анализи, тъй като се занимава с колекция от химически силно хетерогенни молекули. Метаболомът обикновено се дефинира като пълен баланс на всички малки метаболити (<1500Da), открити в конкретна клетка, орган или организъм. Благодарение на инициативи като проекта Human Metabolome, ендогенният метаболом на човешки и животински моделни организми до голяма степен е картографиран. При изследването на метаболома най-често се използва ядрено-магнитен резонанс (ЯМР), или газова или течна хроматография, последвана от MS. Подходите, базирани на ЯМР, имат способността да определят количествено изследваните метаболити и представляват златния стандарт за изясняване структурата на неизвестни метаболити. Подходите, базирани на MS, превъзхождат ЯМР по отношение на чувствителност и могат да се изпълняват по нецелеви или целеви начин.
Метаболомиката се различава от протеомиката и транскриптомиката в няколко аспекта:
(i) установява специфичния клетъчен отговор на различни нива на метаболитните пътища, и
(ii) едновременно улавя наличието на молекули от метаболитни пътища, които реагират в различни времеви диапазони.
Развитието на метаболомиката направи нейното прилагане в много изследвания, свързани с токсикологията, рутинно и много полезно. Тя има забележителен потенциал при скрининг на индуцирана от лекарства клетъчна или органна токсичност. Бързата оценка на биологичните проби, заедно с математически и статистически анализ (хемометрия) на получените данни служи като мощен инструмент за оценка на безопасността на лекарствата. Например, ако лекарство или химическо вещество може да причини чернодробна токсичност чрез индуциране на клетъчен оксидативен стрес, метаболомният анализ на биологичната проба, изложена на лекарството, може да предостави директна информация за метаболити, които са маркери за оксидативен стрес. Тя може също така да идентифицира метаболити, които се считат за известни биомаркери на чернодробно увреждане, което предполага чернодробна патология. В допълнение, метаболомиият анализ може да предостави информация и за метаболити, които са непряко свързани с токсичността.
Метаболомиката има няколко предимства пред конвенционалната оценка на клиничната патология. Например, проучване, изследващо неизвестно съединение, показва, че това съединение повишава нивата на серумния холестерол. При използване на метаболомика се наблюдава, че освен холестерола, същото съединение води до повишаване и на няколко фитостерола, което показва, че по-високият холестерол е резултат от абсорбцията на стероли в червата. Такива констатации ясно показват, че метаболомиката има много по-голям потенциал по отношение на идентифицирането на точни токсикологични крайни ефекти.

Епигеномика. Основният фокус на епигеномиката е да изучава химичните модификации на ДНК и протеините, отговарящи за триизмерната структура на геномната ДНК. В наши дни метилирането на ДНК се оценява чрез модифициран подход за секвениране на генома (Methylome-seq). Този подход обаче все още е свързан с значителни разходи. Ето защо най-често се използват целевите подходи, базирани на микрочипове. ДНК метилирането включва две различни химични модификации с различни функционални последователности – 5-метилцитозин и 5-хидрокси-метилцитозин. Модификациите на хистони се анализират с помощта на метода на хроматин-имуно-преципитация, като се прилагат антитела, специфични за дадената модификация, последвано от секвениране (ChIP-seq). Обикновено, за да получите изчерпателна картина, трябва да бъдат открити няколко модификации. Това изисква извършване на няколко ChIP-seq анализа едновременно. Тъй като ChIP-seq се нуждае от повече изходен материал от другите епигеномни подходи, такава стратегия може да бъде трудна за прилагане при токсикологични изследвания. ATAC-seq е алтернативен подход, който не изследва директно химическите модификации, а по-скоро една от основните последици от модификациите, достъпността на ДНК.

Въпреки това, знанията за участието на регулаторни пътища и специфични епигенетични модификации все още са оскъдни. Следователно епигеномиката е с ограничена стойност, когато се използва като подход за интегриране на данни, базиран на метаболитни пътища. Въпреки това, епигеномните данни се оказват много ценни за проучвания на различни поколения или при използване на „ОМИКС“ данни за краткосрочна експозиция за предсказване на дългосрочни ефекти от такава.

Приложения на „ОМИКС“ технологиите за оценка на токсикологичен риск и подготовка на регулаторни документи

През последните десетилетия „„ОМИКС““ технологии бяха широко използвани в различни изследвания и беше доказано, че те са в състояние да осигурят задълбочена представа за биохимията и физиологията на клетката и всеки вреден ефект на ксенобиотиците. Това доведе до ентусиазирано одобрение от изследователите токсиколози. Бяха изразени надежди, че „ОМИКС“ технологиите ще осигурят инструментите за идентифициране на набор от биомаркери за неблагоприятни ефекти и техните начини на действие. По този начин прогнозирането на въздействието върху човека по време на оценката на опасността от различни химични вещества ще бъде подобрено и ще се даде начало на разработването на алтернативни методи на изпитване върху животни. Въпреки това прилагането на „ОМИКС“ анализите в регулаторната област остава в най-добрия случай предпазлив.

Ето защо Европейският център по екотоксикология и токсикология на химичните вещества (ECETOC) организира серия от семинари за оценка на възможностите и предизвикателствата на „ОМИКС“ техниките при оценка на химическия риск. Последният семинар заключи, че „ОМИКС“ подходите допринасят за отговорите на съответните въпроси при оценката на риска, включително:

(i) класификацията на веществата и определение на сходство,
(ii) изясняване на начина на действие на веществата, и
(iii) идентифициране на видова специфичност на ефектите и демонстриране на значимост за човешкото здраве.

Въпреки това беше установена необходимост от повишаване на възпроизводимостта на събирането на данни от „ОМИКС“ анализите, както и от определяне на най-добрите практики. Освен това регулаторното използване на всеки метод за изпитване е тясно свързано със специфичната правна рамка, която е от значение за изследваното вещество. Имайки предвид Регламента за регистрация, оценка, разрешаване и ограничаване на химикали (REACH) (ЕП и Съвета на ЕС, 2006 г.), „базираните на „ОМИКС“ данни биха могли да бъдат използвани за регулаторни заявления“. За да се използва „ОМИКС“ в досиетата на REACH, Регламентът REACH изброява различни изисквания: специфична стандартна информация, която обхваща специфични физико-химични, токсикологични и екотоксикологични граници. Тези данни се оценяват по време на оценката на опасността и риска и се анализират, за да се определят съответно алтернативи за управление на риска. Прилагането и интегрирането на „ОМИКС“ инструменти може да бъде полезно при различни нива на идентифициране и оценка на регулаторните опасности, като допринася за:

1. Класификация и етикетиране (C&L) на вещества.
2. Значимост на доказателствата (WoE) за изясняване на механизма на действие (MoA) на изследваното вещество.
3. Обосноваване на химическото сходство.
4. Определяне на изходните точки (PoDs) за оценка на опасността.
5. Демонстрация на видово специфични ефекти и значимост за човешкото здраве.

Бързото развитие на „ОМИКС“ технологиите поставя няколко предизвикателства за улесняване на използването им за оценка на опасностите, особено от законодателна гледна точка. Набора от „големи данни“ трябва да бъде кондензиран, като се прилагат сложни подходи и специфични знания, за да се получи информация, която е уместна за оценка на опасностите. Освен това знанията в тази бързо развиваща се област не са непременно познати на много изследователи, работещи в законодателната област. Съответно, липсата на регулаторно одобрение на „ОМИКС“ технологиите е свързана не само с липса на рамки за най-добри практики и критерии за качество, но и с липса на доверие в анализа и нивото на несигурност по отношение на това какво представлява достатъчно данни. Учените и законодателите трябва първо да натрупат опит с данните, получени от тази нова технология, а след това да изградят увереност в нейната приложимост.

Като цяло повечето от екологичните проучвания включват култивиране на изолирани микроорганизми или амплифициране и секвениране на консервативни гени. Съществуват обаче някои трудности при разбирането на сложния и голям брой различни микроорганизми в околната среда. Това доведе до разработването на нови техники, позволяващи обогатяване на пробите за анализ на специфични микроорганизми, такива като изолиране и изследване на еднични клетки. С други думи, усъвършенстваните инструменти в метагеномиката и едноклетъчната геномика (SCG) проправиха пътя към нови методи за изучаване и разбиране на околната среда.

Ранните екологични проучвания на разнообразието на организмите изискваха култивиране на проби, за да се увеличи количеството ДНК, преди да бъдат конструирани съответните геномни библиотеки. По това време секвенирането на 16S и 18S рРНК беше най-добрият вариант за определяне на биоразнообразието в околната среда. Въпреки това стана ясно, че по-голямата част от микробните съобщества представляват некултивируеми видове. За щастие, полимеразната верижна реакция (PCR) на рРНК позволява достъп както до култивируеми, така и до некултивируеми видове. Тъй като PCR може да се извърши директно върху проби от околната среда без клониране, той може да се използва за амплифициране на целеви гени директно от околната среда.

Значението на секвенирането както на некодиращи рРНК, така и на гени, кодиращи протеини, нарастна, със специфичния интерес към реконструкция на бактериални геноми. Цялостното вземане на проби от всички гени от всички организми, съществуващи в сложно микробно съобщество, е постижимо чрез метагеномното секвениране. Използването на този метод позволява да се оцени бактериалното разнообразие и да се открие изобилието от микроорганизми в конкретна среда. Освен това прави възможно възстановяването на пълни геноми на некултивируеми микроорганизми. В допълнение към откриването на нови видове археи, бактерии, протозои, водорасли, гъби и еукариотни видове, тази техника е от решаващо значение за реконструкцията на вирусни геноми. Това беше критичен напредък, като се има предвид, че вирусите нямат общ универсален филогенетичен маркер като бактериална 16S рРНК или еукариотна 18S рРНК.

Друг подход е метатранскриптомният подход, който вместо да използва геномна ДНК (гДНК) включва събирането на тотална РНК изследваното съобщество. Така получената проба се използва за конструиране на библиотеки от кДНК, които в последствие се секвенират. Въпреки че РНК е по-малко стабилна от ДНК, тя дава моментна снимка на текущото състояние на съобщетвото, като разкрива индуцираните и репресирани гени. Понастоящем, едно от най-важните метатранскриптомни изследвания, е това на съобществата на морските води.

Едноклетъчна геномика (SCG)

Метагеномното секвениране е полезен инструмент за разбиране на екологичните съобщества. Въпреки това, сглобяването на каталози от гени и композитни геноми може да бъде предизвикателство. Трудно да се направи и разлика между гени, които произлизат от едни и същ или от различни организми в геноми, които вече са сглобени (Фиг. 3). Следователно има значителен интерес към разработването на система за разбиране на организацията на откритите гени и метаболитни пътища в рамките на един геном.

Фиг.3. Метагеномика срещу едноклетъчна геномика

Предизвикателството на хетерогенността на пробата може да бъде частично решено чрез използване на две техники – мащабиране и дълбоко секвениране. Необходими са различни подходи за сравняване на метагеномни проби, събрани от различни среди и за разкриване на състава и организацията на геномите на микроорганизмите в околната среда. Един от подходите е обогатяване на културата на конкретни организми въз основа на техните специфични екологични функции. Този тип целенасочен метагеномен подход позволява развитието на композитни микробни геноми. Освен това, към некултивируемостта на много организми, се добавят и други проблеми, като например в случаите когато по-бързо растящите микроорганизми изместват по-бавните, което впоследствие води до допълнителни отклонения в резултатите.

Следователно, вместо да бъде култивирана, една сложна проба може да бъде обогатена на целевата клетъчна популация, използвайки флуоресцентно активирано клетъчно сортиране (FACS). Прилагането на този подход помага за сортиране на клетките въз основа на тяхната форма, размер и плътност. Като алтернатива, специфичните организми от интерес могат да бъдат обогатени чрез работа с малък брой клетки, които притежават специфична функция в околната среда. С развитието на техниките за амплифициране на целия геном (WGA) (например, амплификация с множество измествания (MDA) или амплификация с въртящ се кръг (RCA)), гДНК на ограничен брой клетки може да бъде амплифицирана и секвенирана. Въпреки това, WGA техниките създават потенциални отклонения, тъй като изобилието от специфични последователности варира и следователно не се амлифицират еднакво. Следователно, амплификацията на гДНК на определени популации с ограничен брой клетки компрометира количествения анализ на метагеномиката.

Последните постижения в амплификационните техники на единичен геном позволяват прилагането на SCG чрез физическо разделяне на клетките (обикновено чрез FACS върху 96-ямкови плаки), клетъчен лизис и WGA. След това така амплифицирания геном от една клетка може да бъде секвениран. Докато метагеномиката се постига чрез събиране на микробните съобщества и извличане и секвениране на общата ДНК, SCG отделя и изучава отделни клетки от съобщетвата на микроорганизмите. Получените секвенционни данни предоставят количествена информация за геномната вариабилност в микробните популации. Инсерциите, делециите, дупликациите и геномните пренареждания могат да бъдат изследвани на ниво една клетка. По този начин сложните метаболитни пътища могат да бъдат анализирани за отделна клетка.

Изолиране и обработка на единична клетка

Изучаването на генома и неговата регулация на популационно ниво се извършва чрез анализ на милиони клетки наведнъж. Въпреки това, подобни изследвания не предоставят поглед върху хетерогенността в биологичните системи, нито характеризират текущото състояние на популацията. Ето защо SCG придобива все по-голяма популярност за изучаване както на култивируеми, така и особено на некултивируеми микроорганизми. Процесът за получаване, размножаване и секвениране на генетичния материал от живи или мъртви клетки е сравнително прост. Първо клетката трябва да бъде изолирана и лизирана и след това освободеният генетичен материал се амплифицира и може да се конструира геномната библиотека.

Един от подходите за изолиране на единични клетки е микроманипулацията. Интересуващите ни клетки се идентифицират и изследват микроскопски. Подходящите клетки се изолират с помощта на микропипета, лазерен източник, оптична пинсета или чрез микрофлуиден поток в реално време. С помощта на микрофлуидика може да се избере желания фенотип, корелиращ със специфичен геном. Освен това клетките могат лесно да бъдат наблюдавани преди улавяне.

Друг подход е случайното капсулиране. Клетките се избират на случаен принцип чрез серийно разреждане. След това разредената проба може да бъде прехвърлена в микроямки или клетките могат да бъдат капсулирани чрез микрокапчици. С помощта на тази техника отделните клетки могат да бъдат разделени, обработени и подложени на геномен анализ.

Поточната цитометрия (FACS) е най-популярната процедура за произволно капсулиране. FACS позволява изолирането на клетки, притежаващи специфични критерии, като размер, форма, цвят или дори наличие на специфични нуклеинови киселини или активности, като се използват флуоресцентни багрила (Фиг. 4). Едно от основните предимства на FACS е неговата висока пропускателна способност, висока скорост на сортиране и способност за разграничаване на живи клетки. Освен това, FACS може да открие наличието на клетки в капчица, да отхвърли празните капчици и да прехвърли клетките с желаните свойства в многоямкови / микротитърни плаки. След това клетките могат да бъдат лизирани и геномите могат да бъдат амплифицирани в единични ямки.

Друга възможност за изолиране на единична клетка е микрокапковата технология (Фиг. 4). Микрокапките са емулсията, образувана, когато клетките във водната фаза се смесват енергично с масло. Маслените капчици капсулират клетките във водната фаза. Първоначално се смяташе, че PCR, извършен върху емулсия, е много по-специфичен от анализа на клетките само във водната фаза. Предполага се, че добивите на реакционните продукти са по-големи и се образуват по-малко химерни странични продукти. Освен това, образуваните капчици обхващат ограничен брой шаблонни молекули (в идеалния случай само една). Последните разработки в микрофлуидиката позволяват да се контролира размера на капчиците (нанолитър или дори пиколитър), осигурявайки водни еднородни (монодисперсни) капчици в масло. Едно от основните предимства на двуфазната система от микрокапчици пред FACS е възможността за обработка на отделни клетки като отделни единици. Всяка капчица действа като независима ямка, където клетките могат да се отглеждат и по-късно да се проверяват за експресираните продукти. Освободената гДНК може ефективно да се амплифицира в микрокапчици и да се използва за подготовка на библиотека за секвениране. Клетките на бактерии, дрожди, растения, насекоми и бозайници могат лесно да бъдат изследвани с помощта на микрокапкова технология върху агароза или други микрогелове. Дори многоклетъчните организми могат да бъдат капсулирани и отглеждани в капчица. Хипотетично е възможно да се измери всяка секретирана молекула, за която съществува флуоресцентно белязан лиганд. Освен това може да се наблюдава активността на различни клетъчни протеини.

Фиг. 4. Техники за изолиране на единични клетки

Подходи за изследване на различни клетки

Живите клетки обикновено могат да бъдат класифицирани като бактерии, археи и еукариоти. Въпреки че вирусите не се считат за „живи“, те представляват важна част от научните изследвания за живота. За изследване на различните организми са разработени различни подходящи едноклетъчни анализи.

Вирусите присъстват практически във всяка среда. Те са най-разпространените и разнообразни биологични обекти. Въпреки това, за да се изолира единичен вирус и да се секвенира неговият геном, първо трябва да се установи подходяща култивируема система вирус-гостоприемник. Например, еукариотните водорасли са домакин на невероятно разнообразие от вируси. Въпреки това, използвайки както FACS, така и еднокапковите системи, вирусите теоретично могат да бъдат изолирани без зависимост от системата вирус-гостоприемник.

Археите и бактериите имат сходна клетъчна структура. Само разликите в клетъчния състав и организация разделят тези два домена. Бактериалните клетки обикновено са с диаметър 0,5–5,0 μm, докато археите могат да бъдат по-големи и да достигнат 15 μm в диаметър. По принцип всички описани по-горе методи могат да се използват за разделяне и обработка на единични археални и бактериални клетки. Въпреки това, при използване на FACS силните потоци могат да забавят растежа на тези организми.

Еукариотите се различават от другите домени на живот по наличието на мембранно ограничено ядро и органели. Те могат да бъдат многоклетъчни или едноклетъчни организми. Размерът на клетките обикновено варира от около 10-100 μm или те са десет пъти по-големи от бактериите. Разреждането, FACS и сортирането на капчици са подходящи методи за изолиране на еукариотни клетки.

Многоклетъчните организми теоретично също могат да бъдат изолирани и обработени по различни методи. FACS например може лесно да сортира многоклетъчни организми. Ако се инкубират в капчици за достатъчно време, едноклетъчните организми могат да синтезират протеини или лиганди и да имат възможност да се размножават, потенциално създавайки многоклетъчна структура.

В резултат на молекулярните изследвания на околната среда и екологията се придобиват все повече и повече знания за живите общности. С разработването на различни молекулярните инструменти, особено машини за секвениране, стана възможно да се секвенират цели съобщества от избрани среди. Последните постижения в едноклетъчните технологии улесняват изолирането и амплификацията на геномен материал от единични клетки и позволяват структуриране на множество секвенционни библиотеки. Освен това данните, получени от SCG, допълват данните, получени чрез метагеномика.

Биотехнологията използва биологични процеси, организми или системи за генериране на продукти и технологии, които подобряват човешкия живот. Използването на биологични системи за производство на биопродукти с търговско значение е ключов компонент на биотехнологичната индустрия. Този биотехнологичен подход е намерил приложение в различни области: енергетика, получаване на различни материали, фармацевтична и хранителна промишленост, селско стопанство и козметика. Биопродуктите, произведени в резултат на биотехнологични процеси, обикновено са метаболити и протеини, които се получават от клетки, тъкани и органи. Биологичните системи, синтезиращи тези биопродукти, могат да бъдат естествени или модифицирани чрез генно инженерство, метаболитно инженерство, синтетична биология и протеиново инженерство. „ОМИКС“ технологиите имат голямо значение за биотехнологиите и метаболитното инженерство, като помагат при характеризирането и разбирането на метаболитните мрежи. За разработването на нови биотехнологични инструменти и за усъвършенстване на метаболитното инженерство могат да бъдат използвани много от знанията, придобити от „ОМИКС“ експериментите. Това позволява манипулирането на сложни биологични системи за създаване на стабилни индустриални стратегии за биопроизводство.

Биотехнологии, ръководени от „ОМИКС“ изследванията

„ОМИКС“ инструментите  се използват все повече при разработването на биотехнологични процеси и производството на много жизненоважни продукти. Прилагането на тези технологии при характеризиране и разбиране на биологичните системи позволява да се предскажат и подберат подходящи фенотипове, което улеснява оптимизирането на биотехнологичното производство (по качество и количество) на търговски релевантни продукти (Фигура 5).

Фиг. 5. „ОМИКС“ инструменти в биотехнологиите

Производство на биогорива и биопродукти

Микробното производство на натурални съединения представлява привлекателна и по-устойчива алтернатива на традиционните нефтохимикали. Неговото прилагане доведе до появата на нарастващ брой от ценни естествени продукти и химикали. Например, използването на лигноцелулозна биомаса представлява икономичен подход за генериране на биогорива и биопродукти. Въпреки това, за да се постигне стабилно превръщане на евтини суровини в продукти с добавена стойност на промишлени нива са необходими систематични инженерни планове. Цикълът Проектиране-Създаване-Тестване-Обучение (Design-Build-Test-Learn) (DBTL) се превръща във все по-прилаган подход за експерименти в областта на метаболитното инженерство. Той представлява систематичен и ефективен инструмент за форсиране на усилията за развитие на биогорива и продукти на биологична основа. Цикълът DBTL използва in silico подход за проектиране и изграждане на генетични конструкции в микробни гостоприемници. След това информацията, получена от „ОМИКС“ технологиите, по време на тестовата фаза на цикъла, се прехвърля в процесите на обучение (Фигура 6). След това наученото се връща към новите цикли на проектиране, за да се постигне по-нататъшно разработване и оптимизация на индустриалните микроорганизми. По този начин се улеснява бързата оптимизация на микробните щамове свръхпродуценти на всяко химично съединение от интерес. Най-слабата точка в работния процес на цикъла на DBTL е процесът на обучение, тъй като математическите модели са толкова добри, колкото техните предположения. Следователно, са необходими както висококачествени, така и големи набори от „ОМИКС“ данни, за да може да се подобрят моделите за обучение и да се осигури повишена точност и надеждност на процеса.

Фиг. 6. DBTL цикъл за оптимизация на процесите за получаване на биогорива и биопродукти

Често в DBTL цикъла традиционният подход, прилаган в началните етапи на изследване, е използването на информацията за геномната последователност. Например, баркод секвенирането (Bar-seq) (метод, използващ къса част от ДНК от специфичен ген или гени) може да се използва за изследване на динамиката на популацията на Saccharomyces cerevisiae по време на култивиране в биореактор. При този анализ се използват делеционни библиотеки, които позволяват идентифицирането на факторите, които влияят върху различните мутантни фенотипи. Секвенирането на единични клетки, може да се използва за идентифициране на ключови мутирали промотори и тази информация да бъде използвана за регулиране на нивата на експресия и съответно на микробния растеж. Чрез прилагането на протеомни анализи са проектирани платформи за биосинтеза на поликетиди с цел in vitro производство на адипинова киселина в дрожди. Освен това, метаболомиката позволява оценка на метаболитните потоци, усвояването на източника на въглерод и дисбаланса на кофакторите, като познанията върху всички тези параметри допринасят за идентифицирането на тесните места в съответния метаболитен път. Такъв подход, на базата на метаболомен анализ, вече е използван за характеризиране на производството на канабиноиди в рекомбинантни щамове на S. cerevisiae. Канабиноидните аналози са предварително идентифицирани и чрез прилагането на метаболомика е проектиран и оптимизиран нов изопентенил дифосфат-байпас мевалонатен път в E. coli за производство на C5 алкохол. DBTL цикъла е използва от някои автор, за да модифицират Rhodosporidium toruloides, олеогенен вид дрожди, растящи върху лигноцелулозни материали, да синтезират дитерпенов ент-каурен, потенциално терапевтично средство, проявяващо антимикробно, противовъзпалително, диуретично, диуретично и противовъзпалително, сърдечно-съдово, диуретично, анти-СПИН и цитотоксичен ефект.

Селскостопанска и хранителна биотехнология

Последните иновации в селскостопанската биотехнология доведоха до нови сортове растения, създадени чрез рекомбинантна ДНК технология и отговарящи по-добре на пазарните изисквания и екологичните предизвикателства. Всъщност в селскостопанската биотехнология „ОМИКС“ инструментите се използват за подобряване на желаните фенотипни характеристики (например цвят, вкус, устойчивост на суша, устойчивост на пестициди и др.). „ОМИКС“ анализите играят роля не само за подобряването на качеството, консистенцията и производителността на реколтата, но и за развитието на селскостопански култури с подобрен хранителен състав. Освен това, системната биология помага за разбирането на взаимодействията между различните клонове на „ОМИКС“ анализите и предоставя връзката между гени и специфични характеристики.

В обработваемите райони почвата е по-податлива към загуба на структура, на органична материя, минерали и на ерозия. Прилагането на селскостопанска биотехнология спомага за осигуряване на постоянно снабдяване на земеделските земи с хранителни вещества, необходими за растежа на културите. Неразделна част от този подход е използването на биоторове. Това са препарати, съдържащи специализирани микробни инокуланти, които могат да фиксират, мобилизират, разтварят или разлагат източниците на хранителни вещества. Биоторовете обикновено се прилагат чрез семена или почва и подобряват усвояването на хранителни вещества от растенията. Широкото приложение на този подход обаче е възпрепятствано от флуктуациите в поведението на микробните инокуланти в полетата и културите. В резултат на това съществува неотложна необходимост от по-добро разбиране на механизмите, лежащи в основата на взаимозависимостта между почвените микробни съобщества и производителността на растенията гостоприемници. Последните геномни и екзо-метаболомни проучвания показват, че специфични ризосферни бактерии имат естествено предпочитание към определени ароматни органични киселини, отделяни от растенията. Този факт предполага, че растителната ексудация и усвояването на субстрати от микроорганизмите си взаимодействат и образуват специфични микробни съобщества. Освен това, изследване на поглъщането на фосфат от различни микроводорасли чрез прилагане на геномини и транскриптомни анализи разкри наличието на специфичен набор от Pi транспортери, имащи специфични модели на експресия по отношение на наличността на P в средата. Понастоящем „ОМИКС“ подходите се използват за изследване на сложни ризосферни интеркомуникации, което е от решаващо значение за разработването на нови биоторове, които да стимулират растежа на растенията и да осигуряват по-добра продуктивност и добиви.

В областта на хранителните биотехнологии, прилагането на транскриптомика и метаболомика показа, че Bacillus pumilus LZP02 стимулира растежа на оризовите корени чрез подобряване на метаболизма на въглехидратите и биосинтеза на фенилпропаноид. Освен това, прилагането на „„ОМИКС““ подходи при биоинженерство на нишесте осигурява по-добро разбиране на най-важните ензими, отговорни за неговата биосинтеза. Това улеснява предвиждането на това как фенотипините изяви, свързани с въглехидратния метаболизъм, могат да бъдат модифицирани и гарантира по-нататъшен напредък в изследователската област на биотехнологията на оризово нишесте. „„ОМИКС““ анализите помагат и за решаването на проблеми, свързани с качеството и проследимостта на храните, за защита на произхода на храната и откриване на биомаркери за потенциални проблеми с тяхната безопасност. Предварителното изследване на микробиома на виното е от голямо значение за винената индустрия, като помага за по-доброто разбиране на факторите, трансформиращи гроздето във вино, включително вкус и аромат. „„ОМИКС““ характеризирането на сложните взаимоотношения между тези микроорганизми, субстрата и околната среда, е от съществено значение за оформянето на производството на вино. И накрая, комбинирането на „ОМИКС“ технологиите с редактиране на генома на микроорганизми в храни може да се използва за генериране на подобрени пробиотични щамове, разработване на иновативни биотерапевтици и промяна на структурата на микробната общност в хранителните субстрати.

“ОМИКС” технологиите и COVID-19

Коронавирусната инфекция от 2019 година (COVID-19) се характеризира с тежък остър респираторен синдром коронавирус 2 [т.е. SARS-CoV-2, който се свързва с ACE2 рецептора в белите дробове и други органи]. Поради световното му разпространение беше обявена глобална пандемия и голяма част от световната икономика пострада значително. До април 2021 г. са потвърдени повече от 138 милиона случая и 2,5 милиона смъртни случаи в световен мащаб (https://www.worldometers.info/coronavirus/). Това доведе до предприемане на ефективни контрамерки за смекчаване на разпространението на пандемията.

Много усилия бяха вложени в ускоряването на разработването и производството на безопасни и ефективни ваксини срещу SARS-CoV-2. Предшестващите познания върху SARS и респираторния синдром от Близкия изток (MERS) улесниха таргетирането на протеина, изграждащ шиповете, като основен вирусен антиген (чрез ACE2 рецептора). Освен това, секвенирането на генома на SARS-CoV-2 през януари 2020 г. направи възможно ускоряването на разработването на следващо поколение иРНК ваксини и платформи за ваксини, които кодират антигена. Веднъж инжектирана в гостоприемник, иРНК, капсулирана в липидни наночастици, остава в цитоплазмата. Когато се използва ДНК, обвита в атенюиран аденовирусен вектор, тя навлиза в ядрото. Клетката гостоприемник превежда тези генетични материали в кода на протеина, изграждащ вирусния шип. Той се установява на повърхността на клетката и провокира адаптивен имунен отговор, медииран от Т клетки (например, CD⁴⁺ и CD⁸⁺) и В клетки (т.е. антитела). В проведените клинични изпитвания бе установено, че така получените ваксини са ефективни срещу SARS-CoV-2, което подчертава значението на геномиката за тази нова ера на разработване на ваксини.

От началото на избухването на SARS-CoV-2 пандемията беше създадена карта на взаимодействието на протеините и с помощта на различни протеомни подходи бяха разкрити специфични вирусни целеви мишени за лекарствени препарати. Чрез прилагане на протеомен анализ 26 от 29-те SARS-CoV-2 протеина бяха клонирани, маркирани с афинитетни багрила и експресирани в човешки клетки. Като резултат, бяха открити общо 66 човешки протеина, които могат да бъдат потенциални лекарствени мишени на 69 съединения. Две от тези фармакологични средства показват антивирусна активност. Освен това бяха извършени компютърни имунопротеомни анализи, в подкрепа на лабораторните изследвания, които позволиха оценка на специфичността на диагностичните продукти, прогноза за потенциални неблагоприятни ефекти на ваксините и намалиха използването на животински модели.

Наскоро беше разработен и метод, базиран на метаболомика, който е в състояние да разграничи пациентите с COVID-19 от здрави контроли чрез анализ на 10 плазмени метаболита. Освен това, данните от липидомното проучване предполагат, че обогатените на моносиалодихексозил ганглиозид екзозоми вероятно са част от патологичните процеси. Протеомните и метаболомните изследвания в серумите на пациенти с COVID-19 разкриха, че инфекцията със SARS-CoV-2 причинява метаболитна дисрегулация на макрофагиалния и липидния метаболизъм, дегранулация на тромбоцитите, нарушаване на системата на комплемента и масивна метаболитна супресия. Анализът на плазмените метаболомни сигнатури показа профил, подобен на този, описан при сепсис. Освен това, резултатите от транскриптомните анализи показват повишена регулация на гени, свързани с окислително фосфорилиране, както в периферните мононуклеарни левкоцити, така и в бронхоалвеоларната течност. Цялата тази информация предполага критична роля на митохондриалната активност по време на инфекция със SARS-CoV-2. Разбирането на клиничното представяне на COVID-19, както и на метаболомните, протеомните и генетичните профили, може да помогне за откриването на специфични диагностични, прогностични и предсказващи биомаркери, като гарантира развитието на по-успешна медицинска терапия. Освен това, диференцирането на метаболитни биомаркери на тежки спрямо леки болестни състояния в белите дробове по време на респираторни инфекции може да доведе до откриването на нови терапевтични средства, които модулират симптомите и тежестта на заболяването.

Измина повече от десетилетие, откакто идеята за нутригеномика беше въведена за първи път. Нутригеномиката, наричана още хранителна геномика, хранителна омика или нутри-омика, може да бъде определена като област на изследване на храните и храненето, използващо задълбочени анализи на молекули или други физически явления.

Като се има предвид сложността на човешкото тяло и различните му взаимодействия с храната, е възможно холистичните анализи на връзката храна-тяло да е важна предпоставка за по-добро разбиране на ефекта на хранителните компоненти. Основната идея е, че комбинацията от различни „ОМИКС“ платформи ще осигури по-задълбочено вникване във влиянието на хранителните компоненти и механизма на тяхното действие.

Геномика и хранене

Човешките гени имат различни варианти в популацията. Като се има предвид, че отговорът към храненето е мултигенен процес, не е изненадващо, че несвързаните индивиди могат да реагират по различен начин. Основната хипотеза, предложена през последните години, гласи, че генетичните вариации са в основата на вариациите в свързаните с храненето разстройства и риска от заболяване. Всъщност нутригенетиката се опитва да обясни как и до каква степен свързаните с храненето черти и разстройства се влияят от генетичните вариации. С други думи, ключовите въпроси на нутригенетиката са:

• Кои гени участват в определянето на дадена характеристика?
• Каква е функционалната идентичност на вариацията, по която хората се различават за тази характеристика?
• Как тези знания могат да бъдат използвани в полза на населението?

Обикновено изследователите дефинират различни „гени кандидати“ за дадена характеристика или разстройство и изследват тези гени за наличие на вариации. Това се описва като подход, основан на „хипотеза“, тъй като подборът на гените се основава на тяхната предполагаема функция. Например, гените, кодиращи липопротеини се използват като кандидати за затлъстяване, а гените, отговорни за инсулиновата сигнализация – като кандидати за диабет. Други привлекателни кандидати при хората са гените ортолози, лежащи в основата на животинските модели с менделова сегрегация на характеристика. Добре известен пример е db/db мишката. Това е модел за диабет, в който е идентифициран генът за лептиновия рецептор. След това човешкият хомолог беше тестван при хора с нарушен глюкозен толеранс. Идентифициран е един вариант (алел) на гена и е доказано, че той е свързан със значително по-висока честота на поява на диабет в сравнение с общата популация.

Други прилагани методи са свързани с изучаване на предпочитаната сегрегация на даден алел от родители към засегнато дете (тест за неравновесие на предаването) или към по-засегнати братя и сестри (анализ на двойки). Ако се установи, че даден ген е свързан с характеристиката, остава да се докаже дали самият асоцииран или свързан алел е рисков фактор, или може да се използва само като маркер за близка причинно-следствена вариация. Ако генетичната вариация е свързана с изменение на аминокиселини в протеина, може да се разработи функционален тест и алелните протеини могат да бъдат сравнени за тяхната ензимна активност, ДНК-свързващ афинитет и т.н.

Друг подход за търсене на рискови гени за определена характеристика или метаболитно нарушение е цялостното сканиране на генома. Откриват се стотици полиморфизми с произволно разпределение в генома, но с известно хромозомно местоположение. След това за всяко полиморфно място се идентифицира дали съществува връзка между алела и характеристиката. Използвайки този подход, рисковите локуси могат да бъдат идентифицирани за много нарушения, свързани с човешкото хранене, като затлъстяване и диабет.

След Втората световна война в много западни страни се наблюдава, че случаите на спина бифида постепенно намаляват. Предполага се, че подобрението на диетата е довело до този ефект. Започва голямо епидемиологично проучване. Получените резултати показват, че обогатяването на диетата с витамини е в състояние да предотврати появата на спина бифида при повече от 50% от хората. Установява се, че фолиевата киселина е тази важна субстанция и понастоящем в много страни приемането й преди зачеването се препоръчва като обща превантивна мярка. Едновременно с това става ясно, че по отношение на риска за дете със спина бифида, жените в популацията могат да бъдат разделени грубо на три групи: [а] не са изложени на риск дори при нисък прием на фолиева киселина, [b] са изложени на риск при диети с ниски концентрации на фолиева киселина, но появата на спина бифида може да бъде предотвратена от повишен прием на фолиева киселина и [c] изложени са на риск въпреки допълнителния прием на фолиева киселина. Предполага се генетично предразположение и кандидат-гените, избрани от метаболизма на фолата, са изследвани за генетични вариации. Това довежда до откриването на алелите 667C->T и 1298A->C в гена за метилентетрахидрофолат редуктаза (MTHFR) като рискови фактори. Въпреки това, тези рискови алели са открити до известна степен и в трите групи жени, което илюстрира, че генетичното тестване в контекста на персонализирана диета би било неадекватно. Освен това става ясно, че не целият относителен риск може да бъде обяснен с тези алели. Следователно търсенето на генетични вариации в други гени продължава и се очаква да бъдат намерени нови кандидат-гени.

Понастоящем чрез използване на генетични експерименти в различни популации и изследване на животински и in vitro моделни системи вече са идентифицирани няколко стотици гени, отговорни за специфични характеристики и нарушения, свързани с храненето. В резултат, изследванията на нутригеномиката и нутригенетиката трябва да доведат до цялостно разбиране на етиологията на тези характеристики и нарушения по отношение на взаимодействащите гени, хранителните компоненти и относителния риск, пренасян както от генетичните вариации, така и от диетата. Това комбинирано знание ще позволи генетичното профилиране на всеки индивид и по този начин ще оцени неговия/нейния риск от развитие на хранителни нарушения. Въз основа на този личен рисков профил от генетични фактори може да бъде предложена „персонализирана диета“, чрез която началото на разстройство може да бъде предотвратено или поне отложено. Вече някои компании предлагат генетични тестове за алели, за които е установено, че са свързани с определени характеристики. Например, алелът ApoE се тества като рисков фактор за сърдечно-съдови заболявания. Алел на гена на алкохол дехидрогеназата се използва за прогнозиране на потенциална чувствителност към алкохол и (зло)употреба. Важно е обаче да се отбележи, че може да се каже, че наличието на определен алел увеличава риска от разстройство със 100%, докато в абсолютни стойности рискът обикновено все още е много малък като увеличение от 0,001 на 0,002. Освен това, тестването само на един генетичен фактор може да даде непълна или дори погрешна представа за ситуацията. В днешно време нямаме представа за всички генетични фактори и как те взаимодействат. Докато се събере повече информация, съветите, базирани на просто тестване, вероятно трябва да останат прости и да звучат като „пийте по-малко алкохол“ или „яжте по-малко наситени мазнини“.

Транскриптомика и хранене

Транскриптомиката е най-широко използваният подход при изследванията на храните поради многото предимства на технологията на ДНК микрочиповете, включително изчерпателността на данните за експресията, установените протоколи и високата надеждност и възпроизводимост на данните. На базата на подобни изследвания беше установено, че съществува промяна в глобалната генна експресия в отговор на различни диетични промени, като хранителен дефицит, гладуване, преяждане и поглъщане на специфични хранителни компоненти. Като пример за такива изследвания е получаването на референтни данни с помощта на транскриптомен анализ на черен дроб на плъхове, лекувани със слаба рестрикция на калориите. При използването на експериментални животни, беше показано, че умерено намаляване на приема на храна или променен модел на прием могат да бъдат достатъчни за появата на значителни метаболитни промени. Ето защо е важно да се прави разлика между преките ефекти на хранителните компоненти и вторичните ефекти, причинени от промяната в хранителното поведение. Когато плъховете са били хранени с диета с 5 до 30% по-малко храна от тази, консумирана от група, хранена ad libitum в продължение на 1 седмица или 1 месец, се наблюдават рестрикционно-зависими промени в нивото на експресия на cyp4a14. Всъщност генът cyp4a14 се индуцира дори при много слабо ограничение на калориите. Тези данни предполагат, че генът може да се използва като биомаркер за благоприятните ефекти на храната върху енергийния метаболизъм.

Протеомика и хранене

Много изследвания на храните и храненето са проведени чрез използване на протеомни подходи. Ефектът от слабата рестрикция на калориите, описан по-горе, е изследван и чрез прилагане на протеомен анализ. След провеждане на протеомното сравняване на чернен дроб на плъхове, подложени на 30% хранителна рестрикция в сравнение с контролните, е установено наличието на девет протеина със значително повишена експресия и девет протеина с понижена такава. Десет процента рестрикция предизвика активиране на 9 протеина и репресия на 2. Интересно откритие беше повишаване на експресията на прохибитин, за който наскоро беше разкрито, че участва в процесите на забавяне на стареенето. Този резултат предполага, че прохибитинът може да се приложи като ефективен биомаркер за благоприятното въздействие на хранителните фактори. Въпреки че понастоящем прилагането на протеомни изследвания е много по-ограничено в сравнение с траскриптомните, изследването, описано тук, заедно с други протеомни резултати, показват, че този „ОМИКС „анализ е много обещаващ инструмент за откриване на различни биомаркери.

Метаболомика и хранене

В животинските организми съществуват около десет хиляди различни вида основни метаболити, докато броят на протеините се смята, че надвишава 100 000. Очаква се проучването на характеристиките на тези съединения да доведе до по-прецизен метаболомен анализ в сравнение с протеомния. Въпреки това, при анализа на метаболитите се наблюдават редица ограничения и обикновено се изисква използването на сложни техники и висококвалифициран персонал. Друго затруднение произтича от голямото изобилие на метаболити в клетката. Независимо от тези препятствия, метаболомиката е мощен инструмент в науката за храните и храненето.

Много изследвания показват, че чревния и серумен метаболизм се влияе от промяната в състава на чревния микробиом. Микробиомът на червата и неговото изменение в съответствие с приемната диетата са от съществено значение при използването на метаболомни изследвания и оценката на крайните ефекти. Сравняването на стерилни мишки, колонизирани с човешка бебешка микрофлора и конвенционални мишки, показа сложността на ковариацията на микробиом/метаболом, която може да се модифицира вследствие на приложената диета. В това проучване е изследван ефектът на чревния микробиом върху плазмените метаболити. Данните показват, че повече от 10% от плазмения метаболом е пряко зависим от микробиома. Някои примери за микробно зависими съединения в плазмата включват цинамова киселина, глицин конюгирани съединения, хипурова киселина и други плазмени метаболити. Чревният микробиом влияе пряко и върху способността на гостоприемника да метаболизира липидите, въглехидратите и протеините и може да осъществи и някои реакции на фаза II на детоксикация. Има също доказателства, че чревните микроорганизми използват нехранителни фитохимикали. Например, няколко изследвания показват, че нивата на три зависещи от микробиома метаболита и свързани с типа диета, холин, триметиламин N-оксид и бетаин, могат да предскажат риск от сърдечно-съдови заболявания при мишки.

Хранене и други „ОМИКС“ анализи

Много други „ОМИКС“ платформи също са на фокус в изследванията в областта на нутриомиката. Доказано е, че епигенетичната промяна може да бъде причинена от хранителната диета по време на феталното развитие и може да повлияе на предразположеността към заболявания, свързани с начина на живот в по-късен етап. Например, децата на майки, които са страдали от прекомерно хранене или недохранване по време на бременност, имат повишен риск от развитие на затлъстяване, диабет, хипертония, сърдечно-съдови заболявания и т.н. Много проучвания доказват участието на епигенетичните модификации в такава придобита чувствителност. Друга обещаваща цел на „ОМИКС“ подходите в науката за храните е свързана с РНК транскриптите, които не кодират протеини. МикроРНК (miRNA) е подтип на тези некодиращи РНКи. Прекурсорите на микроРНКте (pri-miRNA) са дълги продукти, които се разцепват, за да се получат зрели микроРНКи с дължина 22 нуклеотида. Зрелите микроРНКи регулират нивата на разграждане на иРНК, транслацията на иРНК и дори генната транскрипция. В човешките клетки са идентифицирани около 1000 микроРНКи и се предполага, че те регулират експресията на повече от половината от протеин-кодиращите гени. Имайки предвид натрупващите се данни, подкрепящи ключовата роля на микроРНК в развитието на заболявания и поддържането на здравето, информацията за състоянието на микроРНКте без съмнение е жизненоважна за разбирането на взаимодействието между хранителните компоненти и тялото. Понастоящем глобалният анализ на микроРНК може лесно да се извърши чрез използването на налични търговски продукти.

В ерата на постгеномиката с въвеждането на нови технологии и придобити знания, броят на „ОМИКС“ анализите и техните приложения в различни области бързо се увеличава. Такива нововъзникващи области – включително фармакогеномика, токсикогеномика, регуломика, сплайсеомика, метагеномика и екология – представят обещаващи решения за борба с глобалните предизвикателства в биомедицината, селското стопанство и околната среда.