„Biosensori & Biochip per un Futuro Sostenibile”
Livello base
I biochip sono apparsi come una piattaforma microtecnologica innovativa per l’analisi delle biomolecole negli anni ’80.
Sommario
Biosensori & Biochip: una panoramica
I biochip sono apparsi come una piattaforma microtecnologica innovativa per l’analisi delle biomolecole negli anni ’80. Una varietà di tecnologie, come le scienze della vita, la tecnologia dell’informazione, la microelettronica e la micromeccanica, sono coinvolte nelle tecnologie sottostanti. I biochip sono considerati importanti strumenti potenziali nella moderna ricerca delle scienze della vita, nella diagnosi medica, nella scoperta di farmaci, nel monitoraggio della sicurezza alimentare e nell’agricoltura in quanto ad alte prestazioni, miniaturizzati, automatizzati e convenienti. Ci si aspetta che i biochip permettano di aumentare drasticamente la velocità e la portata del processo analitico e di fornire un enorme valore economico. Inoltre, negli ultimi anni, numerosi governi e aziende industriali nel mondo hanno investito molto in questo settore. La tecnologia dei biochip è per ora solo nella sua prima evoluzione. Si tratta di un settore in continua evoluzione. Il futuro della ricerca e dello sviluppo dei biochip è luminoso. C’è una concorrenza furiosa in questo settore.
Nella ricerca biomedica e nelle scienze della vita, la miniaturizzazione dei processi di laboratorio chimici e biomedici su microchip è un campo in rapida espansione. Le tecnologie Lab-on-chip porteranno molti vantaggi rispetto alle loro controparti di dimensioni macro. In particolare, i rapporti superficie-volume più alti si traducono in requisiti chimici ridotti, rifiuti ridotti, migliore controllo, elaborazione rapida e capacità significativa per l’elaborazione parallela e l’incorporazione del processo. Le tecnologie Lab-on-chip hanno il potenziale per avere un significativo impatto socio-economico. Nella medicina di laboratorio, i micro dispositivi completamente integrati per la sintesi chimica e la diagnosi delle malattie offrono una svolta scientifica e un cambiamento di paradigma nell’elaborazione chimica. Il progetto del genoma umano ha dato un enorme contributo a questa tecnologia.
Nel campo dell’analitica, i biosensori permettono grandi innovazioni che sono al tempo stesso agevolate e facilitate dagli sviluppi della biologia sintetica. Il potenziale dei biosensori di identificare una vasta gamma di molecole in modo facile e preciso li rende molto importanti per una varietà di applicazioni industriali, mediche, ecologiche e scientifiche. Le strategie di progettazione dei biosensori sono numerose quanto le loro applicazioni, con i principali gruppi di biosensori che includono acidi nucleici, proteine e fattori di trascrizione. In base all’uso previsto e ai parametri richiesti per una prestazione ottimale, ognuno di questi tipi di biosensori ha vantaggi e limitazioni. In particolare, considerazioni come la specificità del ligando, la sensibilità, la gamma dinamica, la gamma funzionale, la modalità di uscita, il tempo di attivazione, la facilità d’uso e la facilità di ingegneria devono essere considerate quando si sceglie il design del biosensore.
Schemi per i biosensori: Progettazione e funzionamento
I biosensori sono sensori che trasformano i processi di bioriconoscimento attraverso un trasduttore fisico-chimico in segnali osservabili, con tecniche elettroniche e ottiche come due trasduttori principali. La creazione di biosensori risponde all’odierno bisogno crescente di diagnostica clinica. L’uso dei biosensori comporta una combinazione di vantaggi. I biosensori, in primo luogo, sono altamente sensibili. Questo perché le biomolecole hanno un’alta affinità per i loro bersagli, per esempio, gli anticorpi catturano gli antigeni con una costante di dissociazione alla scala nanomolare, e le interazioni DNA – DNA sono molto più forti di antigene-anticorpo. In secondo luogo, il riconoscimento biologico è tipicamente molto selettivo. L’enzima e il substrato sono come una serratura e una chiave, per esempio. Questa alta selettività porta spesso a biosensori che sono selettivi. In terzo luogo, la produzione di dispositivi biosensoriali poco costosi, integrati e pronti all’uso è diventata relativamente facile da sviluppare grazie allo sviluppo della moderna industria elettronica. La capacità di rilevare agenti patogeni o di eseguire analisi genetiche negli ospedali è certamente migliorata da questi sensori biologici; ancora più importante, sono particolarmente utili per le piccole cliniche e anche per le analisi point-of-care.
Per i biosensori con applicazioni cliniche, sono state sviluppate una serie di nuove tecniche. I biosensori sono, in generale, dispositivi analitici costruiti con un elemento di riconoscimento biologico e un trasduttore ottico/elettronico. L’elemento biologico è responsabile della cattura degli analiti in soluzione e il trasduttore trasforma l’evento di legame in una variazione di segnale misurabile. In base alla natura del riconoscimento, i biosensori basati su enzimi, i biosensori immunologici e i biosensori a DNA potrebbero classificare il tipo di biosensori. Inoltre, sono disponibili biosensori elettronici (elettrici o elettrochimici), biosensori ottici (fluorescenti, risonanza plasmonica di superficie o Raman) e biosensori piezoelettrici (microbilancia a cristallo di quarzo) a seconda del tipo di trasduttore.
Biosensori elettrochimici
Per il rilevamento biologico, dove gli elettrodi funzionano sia come donatori di elettroni che come accettatori di elettroni, le tecniche elettrochimiche sono particolarmente utili. Vasti esperimenti elettrochimici hanno dimostrato che la teoria del trasferimento di elettroni di Marcus è conforme anche al trasferimento eterogeneo di elettroni tra elettrodi e molecole redox confinate in superficie, simile alle coppie donatore-accettore in soluzioni omogenee. Ciò significa che piccoli cambiamenti di distanza nelle molecole redox confinate in superficie possono causare ampie variazioni nei tassi eterogenei di trasferimento di elettroni che si suppone si traducano in cambiamenti rilevabili dei segnali elettrochimici. Hellinga e collaboratori, per esempio, hanno suggerito una strategia di rilevamento elettrochimico che sfrutta i movimenti di flessione delle cerniere mediati dai ligandi delle proteine. Un elettrodo d’oro è stato prima rivestito con un monostrato auto-assemblato (SAM), che fornisce una piattaforma versatile per l’immobilizzazione di proteine sito-specifiche. La proteina legante il maltosio (MBP) è stata poi legata alla superficie dell’elettrodo d’oro con un particolare orientamento come il gruppo reporter redox del rutenio (Ru(II)) è fissato ad un certo intervallo sopra l’elettrodo. Quando il ligando maltosio si lega al sito attivo, il reporter Ru(II) si allontana dall’elettrodo causando un movimento di flessione a cerniera di MBP (Figura 1).
Figura 1. Costruzione e funzionamento di un biosensore elettrochimico
Questo cambiamento di distanza indotto dal legame del maltosio causa una diminuzione dei segnali elettrochimici dipendente dalla concentrazione, fornendo così un modo per percepire elettronicamente il maltosio. È stato anche dimostrato l’uso di questo approccio di rilevamento altamente generalizzato per rilevare vari analiti con una famiglia di proteine o enzimi sottoposti a cambiamenti conformazionali indotti dal legame del ligando.
Biosensori enzimatici
I primi biosensori mai documentati furono quelli basati sulla glucosio ossidasi (GOD), stabiliti da Clark e Lyons nel 1962. L’iperglicemia, una concentrazione cronicamente elevata di glucosio nel sangue, è comune nel diabete mellito. Di conseguenza, il controllo regolare della loro concentrazione di glucosio nel sangue è essenziale per i pazienti diabetici. Il vantaggio dell’elettrochimica accoppiata con la catalisi enzimatica è questo biosensore, e le sue versioni più recenti. Un elettrodo immobilizzato con GOD era il biosensore di Clark. La forma ossidata di GOD interagisce con il glucosio in presenza di glucosio e produce acido gluconico e GOD ridotto, con due elettroni e due protoni coinvolti. Poiché l’ossigeno disciolto reagisce con il GOD ridotto, questa ossidazione del glucosio consuma anche l’ossigeno nella soluzione, producendo così perossido di idrogeno e GOD ossidato, e abbassando la pressione dell’ossigeno. Di conseguenza, rilevando elettrochimicamente l’ossigeno con un elettrodo di Clark per l’ossigeno, l’elettrodo può rilevare il glucosio. Questo tipo di sensore è considerato un biosensore di “prima generazione”. La Yellow Springs Instrument Company (Ohio, USA) ha commercializzato questo biosensore di prima generazione negli anni ’70.
Il biosensore di seconda generazione sostituisce il substrato naturalmente esistente, l’ossigeno, con piccole molecole redox artificiali che agiscono come mediatori redox e scambiano elettroni tra gli elettrodi e gli enzimi. Per migliorare l’efficienza del sensore, cioè la sensibilità e il rapporto segnale-rumore, sono state utilizzate diverse molecole redox solubili, come il ferrocene, la tionina, il blu di metilene, il metilvioletto. Questi mediatori sono stati inizialmente disciolti in una soluzione. Essi ottengono elettroni dagli elettrodi e poi, o viceversa, questi elettroni vengono trasferiti al centro redox degli enzimi. I mediatori immobilizzati sono stati suggeriti come un passo avanti, al fine di migliorare i biosensori senza reagenti. Per esempio, per il perossido di idrogeno, Ruan et al nel 1998 hanno documentato un sensore allo stato solido senza reagenti. Gli elettrodi d’oro sono stati prima modificati con L-cisteina, e poi multistrati di perossidasi di rafano (HRP) sono stati collegati da glutaraldeide al gruppo amminico della cisteina, e la tionina è stata ulteriormente legata all’enzima dallo stesso legame chimico. Come risultato, l’elettrodo d’oro era immobilizzato sia dall’enzima che dal mediatore, che poteva rilevare sensibilmente il perossido di idrogeno nella soluzione di prova senza ulteriore aggiunta di reagenti. Un vantaggio essenziale di questa configurazione del biosensore è che il mediatore è fissato sulla superficie dell’elettrodo, evitando così il problema della diffusione.
Una soluzione alternativa che includeva l’uso di polimeri redox è stata indicata da Heller e collaboratori. In primo luogo, hanno preparato un polimero legato con il complesso Os2+. Questo tipo di polimero funziona come un “filo molecolare” e scambia elettroni tra l’enzima e l’elettrodo. Il polimero Os e la glucosio ossidasi sono poi co-immobilizzati sull’elettrodo di carbonio, che genera una risposta sensibile alla presenza di glucosio. Sono stati in grado di rendere elettroattive quasi al 100% le molecole di enzima immobilizzate utilizzando questi polimeri redox, che hanno contribuito a un metodo di rilevamento del glucosio ad altissima sensibilità.
La commercializzazione del biosensore di seconda generazione basato sull’enzima ebbe un discreto successo. Nel 1987, MediSense è stata fondata e sono stati rilasciati i sensori di glucosio ExactechTM pensati. Questo successo ha portato ad una rivoluzione sanitaria per i pazienti diabetici. Invece di viaggiare verso gli ospedali, erano in grado di controllare la loro concentrazione di glucosio nel sangue a casa. I biosensori MediSense e successivamente i biosensori amperometrici consistono in elettrodi di carbonio serigrafati monouso rivestiti di GOD e mediatori (strisce reattive). Il sensore inizia a funzionare quando una goccia di sangue viene applicata alla striscia reattiva e registra la risposta amperometrica, che viene trasformata in una cifra visualizzata sul display LCD, indicante la concentrazione di glucosio.
Più recentemente, progettando un enzima GOD ricostruito, Xiao et al (2003) hanno pubblicato una nuova generazione di biosensori per il glucosio. Hanno preparato prima l’apo-GOD senza il cofattore di flavin adenina dinucleotide (FAD), poi hanno funzionalizzato e ricostruito una nanoparticella d’oro di 1,4-nm con FAD nell’apo-GOD. Usando un monostrato di ditiolo, tale enzima ricostruito è stato allineato con gli elettrodi d’oro (Figura 2). Hanno dimostrato che il turnover del trasferimento di elettroni di questo enzima artificiale è di 5000 s-1, circa 8 volte superiore a quello dell’enzima normale (700 s-1). La nanoparticella d’oro in questo sistema serve da relè di elettroni per il cablaggio elettrico del centro redox dell’enzima. In questo settore, il biosensore di glucosio stabilito da Xiao et al rappresenta un nuovo percorso, libero da qualsiasi mediatore e altamente sensibile. Più recentemente, utilizzando nanotubi di carbonio a parete singola (SWNT) al posto delle nanoparticelle d’oro, il gruppo di Willner ha documentato una versione modificata di questo sensore e ha realizzato un’efficienza altrettanto superiore. Anche se non c’è ancora una commercializzazione di questa tecnologia, ci si aspetta che i biosensori all’avanguardia vengano ulteriormente migliorati.
Figura 2 Costruzione e funzionamento del biosensore enzimatico a base di enzimi
Biosensore immunologico
Per identificare target ambientali o clinicamente importanti, i biosensori immunologici dipendono da un sistema immunologico altamente specifico, cioè anticorpi e antigeni. In realtà, i biosensori immunologici sono una variante moderna del saggio immunoassorbente legato all’enzima (ELISA), con costi inferiori, maggiore velocità e convenienza del servizio e sensibilità paragonabile o addirittura superiore.
Tra i più comuni ci sono biosensori immunologici elettrochimici. Sono disponibili due tipi di biosensori immunologici. In primo luogo, l’elettrodo viene immobilizzato con un anticorpo di cattura, che cattura un particolare antigene bersaglio. Attraverso un anticorpo secondario taggato con molecole redox o enzimi, si ottiene la trasduzione del segnale. In secondo luogo, viene immobilizzato un antigene sull’elettrodo, che rileva anticorpi specifici.
Ju e colleghi hanno istituito un biosensore immunologico amperometrico per l’antigene carcinoembrionale (CEA). Gli anticorpi CEA marcati con tionina e HRP sono stati co-immobilizzati su un elettrodo di carbonio vetroso collegato con glutaraldeide. Nella soluzione, che era accoppiata alla reazione dell’elettrodo di tionina, HRP riduceva cataliticamente il perossido di idrogeno, portando ad un segnale catalizzato. Il centro redox dell’HRP è stato parzialmente bloccato dalla cattura del CEA, portando all’attenuazione dei segnali amperometrici.
Rusling e colleghi hanno recentemente sfruttato gli SWNT per migliorare le prestazioni del biosensore immunologico (Figura 3).
Figura 3. Costruzione e funzionamento del biosensore immunologico
Usando l’auto-assemblaggio mediato dal metallo, hanno progettato degli array allineati verticalmente di SWNT (foresta di SWNT) su elettrodi di grafite pirolitica. Anti-HSA, usando EDC/NHS, è stato poi legato covalentemente alle estremità carbossilate della foresta di SWNT. L’elettrodo è stato ulteriormente incubato con un anticorpo secondario anti-HSA marcato con HRP dopo aver catturato il target HSA. Il target HSA nella soluzione di test può essere identificato in base al segnale catalitico dell’HRP per il perossido di idrogeno. La sensibilità di rilevamento, che era di circa 1 nM, è stata notevolmente migliorata dall’uso delle foreste di SWNT. Ciò era probabilmente dovuto alla migliore reattività del trasferimento di elettroni dell’HRP incapsulato nelle foreste di SWNT.
Uno degli strumenti clinici più rilevanti è stato il test immunologico. Tuttavia, i metodi di analisi esistenti, come ELISA, richiedono strumenti grandi e costosi e specialisti ben addestrati. Per lo sviluppo di dispositivi economici, miniaturizzati e compatti, i metodi elettrochimici sono ben adattati. Di conseguenza, lo sviluppo di biosensori immunologici elettrochimici per soddisfare l’analisi sul campo e al punto di cura è altamente auspicabile. È importante menzionare che l’uso di elettrodi serigrafati monouso potrebbe essere cruciale verso questo obiettivo, paragonabile ai biosensori di glucosio. Al fine di effettuare saggi ad alta produttività (HTS), è anche importante stabilire microarray di anticorpi basati sull’elettrochimica.
Biosensori del DNA
C’è stato un enorme interesse scientifico e tecnologico nell’identificazione degli eventi di ibridazione del DNA. L’interesse in rapida crescita nella diagnosi clinica basata su chip ha dimostrato particolarmente questa importanza. Pertanto, una varietà di tecniche, tra cui approcci ottici, acustici ed elettronici, sono stati sviluppati nel corso degli anni. Nei decenni passati, la rilevazione fluorescente ha dominato lo stato dell’arte dei genosensori tra di loro . Metodi elettrochimici, tuttavia, che si sono dimostrati efficaci in semplici specie chimiche, in particolare ioni metallici, hanno attirato un interesse sempre maggiore nelle applicazioni di rilevamento di specie biologicamente correlate.
I vantaggi della rilevazione elettronica includono: 1) la rilevazione elettrochimica è tipicamente poco costosa, consentendo così uno screening altamente sensibile e rapido; 2) diverse etichette elettroattive, ad es. metalloceni, sono stabili e insensibili all’ambiente, a differenza dei fluorofori che spesso hanno problemi di “photo-bleaching”; 3) la progettazione e la sintesi molecolare appropriate che generano una varietà di derivati, ciascuno con un potenziale redox specifico, hanno reso possibile l’etichettatura “multicolore”; 4) la rapida affermazione dell’industria del silicio ha aperto la strada alla produzione di massa di circuiti integrati, rendendo la rilevazione elettronica particolarmente appropriata e compatibile con le tecnologie basate sui microarray; 5) la crescita esponenziale della scienza e della tecnologia interfacciale ha svelato i misteri nel controllo preciso delle proprietà di superficie che sono uno degli ostacoli fondamentali nelle applicazioni bioelettroniche.
A tensioni applicate moderate, il DNA stesso è elettrochimicamente silenzioso, mentre interferenze significative sono previste ad alte tensioni che causano l’ossidazione/riduzione delle basi del DNA. Millan è stato il primo a suggerire rilevamenti selettivi della sequenza del bersaglio del DNA basati su indicatori di ibridazione elettroattivi che forniscono segnali elettronici e discriminazione del DNA a doppio e singolo filamento. Le rilevazioni di tipo “sandwich” sono state suggerite nel tentativo di ridurre l’elevato background derivato dal minore legame degli indicatori di ibridazione al ssDNA. Un filamento di DNA che possiede un’etichetta elettroattiva è stato introdotto per agire come molecola di segnalazione in aggiunta a una sonda di DNA immobilizzata. Allo stesso modo, con sonde nanoparticelle, Park e colleghi nel 2002 hanno sviluppato una rilevazione elettrica del DNA basata su array che dimostra alta sensibilità e selettività. Una tecnologia basata sull’attività di ossidazione relativamente alta della guanina e la sua cooperazione con catalizzatori redox esogeni è stata sviluppata da Thorp un anno dopo. La discriminazione di ds/ss è ottenuta dal fatto che la guanina ha una reattività di trasferimento di elettroni relativamente bassa nei duplex, a causa dell’effetto sterico. Nel rilevamento dei prodotti PCR, questo metodo è altamente sensibile, ma relativamente povero nel discriminare gli eventi di ibridazione. Inoltre, questo metodo è finora possibile solo su superfici ITO, perché l’alto potenziale di ossidazione esclude ancora l’uso dell’oro.
Nonostante i progressi, lo sviluppo di un sensore all-in-one (cioè senza reagenti) che segnala specificamente la cattura del bersaglio è ancora molto importante (cioè, evitando un ulteriore trattamento con molecole di segnale o indicatori di ibridazione). Un mezzo praticabile a questo scopo è fornito da aptameri di DNA o RNA. Gli aptameri sono DNA o RNA ben strutturati che hanno un’alta affinità e selettività per particolari target così come per gli enzimi naturali, mostrando così una robustezza superiore agli enzimi fragili. Sono stati uno strumento molto promettente per la terapia e la diagnosi. Fino ad allora, per qualsiasi bersaglio, la selezione in vitro ben sviluppata era in grado di produrre aptameri. Alla luce di questi vantaggi, si prevede che gli aptameri oligonucleotidici saranno i componenti di biosensing della prossima generazione. Una semplice forcina organizzata di DNA con un’etichetta elettroattiva (forcina elettronica di DNA) è stata usata da Fan e colleghi come blocco di costruzione per definire gli eventi di ibridazione (Figura 4).
Figura 4. Costruzione e funzionamento del biosensore del DNA
Il DNA hairpin-like era un aptamero incredibilmente affascinante che forma la base del riconoscimento di ibridazione omogenea di “fari molecolari” fluorescenti. La sequenza di DNA è stata progettata in modo che in assenza di bersagli, questo “segnalatore” è nello stato vicino mentre sarà “acceso” quando lega il suo particolare bersaglio genico. La presenza del disegno dello stem-loop nella struttura offre un interruttore on/off così come una stringenza per differenziare i singoli mismatch di ibridazione del DNA. Un terminale tiolato dà un’estremità appiccicosa alla superficie d’oro di questa forcina elettronica del DNA, mentre un tag di ferrocene trasduce i segnali elettronici all’altra estremità. La forcina iniziale localizza il ferrocene prossimalmente alla superficie dell’elettrodo, permettendo così il trasferimento interfacciale di elettroni. Dopo l’ibridazione, la formazione della struttura duplex lineare interrompe la forcina e allontana il ferrocene dall’elettrodo. Questo significativo cambiamento di distanza (fino a pochi nm) ha effettivamente bloccato il trasferimento di elettroni interfacciale e porta alla diminuzione dei corrispondenti segnali di corrente elettrochimica. Questa strategia offre l’opportunità di identificare obiettivi di DNA di 10 pM. Ancora più importante, un tale disegno trae vantaggio dall’integrazione all’interno di una singola struttura a forcina confinata in superficie della parte di cattura (sequenza della sonda) e della parte di segnalazione (specie elettroattive). In contrasto con la maggior parte dei sensori di DNA a stato solido proposti in precedenza, questo design è quindi effettivamente senza reagenti, cioè nessun reagente esogeno è richiesto durante il processo di riconoscimento a parte i bersagli di DNA. Questo fornisce la base per lo sviluppo di un analizzatore di DNA portatile e continuo che può essere utile per applicazioni mediche e militari.
Un mezzo per il trasferimento di elettroni a lungo raggio (ET) attraverso il suo impilamento di basi è stato suggerito come la doppia elica del DNA. Anche se questo problema è stato discusso per molto tempo, Barton e colleghi hanno dimostrato elettrochimicamente che i film di DNA con elettrodi d’oro ben orientati permettono il trasferimento di elettroni a lungo raggio e che tale ET è altamente sensibile alle pertubazioni di impilamento delle basi come i mismatch. Hanno scoperto che gli intercalanti elettroattivi come il blu di metilene (MB) potrebbero essere efficacemente ridotti da un elettrodo modificato da un duplex di DNA completamente abbinato. L’esistenza di un solo mismatch, tuttavia, converte il mezzo ET filiforme in un isolante, interrompendo totalmente l’ET tra il MB e l’elettrodo. Attraverso saggi ciclici voltammetrici o coulometrici, che costituiscono la base di un rapido sensore di screening delle mutazioni del DNA, tale differenza può essere facilmente letta. Barton e colleghi hanno anche dimostrato che l’elettrocatalisi potrebbe migliorare la sensibilità di questa strategia. In soluzione, l’aggiunta di ferricianuro tira costantemente elettroni dal MB ridotto elettrochimicamente, amplificando il flusso di elettroni attraverso la doppia elica del DNA. Questo aiuta a rilevare ~108 molecole di DNA con un elettrodo da 30 μm. Hanno anche sviluppato sensori basati sul DNA per rilevare proteine legate al DNA in parallelo alla rilevazione del DNA. Si ritiene che alcune proteine o enzimi legati al DNA interagiscano con l’impilamento delle coppie di basi del DNA, trasformando la doppia elica del DNA da efficaci fili ET a isolanti. Hanno stabilito un modo sensibile per testare elettricamente una varietà di proteine legate al DNA basate sulla strategia di rilevamento comparabile. Crucialmente, questi sensori discriminano con successo le proteine che si legano al DNA, ma non interrompono l’impilamento delle basi. Questo conferma certamente che il cut-off del segnale sul legame delle proteine è dovuto all’alterazione del mezzo ET rilevante per l’impilamento delle basi.
Il futuro dei biosensori clinici
Nonostante il rapido miglioramento nello sviluppo dei biosensori, le applicazioni cliniche dei biosensori sono ancora poco comuni, con l’eccezione del monitor del glucosio. Questo è in diretto contrasto con il bisogno critico di test point-of-care nelle piccole cliniche. Assumiamo che le specifiche seguenti siano rilevanti. In primo luogo, alta sensibilità: Il miglioramento della sensibilità è una priorità costante nello sviluppo dei biosensori. È chiaro che il criterio della sensibilità varia da caso a caso. Per esempio, poiché i livelli di glucosio sono alti nel sangue, non è necessaria una sensibilità molto alta per la rilevazione del glucosio. Questo è fondamentalmente parte della ragione per cui i monitor di glucosio hanno avuto successo. Tuttavia, in molte situazioni, per soddisfare i requisiti della diagnostica molecolare e del rilevamento di agenti patogeni, è molto importante stabilire biosensori altamente sensibili con un rilevamento ottimale delle singole molecole. In secondo luogo, alta selettività: Nell’applicazione dei biosensori, questo può essere un ostacolo significativo. La maggior parte dei biosensori citati in letteratura funzionano molto bene in laboratorio, ma in campioni di prova reali, si possono affrontare problemi di serie. Di conseguenza, per prevenire l’adsorbimento non specifico della superficie, è importante stabilire nuovi approcci alla modifica della superficie. In terzo luogo, il multiplexing è cruciale per risparmiare tempo di analisi, che è particolarmente importante per le analisi di laboratorio o cliniche. È quindi importante stabilire array di elettrodi ad alta densità così come strumenti elettrochimici che possono condurre un gran numero di saggi simultaneamente. Quarto, per aumentare la portabilità, è essenziale creare biosensori miniaturizzati, soddisfacendo così le esigenze di test sul campo e al punto di cura. Quinto, è opportuno integrare e automatizzare altamente un biosensore ideale. Una soluzione a questo obiettivo è offerta dalle attuali tecnologie lab-on-a-chip (microfluidica). Possiamo aspettarci che tutte queste caratteristiche siano integrate in futuro in biosensori di successo e che possano facilmente rilevare bersagli minuscoli in un breve periodo di tempo.
Schemi per i biochip: Progettazione e funzionamento
Il termine “biochip” ha assunto diversi significati. Qualsiasi dispositivo o componente che introduce materiali biologici, sia estratti da specie biologiche che sintetizzati in laboratorio su un substrato solido, può essere considerato un biochip nel senso più generico. In termini pratici, tuttavia, sia le miniaturizzazioni, di solito in formato microarray, sia la possibilità di una produzione di massa a basso costo sono spesso coinvolti nei biochip. Il naso elettronico o il chip naso artificiale, la lingua elettronica, il chip di reazione a catena della polimerasi, il chip microarray del DNA (chip genico), il chip proteico e il lab-on-a-chip biochimico sono alcuni esempi che soddisfano queste qualifiche. Nel chip genico e nel chip proteico è stata fatta la ricerca più dinamica sui biochip.
Molta attenzione è stata dedicata, in particolare, ai biochip che integrano la biotecnologia convenzionale con l’elaborazione dei semiconduttori, i sistemi micro-elettromeccanici (MEMS), l’optoelettronica e l’acquisizione ed elaborazione digitale di segnali e immagini.
Migliaia di geni e i loro derivati (cioè RNA e proteine) in un dato organismo vivente sono generalmente assunti per agire in un modo complicato e coordinato che crea il mistero della vita. I metodi tradizionali in biologia molecolare, tuttavia, operano tipicamente sulla base di “un gene in un esperimento”, il che presuppone che il potenziale è molto limitato ed è difficile ottenere il “quadro completo” della funzione genica. Una nuova tecnologia, chiamata microarray di DNA, ha guadagnato una notevole attenzione tra i biologi negli ultimi decenni. Questa tecnologia mira a misurare l’intero genoma su un singolo chip in modo che, nel frattempo, i ricercatori possano ottenere un quadro migliore delle interazioni tra migliaia di geni.
Un gene o un DNA chip corrisponde a una matrice bidimensionale di piccole celle di reazione (100 x 100 μm ciascuna) prodotte utilizzando la robotica ad alta velocità su un substrato solido. Un wafer di silicio, un sottile foglio di vetro, plastica o una membrana di nylon potrebbero essere il substrato solido. Trilioni di molecole polimeriche di una particolare sequenza di frammenti di DNA a singolo filamento sono immobilizzati in ogni cella di reazione (Figura 5).
Figura 5. Illustrazione schematica di un chip genico
I frammenti di DNA possono essere sequenze di base brevi (da 20 a 25) (A, T, G e C) o filamenti di DNA complementari più lunghi (cDNA). In ogni cella, la sequenza univoca di basi (ad esempio CTATGC…) è preselezionata o configurata a seconda dell’uso previsto. Le sonde sono anche chiamate sequenze riconosciute di frammenti di DNA a singolo filamento immobilizzati sul substrato. I frammenti di DNA a doppio filamento si formano quando frammenti sconosciuti di campioni di DNA a singolo filamento, chiamati bersaglio, reagiscono (o ibridano) con le sonde sul chip, dove il bersaglio e la sonda sono complementari secondo la regola di accoppiamento di base (A accoppiato con T e G accoppiato con C). I campioni bersaglio sono spesso etichettati con tag, come fluorescenti, coloranti o molecole di radio-isotopo, per facilitare la diagnosi o l’analisi del chip ibridato. Ognuno è etichettato con il proprio tag distinguibile quando le destinazioni contengono più di un tipo di campione. Questo tipo di chip microarray di DNA fornisce una piattaforma in cui, in base alle dimensioni dell’array, il bersaglio o gli obiettivi sconosciuti possono teoricamente essere definiti con altissima velocità e alta produttività abbinando i componenti coinvolti nella ricerca e nello sviluppo della tecnologia biochip con decine di migliaia di diversi tipi di sonde attraverso l’ibridazione in parallelo, e le relative discipline tecniche sono indicate nella Figura 6. Fondamentalmente, la tecnologia dei biochip è interdisciplinare; è importante che scienziati e ingegneri di diverse discipline collaborino sinergisticamente per spingere questa nuova tecnologia da un interesse di laboratorio a dispositivi e sistemi pratici.
Figura 6. I componenti e le discipline tecniche associate coinvolte nella R&D della tecnologia biochip
Microarray di DNA
Per quanto riguarda la proprietà della sequenza di DNA ad identità nota posta sulla matrice, ci sono due varianti della tecnologia del microarray di DNA:
Tipo I: la sonda cDNA (lunga 500~5.000 basi) viene immobilizzata utilizzando spotting robotizzato su una superficie solida come il vetro ed esposta separatamente o in miscela a una serie di bersagli. Questa strategia, “tradizionalmente” chiamata microarray di DNA, è in gran parte nota per essere stata sviluppata alla Stanford University.
Tipo II: in situ (on-chip) o tramite sintesi convenzionale accompagnata da immobilizzazione on-chip, viene sintetizzato un array di sonde di oligonucleotidi (20~80-mer) o di acido nucleico peptidico (PNA). L’array viene esposto al DNA campione ibridato ed etichettato e determina l’identità/abbondanza delle sequenze complementari. Questo metodo, “storicamente” chiamato DNA chips, è stato stabilito da Affymetrix INC, che vende i suoi prodotti fabbricati fotolitograficamente con il marchio Genechip. I chip a base di oligonucleotidi sono sviluppati da diverse aziende che utilizzano tecnologie alternative di sintesi in situ o di deposizione.
A seconda del tipo di molecola immobilizzata, i biochip sono realizzati principalmente in due formati. Gli array di CDNA sono anche chiamati biochip che contengono prodotti PCR di 200 paia di basi fino a 2KB di dimensione immobilizzati lungo la lunghezza della molecola tramite un legame incrociato covalente alla superficie dell’array. In alternativa, le sonde oligonucleotidiche possono essere sintetizzate in situ sull’array, oppure i legami covalenti ai termini possono essere fissati da oligo pre-sintetizzati. L’ingegneria dei genechip comprende diverse parti, come la fabbricazione, la preparazione del campione e l’ibridazione della sequenza bersaglio, la rilevazione dei risultati dell’ibridazione, la progettazione della sonda oligonucleotidica e l’analisi dell’immagine dell’ibridazione, e varie applicazioni, come si vede nella Figura 7.
Figura 7. Diversi aspetti importanti legati alla tecnologia Genechip
In primo luogo, secondo un obiettivo particolare, molte sequenze di geni rilevanti saranno selezionate dal database del DNA (polimorfismo nucleico singolo per un gene specifico, espressione differenziale per un dato gruppo di geni o identificazione delle mutazioni). Determinando la sequenza e la lunghezza di ogni sonda e la sua esatta posizione sul chip, una serie di sonde oligonucleotidiche uniche sarà progettata sulla base delle sequenze selezionate. Con il metodo spotting o la sintesi on-chip, si può effettuare la sintesi del microarray di DNA. I geni target sono solitamente necessari per la fluorescenza per essere amplificati ed etichettati. Nella maggior parte dei casi sarà necessario selezionare i primer di PCR appropriati e ottimizzare le condizioni di amplificazione e ibridazione. Per i risultati dell’ibridazione su un genechip, ci sono diverse strategie di rilevamento. Un approccio tradizionale è la rilevazione a fluorescenza. Per il trattamento di una così grande quantità ottenuta da un genechip, è necessaria un’analisi dei dati basata sulle immagini fluorescenti e sulla configurazione del database. L’uso di prodotti PCR corrispondenti ai geni come molecole sonda è una piattaforma comune per la preparazione di microarray. Le fonti biologiche di librerie di cDNA offrono un modello efficace per l’amplificazione PCR delle sonde. Questa piattaforma è quindi denominata cDNA Arrays.
L’uso di sonde oligonucleotidiche invece di prodotti di PCR ha diversi vantaggi. In primo luogo, sono tipicamente di lunghezza simile e possono essere creati in modo tale da avere simili proprietà di ibridazione. In secondo luogo, possono essere configurati per ibridarsi contro la regione specifica del gene; il prodotto di PCR permette anche l’ibridazione incrociata tra geni omologhi che disturbano i profili di espressione genica di membri della stessa famiglia genica. Inoltre, la necessità di una noiosa amplificazione PCR delle molecole della sonda viene eliminata dagli array di oligonucleotidi e diminuisce il rischio di errore dovuto alla manipolazione del clone e alla contaminazione durante il trasferimento.
Chip microfluidico
Negli ultimi decenni, la tecnologia microfluidica si è sviluppata rapidamente e fornisce molteplici applicazioni nelle scienze della vita. Grazie ai vantaggi distinti forniti dalla miniaturizzazione del sistema, è nata la rivoluzione della microfluidica, tra cui l’alta efficienza analitica, l’aumento della sensibilità, il miglioramento delle prestazioni analitiche, la rapida parallelizzazione del multiplexing, la capacità di gestire ed elaborare volumi di reagenti ridotti e l’impronta strumentale drammaticamente ridotta.
La microfluidica potrebbe offrire simultaneamente efficienza analitica e alta capacità di throughput come tecnologia di miniaturizzazione, senza la mancanza di precisione e automazione. La tecnologia microfluidica non è solo un potente strumento per lo screening veloce e lo studio dello sviluppo di farmaci durante il processo di applicazione del farmaco, ma anche per i suoi dispositivi miniaturizzati per abbassare i costi e il consumo di reagenti.
Negli ultimi anni sono stati fatti progressi significativi nello sviluppo di componenti e sistemi di screening dei farmaci basati sulla microfluidica. Per lo screening dei farmaci, vengono utilizzati diversi tipi di chip microfluidici per migliorare l’efficienza dello screening e diminuire i costi. Diversi tipi comuni di tecnologia chip sono descritti nei paragrafi seguenti.
Figure 8. Applicazione di chip microfluidico nello screening farmacologico.
Microfluidica a goccia – Per eseguire esperimenti in flusso continuo o segmentato, la tecnologia microfluidica a goccia utilizza goccioline liquide compartimentate da un fluido immiscibile come vasi di reazione separati da nanolitri a picolitri. Tali metodi mostrano vantaggi significativi, come l’uso ridotto del campione, una migliore velocità di reazione e una maggiore efficienza e riproducibilità, gestendo volumi incredibilmente piccoli con un robusto controllo della composizione.
Sulla base del processo sequenziale tecnica droplet array, metodi microfluidici goccia può essere utilizzato per lo screening combinazione di farmaci (Figura 8A), per lo screening di varie combinazioni di dosaggio e lunghezze di somministrazione, e per perfezionare il regime ottimale di dosaggio minimamente consumato che è importante per situazioni di malattia combinata.
Organo su chip – La regolazione dettagliata della struttura e del flusso su microscala permette di costruire una modellazione precisa delle strutture su microscala dei tessuti degli organi. Gli organi su chip sono sistemi biomimetici che sono micro-ingegnerizzati e rappresentano unità funzionali essenziali degli organi umani viventi. Le funzioni di più organi e tessuti, come il fegato, i reni, i polmoni e l’intestino, sono stati replicati come modelli in vitro fino ad oggi. Questi sistemi potrebbero essere utilizzati come modelli in vitro che permettono di simulare e modulare farmacologicamente processi biologici complessi.
Il chip d’organo simula i processi di base del corpo umano, utilizzando un certo numero di cellule per creare un chip biomimetico con funzioni fisiologiche simili sulla struttura unica del chip, che è paragonabile all’ambiente esterno reale della malattia rispetto al tipico modello di coltura monocellulare.
Al fine di replicare la complessa microarchitettura del tessuto canceroso, un microsistema che permette la co-cultura di sferoidi di tumore al seno con le cellule vicine in un sistema microfluidico 3D compartimentato è stato stabilito per contribuire a creare la piattaforma di screening di farmaci contro il cancro al seno (Figura 8B). Per lo studio della migrazione delle cellule tumorali e lo screening di farmaci anticancro, co-cultura di più tessuti con un sistema microfluidico potrebbe essere utilizzato.
Altri chip microfluidici per lo screening farmacologico – Ci sono diverse altre tecnologie applicate ai chip microfluidici per lo screening dei farmaci, oltre ai suddetti metodi esistenti, che estendono le idee dei ricercatori. L’aspetto più significativo e integrato dello sviluppo dei farmaci nella maggior parte delle industrie farmaceutiche e diverse biotecnologie in tutto il mondo è stato un sistema HTDS eccezionale.
Con l’uso di sistemi microfluidici di array di tessuti ad accesso aperto e di chip di microarray di cellule, è possibile effettuare lo screening di varie concentrazioni e combinazioni di farmaci. Varie configurazioni e array di piccole camere di coltura possono essere generate dal diverso design del chip. I generatori di gradiente di concentrazione possono fornire un efficace gradiente di concentrazione liquida, e questi dispositivi sono stati implementati e combinati con tecnologie microfluidiche da diversi gruppi di ricerca per ottimizzare i sistemi HTDS. I miscelatori microfluidici diffusivi in Figura 8C potrebbe anche riconoscere un HTDS completamente automatico.
Le piattaforme di array di cellule sono costruite utilizzando materiale polidimetilsilossano (PDMS) in alcuni canali microfluidici per lo screening dei farmaci. La struttura dei chip, però, è difficile e ha alcuni svantaggi, come i costosi stampi di silicio e l’assorbimento biomolecolare. Come matrice extracellulare naturale (ECM), l’idrogel diacrilato di poli (etilenglicole) (PEGDA) ha proprietà meccaniche e contenuto d’acqua identici. Gli idrogeli microfluidici PEGDA sono stati comunemente usati per l’incapsulamento delle cellule e sono permeabili a composti come acqua, biomolecole e sostanze chimiche. Al fine di ricercare l’effetto di trattamento combinatorio di due farmaci, sono stati utilizzati dispositivi microfluidici fatti di questi tipi di materiali e combinati con tecnologie di coltura di cellule cerebrali 3D (Figura 8D).
Il fascino del chip microfluidico è che per svolgere varie funzioni, può avere più strutture progettate e può essere combinato per estendere la sua gamma di applicazioni con diversi dispositivi e apparecchiature di test. Tuttavia, sono necessari notevoli sforzi di progettazione, produzione e ottimizzazione. Ogni modello ha caratteristiche uniche. Viene utilizzato non solo per lo screening farmacologico, ma anche per il test farmacologico.
Microarray proteico
Nella ricerca sulle proteine, i microarray proteici sono strumenti utili in modo imparziale e ad alto rendimento, poiché permettono di caratterizzare in parallelo fino a migliaia di proteine purificate individualmente. L’adattabilità di questa tecnologia ha reso possibile il suo utilizzo in una vasta gamma di applicazioni, tra cui lo studio delle interazioni molecolari a livello di proteoma, l’analisi delle alterazioni post-traslazionali, la scoperta di nuovi bersagli farmacologici e la valutazione delle interazioni patogeno-ospite. Inoltre, la tecnologia ha già dimostrato di essere efficace nel profilare la specificità degli anticorpi, così come nell’identificare nuovi biomarcatori per le malattie autoimmuni e i tumori in particolare.
Le proteine sono biomolecole complesse con un ampio spettro di strutture e funzioni, e come tali, studiarle in modo avanzato è una sfida. Esistono tre tipi principali di microarray di proteine: funzionali, analitici e a fase inversa. I microarray di proteine funzionali sono assemblati in modo high-through-put con proteine purificate/sintetizzate, permettendo a centinaia e persino migliaia di proteine diverse di essere esaminate in parallelo con le loro proprietà biochimiche. Per rilevare o misurare campioni biologici complessi, i microarray proteici analitici utilizzano reagenti di affinità immobilizzati sull’array. Infine, i campioni biologici complessi immobilizzati sull’array sono utilizzati dai microarray proteici in fase inversa che utilizzano reagenti di affinità per l’identificazione.
I microarray di proteine funzionali sono più capaci di identificare le interazioni deboli, più flessibili per le proteine a bassa abbondanza, e più capaci di analizzare campioni grezzi come il siero, rispetto ad altri metodi, come la spettrometria di massa. In termini di differenze nella copertura del proteoma, nelle lunghezze delle proteine e nelle pipeline di produzione, ad oggi sono stati prodotti diversi tipi di microarray di proteine funzionali.
Sviluppo del Microarray proteico funzionale – L’insieme delle proteine che possono essere espresse da un genoma è il proteoma. Tipicamente, la creazione di un microarray di proteoma purificato richiede l’assemblaggio di un insieme di cornici di lettura aperte (ORF) a livello genomico clonate in un vettore di espressione, l’espressione della proteina codificata nelle cellule, la purificazione della proteina individuale ad alta produttività e l’immobilizzazione della proteina su un microarray.
Applicazione di Microarray di Proteoma di Lievito Sviluppo del microarray proteico funzionale – L’insieme delle proteine che possono essere espresse da un genoma è il proteoma. Tipicamente, la creazione di un microarray di proteoma purificato richiede l’assemblaggio di un insieme di cornici di lettura aperte (ORF) a livello genomico clonate in un vettore di espressione, l’espressione della proteina codificata nelle cellule, la purificazione della proteina individuale ad alta produttività e l’immobilizzazione della proteina su un microarray.
Applicazione dei microarray del proteoma del lievito – Per il profiling delle interazioni molecolari a livello del proteoma, i microarray delle proteine funzionali, specialmente i microarray del proteoma purificato, sono utili e permettono uno screening dettagliato e imparziale. I ricercatori hanno usato microarray di proteine funzionali nella ricerca fondamentale per studiare le interazioni proteina-proteina, le interazioni proteina-lipide, le interazioni proteina-DNA, proteina-cellula/lisati, legame di piccole molecole, interazioni proteina-RNA, e PTMs, come acetilazione, SUMOilazione, glicosilazione, ubiquitinazione, fosforilazione e metilazione (Figura 9A-9G). Riassumiamo gli studi rappresentativi nella Tabella I sulla base delle applicazioni di ricerca visto in Figura 9.
Figura 9. Applicazione di Microarray proteico funzionale
Applicazioni dei biochip
La maggior parte delle applicazioni emergenti dei biochip sono incluse nella tabella 1.
| Biochip nel cibo | Biochip che rileva organismi geneticamente modificati (ogm) negli alimenti. |
| Biochip nella diagnostica | Biochip di DNA che rivoluziona il modo in cui la professione medica esegue test sul sangue. |
| Biochip nell’epidemia della Tubercolosi | La tecnologia biochip dovrebbe aiutare a combattere la nuova varietà di ceppi resistenti ai farmaci della malattia. |
| Biochip nel cancro | La tecnologia dei chip Biosensor fornisce un accesso rapido e semplice alle informazioni critiche relative ai danni al DNA causati dai composti che producono cancro e aiuta nella diagnosi precoce del cancro del colon. |
| Biochip nello sviluppo di farmaci | Chip di DNA che trovano differenze genetiche tra le persone che rispondono a un farmaco e coloro che non lo fanno, a partire dalla fase II, o da studi clinici a metà stadio. |
Test: LO3 Livello basale
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Biosensori & Biochip per un Futuro Sostenibile
Livello avanzato
Il campo della biologia sintetica è esploso nell’ultimo decennio, avendo una grande influenza su campi come l’ingegneria metabolica, l’ingegneria delle proteine, la biologia digitale e l’ingegneria dell’intero genoma.
Sommario
Tecnologie dei Biosensori e Biochip: Contributo alla Vita Sostenibile del Futuro
Il campo della biologia sintetica è esploso nell’ultimo decennio, avendo una grande influenza su campi come l’ingegneria metabolica, l’ingegneria delle proteine, la biologia digitale e l’ingegneria dell’intero genoma. Nel quadro di cicli di sviluppo iterativi “design-build-test”, una parte significativa dell’innovazione della biologia sintetica ha avuto luogo. Nel campo della biologia sintetica, il progresso può essere associato a innovazioni in ciascuno dei processi di “progettazione”, “costruzione” e “test”. Per esempio, c’è stata una grande spinta a standardizzare gli elementi all’interno della biologia sintetica, con un’attenzione significativa alla modularità e ai componenti “plug and play”. Questa modularizzazione, insieme al progresso accelerato nella biologia dei sistemi, ha permesso alla fase di “progettazione” di diventare meno lunga e meno dipendente dalla conoscenza avanzata. Negli ultimi anni, il costo del sequenziamento e della sintesi del DNA è anche diminuito drasticamente, permettendo di sintetizzare grandi costrutti a basso costo. Nella fase di “costruzione”, questo ha facilitato un rapido miglioramento, aiutando i ricercatori a indagare una percentuale maggiore dello spazio della soluzione biologica. Infine, all’interno della fase di “test” della biologia sintetica, anche lo screening high-throughput è diventato un punto focale. L’aumento del potenziale di “progettazione” e “costruzione” ha contribuito a una maggiore richiesta di successo nella valutazione della pletora di nuovi progetti. A sua volta, questo è stato fatto incorporando robot e analisi high-throughput nell’ambiente di laboratorio, in cui i nuovi modelli possono essere valutati a un livello che non è raggiungibile per i ricercatori umani.
I biosensori rappresentano una tecnologia emergente innovativa per lo screening ad alta produttività che può essere implementata. Più precisamente, sono classificati come uno strumento analitico costituito da componenti biologici utilizzati per rilevare e generare un segnale per la presenza di un ligando target. La biologia sintetica è all’avanguardia dei biosensori, sia come strumento per lo screening ad alta produttività, ma anche come risultato diretto degli sviluppi nel campo della biologia sintetica stessa. Inoltre, a causa dell’impareggiabile specificità e sensibilità che le parti biologiche forniscono rispetto ai metodi analitici convenzionali, i biosensori hanno guadagnato un interesse crescente come alternativa all’analisi tradizionale.
La progettazione e la costruzione di biosensori è uno sforzo multidisciplinare e può includere competenze in settori quali l’ingegneria delle proteine, la biologia molecolare, la chimica di affinità, la dinamica molecolare dell’acido nucleico, le scienze dei materiali e la nanotecnologia. I biosensori si interfacciano con un ligando bersaglio nel loro stadio più semplice, subiscono qualche tipo di modifica e emettono un segnale. C’è una grande varietà di potenziali configurazioni in tutte le parti di questo processo. I ligandi bersaglio vanno da singoli atomi come il calcio, a intere proteine come la trombina, fino a tutto il resto. Processi diversi come l’attività enzimatica, la fluorescenza, la generazione di corrente elettrica e l’attività trascrizionale includono segnali in uscita. I meccanismi che traducono il riconoscimento dei ligandi in segnali funzionali sono altrettanto diversi.
Nel campo dell’analitica, i biosensori rappresentano un significativo passo avanti. Per allontanare l’analitica da quadri puramente fisici o chimici, è iniziata l’integrazione di componenti biologici nella diagnostica sensoriale. Questo ha permesso di condurre funzioni analitiche che non si adattano bene ai metodi convenzionali, con una grande diversità e specificità di componenti biologici. Le applicazioni teoriche e dimostrate dei biosensori coprono una gamma significativa della società e dell’attività umana. Le applicazioni dei biosensori sono raggruppate in tre grandi categorie, a seconda della loro scala di misurazione.
- Diagnostica di gruppo: applicazioni ambientali, agricole e industriali
- Diagnostica del punto di utilizzo: applicazioni mediche e di sicurezza
- Diagnostica a singola cellula: ingegneria metabolica e applicazioni di biologia sintetica
Biosensori & biochip: progressi nella diagnostica medica
I biosensori consistono in un biocatalizzatore che può riconoscere un elemento biologico e un trasduttore che può trasformare l’occorrenza della combinazione biocatalizzatore ed elemento biologico in un parametro misurabile.
Il biocatalizzatore può essere costituito da biomolecole come enzimi, DNA, RNA, metaboliti, cellule, oligonucleotidi, ecc. e trasduttori elettrochimici, calorimetrici, ottici, acustici, piezoelettrici, ecc. I biosensori che utilizzano cellule immobilizzate, enzimi e acidi nucleici sono entrati in campo negli ultimi anni nella diagnostica delle malattie. Per l’ingegneria dei biosensori diagnostici delle malattie, sono stati applicati anche i nanobiosensori che utilizzano le dimensioni ultra-piccole e le proprietà uniche. L’uso di biosensori può determinare rapidamente lo stato di salute, l’inizio e la progressione della malattia e, con l’assistenza di una combinazione multidisciplinare di chimica, scienza medica e nanotecnologia, può aiutare a preparare il trattamento per molte malattie. I dispositivi sono convenienti, altamente reattivi, veloci, facili da usare e possono essere prodotti in massa per l’uso umano. Numerosi biosensori per la diagnosi di tre grandi malattie, come il diabete, le malattie cardiovascolari e il cancro, sono i più sviluppati.
Tali biosensori, coniati da Cammann, sono strumenti analitici che trasformano un segnale elettrico in una risposta biologica. I biosensori di solito possono essere altamente precisi e dovrebbero essere riciclabili e indipendenti da limitazioni fisiche come il pH, la temperatura. L’approccio pratico alla progettazione di un biosensore richiede la fabbricazione, l’immobilizzazione, i dispositivi di trasduzione che offrono un’ingegneria di ricerca multidisciplinare sia in chimica che in biologia.
In base al loro meccanismo di funzionamento, i biosensori diagnostici sono divisi in quattro gruppi principali:
- Biosensori biocatalitici a base enzimatica.
- Gruppo di bioaffinità, cioè presenza di anticorpi, antigeni e acido nucleico.
- Microbi, cioè biosensori contenenti microrganismi.
- Nanosensori, cioè sensori di nanoparticelle attivi che in genere aumentano la sensibilità e la specificità per il rilevamento precoce delle malattie.
Questi vari tipi di biosensori aiutano a identificare con notevole specificità i livelli di ormoni, farmaci, tossine, contaminanti, metalli pesanti, pesticidi, ecc.
I biosensori sono strumenti che comunemente stimano i livelli di marcatori biologici o qualsiasi reazione chimica creando segnali che sono principalmente associati alla concentrazione di un analita nella reazione chimica. Tipicamente, tali biosensori aiutano a monitorare le malattie, la scoperta di farmaci, il rilevamento di sostanze inquinanti, il rilevamento di malattie che causano batteri e i marcatori che solitamente indicano condizioni di malattia, come i fluidi corporei (saliva, sangue, urina, sudore, ecc.). Un tipico biosensore è mostrato nella Figura 1.
Figura 1. Rappresentazione schematica di un biosensore
Un tipico biosensore è composto da:
- Analita: Una sostanza di interesse, come il glucosio per il diabete, che deve essere stabilita.
- Biorecettore: Un biorecettore per gli enzimi può essere una molecola che riconosce l’analita.
- Trasduttore: Normalmente, un evento di riconoscimento biologico viene convertito in un segnale rilevabile, noto come segnalazione.
- Elettronica: In forma di display, tipicamente elabora il segnale trasdotto.
- Display: Tipicamente, il display a cristalli liquidi risulta in modo user-friendly in combinazione con hardware e software per la generazione di biosensori.
Ci sono diverse applicazioni di biosensori che sono state introdotte in diversi settori, come la scienza medica, il settore marino, l’industria alimentare, ecc, e questi biosensori sono spesso programmati per una migliore sensibilità e linearità rispetto ai metodi convenzionali. Tuttavia, l’applicazione dei biosensori sta crescendo sempre più nel campo della scienza medica.
Biosensori per glucosio il controllo del diabete
Il monitoraggio del glucosio nel sangue è diventato uno strumento prezioso nella gestione del diabete e i livelli giornalieri di glucosio nel sangue sono tipicamente mantenuti da medici consulenti che hanno sviluppato una serie di sensori di glucosio nel sangue. Il diabete mellito è il più grande disturbo endocrino prevalente del metabolismo dei carboidrati con più morbilità e mortalità nei paesi in via di sviluppo. Molteplici test sono usuali nei pazienti diabetici per l’indagine e il monitoraggio dei marcatori diabetici. I criteri di diagnosi chiave per il diabete sono il livello di glucosio nel sangue, che include l’automonitoraggio dei livelli di glucosio da parte dei pazienti diabetici. Gli studi hanno dimostrato che le complicazioni microvascolari (nefropatia, neuropatia e retinopatia) e macrovascolari (malattia coronarica e ictus) possono essere migliorate controllando il livello di glucosio nel sangue nel range normale. Il glucosio nel sangue è tipicamente osservato in individui sani nell’intervallo di 4,9-6,9 mM e può aumentare nei pazienti diabetici fino a 40 mM dopo l’assunzione di glucosio. Anche se diversi tipi di sensori di glucosio sono disponibili in commercio, la terza generazione di biosensori di glucosio è mostrata nella Figura 2 come esempio.
Figura 2. Terza generazione di biosensore di glucosio
Rilevamento delle malattie cardiovascolari con i biosensori
Il numero di decessi causati globalmente dalle malattie cardiovascolari (CVD) è significativo e più persone muoiono di CVD che per qualsiasi altra malattia. Nel 2015, circa 17,7 milioni di persone sono morte per CVD, rappresentando un totale del 31% di tutti i decessi globali. 7,4 milioni di questi erano dovuti alla malattia coronarica e 6,7 milioni all’ictus. Per quanto riguarda i farmaci e la terapia, una persona con CVD ha bisogno di essere individuata e gestita prima. L’attuale strategia di rilevamento di CVD si basa sul metodo tradizionale, che di solito è basato su test che possono richiedere molte ore o addirittura giorni. L’OMS stabilisce questi criteri diagnostici, in base ai quali i pazienti dovrebbero seguire almeno una delle condizioni, come i cambiamenti nell’elettrocardiogramma diagnostico (ECG), l’elevazione dei marcatori biochimici nei campioni di sangue e il caratteristico dolore al petto. L’ECG è un parametro importante per la gestione della terapia, ma l’ECG è un test diagnostico povero in caso di CVD perché la metà dei pazienti CVD ha un cardiogramma normale, rendendo più difficile la diagnosi di questa condizione medica. Il biosensore aiuterà nella diagnosi rapida, fornendo un’eccellente assistenza sanitaria e riducendo il tempo di ritardo per la distribuzione dei risultati, che è uno stress immenso per i pazienti.
Biosensore per la rilevazione del cancro
Il cancro è una delle malattie più letali, e diversi ricercatori hanno recentemente sviluppato biosensori per la diagnosi precoce del cancro. La maggior parte dei tumori sono tipicamente diagnosticati tramite risonanza magnetica, ultrasuoni o metodi di biopsia che si basano sulle proprietà fisiche e sulla presenza del tumore e identificano strumenti avanzati o invasivi. Le variazioni nelle sequenze dei geni, cioè le mutazioni, causano principalmente il cancro e quindi richiedono una diagnosi precoce prima che la malattia progredisca. La diagnosi precoce del cancro rende il trattamento più veloce e di maggior successo, aprendo una piattaforma di biosensori per il rilevamento delle prime fasi del cancro. Molti esperti ritengono che nel caso del cancro, la diagnosi precoce potrebbe essere possibile perché le anomalie nella composizione chimica e genetica possono essere identificate molto prima che la malattia inizi. La crescita cellulare incontrollata e irregolare, comunemente ritenuta un cancro, si verifica a causa dell’accumulo di mutazioni genetiche uniche e difetti epigenetici. Le cellule tumorali si dimostrano resistenti all’apoptosi e al meccanismo di difesa anti-crescita del corpo. Se progredisce e comincia ad espandersi ad altri organi e sistemi del corpo, cioè a metastatizzare la fase, il cancro diventa incurabile. La stimolazione degli oncogeni e la riduzione della funzione dei geni soppressori del tumore (TSG) sono i due più importanti meccanismi di tumorigenesi. A causa della mutazione o della replicazione di un gene normale (proto-oncogene), avviene l’attivazione dell’oncogene, che svolge ruoli chiave tra cui il controllo della crescita cellulare, la proliferazione e/o la differenziazione. Tale mutazione genetica guida il gene a produrre una quantità eccessiva del suo prodotto genico, con conseguente disregolazione della divisione cellulare, della crescita cellulare e dell’insediamento del tumore. Molti oncogeni sono stati considerati come promettenti biomarcatori tumorali per i recettori dei fattori di crescita. In circa il 33% di tutti i tumori al seno, il recettore del fattore di crescita epidermico umano Her-2 è intensificato, e i tumori con Her-2 rafforzato sembrano svilupparsi e aumentare più rapidamente. La conoscenza dello stato di Her-2 è quindi essenziale per concludere il possibile percorso di cura. Il Trastuzumab è oggi una tipica terapia adiuvante per le pazienti con questo tipo di espressione genica amplificata, un anticorpo monoclonale ricombinante umanizzato mirato a Her-2 come trattamento diretto del cancro al seno. I TSG sono legati al controllo della crescita e della proliferazione cellulare insufficiente, minimizzando o impedendo la divisione delle cellule. La proteina Retinoblastoma (Rb), BRCA1/2 e p53 sono tre dei TSG ben studiati nel cancro. Rb è un regolatore principale della divisione cellulare, e la mutazione di Rb gioca un ruolo significativo in vari tipi di cancro. Le cause più comuni di inattivazione del gene Rb1 sono mutazioni puntiformi e delezioni. BRCA1 è un enzima di riparazione del DNA che si associa al DNA appena replicato per “correggere” la fedeltà e cercare eventuali mutazioni. Finché la cellula non si divide, gli enzimi di riparazione del DNA lavorano normalmente per eliminare gli errori di replicazione. Le mutazioni del gene BRCA1 sono responsabili del 50% dei tumori al seno ereditari e dell’80-90% dei tumori al seno e alle ovaie ereditari. Infine, uno dei principali regolatori dell’apoptosi o morte cellulare programmata è la proteina p53. Nel cervello, nel seno, nel colon, nel polmone, nei carcinomi epatocellulari e nelle leucemie, si trovano mutazioni di p53. Un altro coinvolgimento significativo con la perdita di p53 è che porta al meccanismo di resistenza dei farmaci chemioterapici. Il miglioramento dei biosensori che possono rilevare l’esistenza di mutazioni di p53, Rb e BRCA1 è altamente giustificato e può permetterci di valutare la suscettibilità del cancro precoce con prognosi dettagliata e regimi di trattamento.
Biochip nella diagnostica
Il biochip di DNA apre un nuovo campo di diagnostica basato sulla genetica. Il modo in cui la professione medica esegue le analisi del sangue potrebbe essere rivoluzionato da un biochip del DNA di nuova concezione. Sono virtualmente immediati con il biochip delle dimensioni di una scatola di fiammiferi invece di un paziente che deve aspettare diversi giorni per i risultati da un laboratorio. E senza sacrificare la precisione, richiede meno sangue. Il biochip di DNA riduce la necessità di etichette radioattive utilizzate per la rilevazione, oltre al risparmio di tempo. Per i tecnici e i lavoratori di laboratorio che maneggiano i campioni e che eseguono i test, questo diminuisce significativamente i costi e gli effetti futuri sulla salute. Riduce anche i costi di smaltimento perché, secondo le rigide normative, il sangue etichettato chimicamente deve essere manipolato.
Un biosensore deve essere altamente sensibile e capace di differenziare, per esempio, batteri, virus o altre specie chimiche o biologiche per essere utile per rilevare i composti in un campione di vita reale. Secondo Vo-Dinh, che ha chiarito che il biochip imita le sofisticate capacità di riconoscimento di un sistema vivente, i biochip di DNA lo fanno. Il DNA biochip è un biosensore basato sulla sonda genica, in contrasto con altri biosensori basati su sonde di enzimi e anticorpi. I biosensori basati su sonde geniche forniscono un’eccezionale selettività e sensibilità, rendendoli strumenti preziosi per la diagnosi di malattie genetiche e specie infettive.
Biochip nell’epidemia della Tubercolosi
Lo sviluppo di nuove tecnologie biochip da parte di scienziati russi e americani potrebbe portare qualche speranza di fermare la recrudescenza globale della tubercolosi. Stabilita dall’Argonne National Laboratory del Dipartimento dell’Energia degli Stati Uniti e dall’Istituto di Biologia Molecolare W. A. Englehardt dell’Accademia Russa delle Scienze (Mosca), la tecnologia è destinata ad aiutare a combattere l’attuale varietà di ceppi della malattia resistenti ai farmaci.
L’Organizzazione Mondiale della Sanità riferisce che la tubercolosi uccide più giovani e adulti, compresi AIDS e malaria combinati, di qualsiasi altra malattia infettiva. La più grande sfida dell’epidemia di tubercolosi in corso è che la malattia può essere causata da diverse specie batteriche, e ognuna è resistente a vari farmaci. L’elemento critico nel controllo della malattia è definire il ceppo che colpisce un dato paziente e determinare il miglior antibiotico per combattere quel ceppo. Per differenziare i numerosi ceppi di tubercolosi, Argonne intende utilizzare la tecnologia biochip nella ricerca. Inizialmente verrebbero effettuati dei test su segmenti di materiale genetico rimosso dai batteri della tubercolosi. I biochip sono progettati per condurre simultaneamente un certo numero di reazioni biochimiche e si sono dimostrati soddisfacenti nei test di laboratorio. Poiché l’individuazione di specifici ceppi di tubercolosi richiede settimane o mesi, ai pazienti vengono spesso prescritti diversi antibiotici contemporaneamente.
Biochip nel cancro
La tecnologia del chip biosensore fornisce anche un accesso rapido e semplice alle informazioni cruciali sui danni al DNA del composto che produce il cancro, spostando i ricercatori un passo più vicino nella lotta contro il cancro. A differenza dei metodi tradizionali di biosensing, un metodo di fluorescenza basato sul laser, ad alta risoluzione e a bassa temperatura offre un’impronta digitale precisa della molecola. È possibile che la sua facilità d’uso incoraggi la sostituzione delle procedure endoscopiche invasive e aiuti a rilevare precocemente il cancro al colon.
Biosensori & Biochip applicati nell’alimentazione e agricoltura
L’attuale produzione alimentare affronta sfide immense dall’aumento della popolazione umana, il mantenimento delle risorse pulite e della qualità del cibo, e la protezione dell’ambiente e del clima. La sostenibilità alimentare è principalmente uno sforzo cooperativo che si traduce nello sviluppo di tecnologie finanziate sia dai governi che dalle aziende. Sono stati sostenuti diversi tentativi per superare le sfide e migliorare i driver nella produzione alimentare. Attraverso le loro applicazioni, i biosensori e le tecnologie di biosensing sono ampiamente utilizzati per risolvere le principali sfide della produzione alimentare e della sua sostenibilità. Di conseguenza, c’è un crescente bisogno di tecnologie di biosensing nell’area della sostenibilità alimentare. Un sistema tecnologico che combina diverse tecnologie è definito dalla microfluidica. I nanomateriali, con la loro tecnologia di biosensing, sono noti per essere lo strumento più innovativo fortemente associato alle popolazioni mondiali nel trattare la salute, l’energia e le questioni ambientali. Il bisogno di tecnologia point of care (POC) in questo settore si concentra su strumenti analitici che siano veloci, semplici, precisi, compatti e a basso costo.
Per la nostra esistenza e vita, il cibo con la sua industria di produzione è essenziale; e la sua sostenibilità è essenziale nella continua crescita umana sul pianeta. L’attuale produzione alimentare sta affrontando immense difficoltà dovute all’aumento della popolazione umana, al mantenimento delle risorse pulite e della qualità del cibo, e alla protezione dell’ambiente e del clima. Alcuni di questi problemi derivano dalla produzione alimentare stessa; altri derivano da altre industrie legate alla produzione alimentare. I richiami di cibo, per esempio, provocano grandi danni alla credibilità e al prestigio dei marchi alimentari, con una stima di 15 milioni di dollari per incidente negli ultimi anni. 48 milioni di casi di malattia sono responsabili di 3000 decessi ogni anno a causa di malattie di origine alimentare.
La sicurezza alimentare è in gran parte uno sforzo cooperativo derivante sia dai governi che dalle aziende nello sviluppo della tecnologia. Al fine di porre nuove sfide nelle questioni di sicurezza alimentare, le tecnologie dell’informazione come la tecnologia blockchain possono accelerare la comunicazione tra la qualità del cibo, i media e i consumatori. Cinque sfide possono essere riassunte come le principali sfide nella sostenibilità della produzione alimentare: la sfida della produzione della sicurezza alimentare; la sfida della qualità della diversità e della qualità del cibo; la sfida economica nel sistema alimentare principale, compreso il suo imballaggio e la catena di approvvigionamento; la sfida ambientale, compreso il trattamento dei rifiuti alimentari; e la sfida ingegneristica nella creazione e generazione di nuovi alimenti.
Fondamentalmente, un biosensore è uno strumento analitico utilizzato per misurare la molecola di interesse (target) di un campione. In generale, viene utilizzato un fattore di bioriconoscimento (aptamero, anticorpo, enzima, ecc.) che è unico per il target. Un segnale fisiochimico o biologico è suscitato da eventi di riconoscimento molecolare tra l’elemento di riconoscimento e il composto target, che viene trasformato in una quantità misurabile dal trasduttore. I segnali vengono visualizzati in forma ottica (colorimetrica, fluorescenza, chemiluminescenza e risonanza superficiale plasmonica) o elettrica (voltammetria, impedenza e capacità) o in qualsiasi altro formato scelto (Figura 3).
Figura 3. Classificazione dei biosensori basata su elementi trasduttori e bio-riconoscimento utilizzati nell’analisi degli alimenti
Come uno degli obiettivi primari dell’analisi degli alimenti, la sicurezza degli alimenti è una questione importante per la salute sia degli animali che degli esseri umani. L’avanzamento della tecnologia analitica della sicurezza alimentare significa che essa prospera in linea con il crescente interesse e l’enfasi sulle questioni di sicurezza dell’approvvigionamento alimentare. Nell’analisi della sicurezza alimentare, gli approcci tradizionali sono ad alta intensità di lavoro, richiedono molto tempo e hanno bisogno di tecnici addestrati. L’applicazione della microfluidica nell’analisi della sicurezza alimentare fornisce una nuova visione su come rilevare tossine di origine alimentare, allergeni, agenti patogeni, sostanze pericolose, metalli pesanti e altri contaminanti in modo efficace e rapido. Le caratteristiche della microfluidica, come la sua capacità di miniaturizzazione, le quantità compatte e riducibili di campioni e reagenti, la rendono una tecnologia perfetta per lo sviluppo della sostenibilità alimentare. La complessa preparazione della matrice alimentare e le difficili fasi di produzione sono le sfide attuali nell’applicazione della microfluidica alla sostenibilità alimentare. Queste sfide possono essere affrontate sfruttando le proprietà fisiche dipendenti da specifici obiettivi di test, progettando complesse piattaforme microfluidiche per l’analisi del cibo reale e incorporando nei sistemi microfluidici biomolecole come le proteine alimentari e il DNA.
Nanomateriali nella tecnologia di biosensing
Con la sua tecnologia di biosensing, i nanomateriali sono lo strumento più promettente per affrontare i problemi di salute, energia e ambiente associati alla popolazione nel mondo. Le particelle più piccole di 100 nm in almeno una dimensione sono note come nanomateriali. Questi nanomateriali sono polimeri biocompositi a base di metallo, ossido di metallo e carbonio, e sono stati stabiliti diversi tipi di nanoparticelle, come ferro magnetico, alluminio, oro, argento, rame, silice, zinco, ossido di zinco, ossido di cerio e nanoparticelle di biossido di titanio, e nanotubi di carbonio a parete singola/multipla (CNT). La nanotecnologia e il suo sviluppo agricolo sono stati notevolmente estesi in diversi campi. Questi campi includono la produzione di cibo, la protezione delle colture, il rilevamento di agenti patogeni e tossine, la purificazione dell’acqua, l’imballaggio degli alimenti, lo smaltimento delle acque reflue e la bonifica ambientale. Migliorare la produttività e le prestazioni delle applicazioni è la priorità di questi campi agricoli.
Nel campo della sicurezza e della protezione alimentare, le tecnologie di biosensing sono state sviluppate per il rilevamento di nutrienti e qualità, il rilevamento di agenti patogeni e il rilevamento di tossine, come elencato di seguito.
Rilevamento di nutrienti e qualità
Le misure di protezione alimentare possono essere suddivise in due categorie: perdita post-raccolto e biosicurezza alimentare. Per biosicurezza alimentare si intende la contaminazione e la degradazione del cibo, che viene affrontata nelle sezioni successive, per motivi ambientali, politici, di ingiusto guadagno economico, di guerra o di vendetta. La perdita post-raccolta, d’altra parte, suggerisce i nutrienti e le condizioni commestibili nel cibo che devono essere mantenuti tra il periodo del raccolto e il momento del consumo da parte delle tecnologie. Poiché il tempo varia da minuti ad anni, nel mantenere e ridurre le perdite, sono importanti le tecnologie che si concentrano sulla riduzione delle perdite post-raccolto.
Per mantenere la qualità del cibo ed evitare le perdite post-raccolto, si possono usare nuove tecnologie come il biosensing. I biosensori sono stati sviluppati, per esempio, per rilevare e analizzare le quantità di dolcificanti negli alimenti che possono essere utilizzati per rilevare sia i dolcificanti naturali che quelli artificiali. I dolcificanti sono ampiamente utilizzati nella produzione e nella lavorazione degli alimenti, ma sono stati recentemente identificati negli esseri umani come causa di problemi di salute. È stato sviluppato un biosensore multicanale per utilizzare il rilevamento elettrofisiologico dagli epiteli del gusto per rilevare e analizzare sia i dolcificanti naturali che quelli artificiali. Per rilevare i segnali a lungo termine di saccarosio, glucosio, ciclamato e saccarina, rispettivamente, i segnali sono studiati attraverso tecniche spazio-temporali. Il biosensore può distinguere tra diverse concentrazioni con un aumento dose-dipendente delle risposte dell’epitelio del gusto da diversi dolcificanti. Può anche distinguere tra due dolcificanti naturali: saccarosio e glucosio, con due modelli di segnale. Per il glucosio, il range di rilevamento è 50-150 mM, e per la saccarina, 5-15 mM.
Individuazione degli agenti patogeni
A causa del loro formato ridotto, i biosensori per il rilevamento di agenti patogeni come i batteri (Tabella 1) e i funghi (Tabella 2) sono iniziati più di due decenni fa; un solo dispositivo per affrontare più problemi e un rilevamento del segnale a più pannelli. Il motivo del ligando è un elemento cruciale nella progettazione del biosensore per il rilevamento di agenti patogeni poiché determina la sensibilità e l’efficienza del dispositivo. L’obiettivo è quello di stabilire una piattaforma veloce, specifica e sensibile per rilevare in campioni di cibo la presenza o l’assenza di agenti patogeni. Si è scoperto che non esiste un ligando ideale, e vari ligandi hanno diversi vantaggi. La combinazione di biorecettori per rilevare una grande varietà di microbi in diversi campioni pone le sfide attuali nel rilevamento di biosensori patogeni; nuovi disegni sintetici di ligandi come aptameri, piccole molecole e peptidi; e l’incorporazione di diversi ligandi in un dispositivo portatile per ottenere un rilevamento rapido, efficace e a basso costo.
Tabella 1: Condizioni per il numero di batteri coltivati nel latte
| Temperatura °C | 24 ore | 48 ore | 96 ore | 168 ore |
|---|---|---|---|---|
| 0 | 2100 | 2100 | 1850 | 1400 |
| 4 | 2500 | 3600 | 218,000 | 4,200,000 |
| 8 | 3100 | 12,000 | 1,480,000 | |
| 10 | 11,600 | 540,000 | ||
| 15 | 180,000 | 28,000,000 | ||
| 30 | 1,400,000,000 |
Tabella2: Requisiti di temperatura e attività dell’acqua per la crescita fungina
| Specie | Minimo | Ottimale | Massimo | Minimo | Ottimale |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus ruber | 5 | 24 | 38 | 0.72 | 0.93 |
| A. amstelodami | 10 | 30 | 42 | 0.70 | 0.94 |
| A. flavus | 12 | 35 | 45 | 0.80 | 0.99 |
| A. fuminatus | 12 | 40 | 52 | 0.83 | 0.99 |
| A. niger | 10 | 35 | 45 | 0.77 | 0.99 |
| Penicillium martensii | 5 | 24 | 32 | 0.90 | 0.99 |
Individuazione delle tossine
Il mainstream dello sviluppo nella sicurezza alimentare è costituito dai biosensori elettrochimici per il rilevamento e la valutazione rapida delle tossine alimentari. Sono state sviluppate numerose piattaforme per consentire dispositivi personalizzati e individualizzati per soddisfare particolari requisiti ambientali e organizzativi e per raggiungere i livelli limite di rilevamento da nM a fM. Ad esempio, per favorire profili di legame unici, gli array di biorecettori si rivolgono a singoli elettrodi funzionalizzati con diversi biorecettori con obiettivi di legame. Oltre al biosensing elettrochimico, il rilevamento di tossine e sostanze chimiche nella produzione alimentare è stato applicato ad altri biosensori come il rilevamento ottico e piezoelettrico (Figura 4). Al fine di rilevare le tossine, sono state prodotte nanoparticelle fluorescenti negli alimenti e nei corpi, compresi quelli on-surface, inter- e intra-cellulari.
Figura 4. Contaminanti alimentari predominanti e analiti bersaglio nelle industrie manifatturiere alimentari
L’estrazione delle tossine da campioni di cibo complicati è uno degli ostacoli principali nella creazione di un rilevatore di tossine completamente automatizzato. Per valutare automaticamente i loro livelli nocivi da campioni di cibo e acqua, ci si aspetta che i sistemi potenziali estraggano, elaborino e misurino le tossine. Per identificare, discriminare e quantificare le tossine chimiche nelle matrici alimentari, sofisticate strategie di separazione sono state accoppiate al SERS. Inoltre, anche se sono tipicamente in quantità inferiori, i contaminanti chimici derivanti dalla lavorazione degli alimenti possono rappresentare una sfida. La minore stabilità, selettività e sensibilità sono un’altra sfida nel rilevamento delle tossine alimentari, dove i MIP possono essere una soluzione per fornire alternative stabili e a basso costo.
I metalli pesanti come Ag+, As3+, Cd2+, Hg2+, Pb2+ e Zn2+ sono noti come inquinanti chimici che formano stati stabili di ossidazione e interferiscono con le vie metaboliche, causando problemi di salute. I biosensori basati su aptameri e DNA possono rilevare i metalli pesanti sia su scala nanometrica che su larga scala, che sono appropriati per lo screening e il monitoraggio della sicurezza alimentare. Al fine di rilevare l’arsenato negli alimenti, un biosensore di rilevamento di metalli pesanti si basa su cellule batteriche geneticamente modificate e su un amplificatore di segnale verde e fluorescente. Con una gamma di rilevamento di 5-140 μg/L di arsenico, il suo rilevamento dell’arsenico dura solo un’ora e può essere integrato con l’uscita di potenza ottica per la sua futura fibra ottica di biosensing. Altre tecnologie di biosensing come aptameri, nanoparticelle ed elettrodi di grafene sono state applicate con successo all’identificazione e alla valutazione dell’arsenico, con il potenziale di essere prodotti come dispositivi veloci, semplici, facili da usare e a basso costo.
La nanotecnologia è stata adattata a due campi distinti dei pesticidi agroalimentari: come vettore di consegna dei pesticidi per la gestione dei pesticidi e come rivelatore di tracce di pesticidi. Nel primo campo, le nanoparticelle sono in grado di modificare lentamente i pesticidi per colpire i parassiti degli insetti, il che aiuta a prevenire l’inquinamento delle acque sotterranee e del suolo superiore, a ridurre i livelli di pesticidi e a migliorare l’efficienza. Nel secondo campo, la nanotecnologia basata sulla bio- o biomimetica, come anticorpi, enzimi, aptameri, e macromolecole simili a MIP, migliora la stabilità, la selettività, la sensibilità e la velocità di rilevamento. Inoltre, le cellule batteriche, fungine, algali e di mammiferi sono tutti biosensori basati su cellule utilizzati nella rilevazione di pesticidi ed erbicidi, aiutando a stabilire strumenti veloci, affidabili, in tempo reale e convenienti per procedure di decontaminazione e danni preventivi alle vittime.
Cancerogeni, odoranti e contaminanti marini sono altre tossine significative nella produzione alimentare. I cancerogeni sono un gruppo complesso di tossine in tracce, come pesticidi, metalli pesanti, micotossine e acrilamide, in cui la difficoltà di identificare le tracce è una sfida; e gli aptameri impressi, la nanotecnologia e il biosensing sono ottimisti per un promettente uso futuro. Le molecole sensibili e solubili efficaci nella rilevazione degli odori per i sistemi olfattivi animali sono le proteine leganti gli odori. Un nanosensore che combina SPR localizzato e piccole proteine leganti gli odori delle api mellifere è stato stabilito in cui il range di rilevamento è 10 nM – 1 mM usando un array quantitativo di nanocupole. Per monitorare e preservare un ambiente stabile per i sistemi alimentari marini, viene utilizzato il rilevamento dei contaminanti marini. Infine, attraverso le loro capacità di rilevamento sensibile, i dispositivi miniaturizzati, la comunicazione wireless e le reti su piccola scala, i biosensori possono essere applicati alla sicurezza alimentare marina per essere stabiliti come strumenti avanzati di analisi e monitoraggio.
Un altro kit di sviluppo per i biosensori di sicurezza alimentare si concentra sul rilevamento di organismi geneticamente modificati (OGM) nei prodotti alimentari. Dagli anni 1990, gli OGM in tutti i campi dei prodotti agricoli sono stati considerati una rivoluzione biotecnologica. Attualmente, più del 45% della soia del mondo, il 40% del mais e il 50% del cotone sono prodotti GM; e GM è anche usato nel bestiame. Recenti ricerche, tuttavia, indicano che i prodotti OGM possono influenzare il corpo umano e animale attraverso problemi gastrointestinali, resistenza agli antibiotici, allergenicità, degradazione della diversità dei prodotti agricoli, e flusso genico indesiderato ad altre specie. I biosensori sono progettati per misurare gli OGM in alimenti e mangimi utilizzando l’amplificazione isotermica del DNA e la rilevazione rapida del segnale di rilevamento per identificare i geni GM. Rilevare i geni del DNA non identificati che possono essere risolti dalla tecnologia high-throughput come la combinazione di biosensing e array, e lo sviluppo di database di geni OGM sono le sfide chiave nel rilevamento degli OGM.
Biosensori & Biochip per il monitoraggio ambientale
A causa della forte connessione tra l’inquinamento ambientale e la salute umana/il progresso socioeconomico, il monitoraggio ambientale è diventato una delle priorità su scala europea e globale. I biosensori sono stati comunemente utilizzati come tecniche analitiche economiche, rapide, in situ e in tempo reale in questo campo. Il recente sviluppo di biosensori con nuovi materiali di trasduzione ottenuti dalla nanotecnologia e per la rilevazione multipla di inquinanti, che coinvolge esperti multidisciplinari, spiega la necessità di dispositivi di biosensing compatti, veloci e intelligenti. Esistono diversi sviluppi recenti nel monitoraggio di contaminanti dell’aria, dell’acqua e del suolo tramite biosensori in condizioni reali, come pesticidi, componenti altamente tossici e piccole molecole organiche, tra cui tossine e sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino.
I biosensori utilizzati nel monitoraggio ambientale possono essere classificati come ottici (compresi i biosensori a fibra ottica e a risonanza plasmonica di superficie), elettrochimici (compresi i biosensori amperometrici e a impedenza) e piezoelettrici (compresi i biosensori a microbilancia a cristallo di quarzo) in base alla loro trasduzione o come immunosensori, aptasensori, genosensori e biosensori enzimatici in base ai loro elementi di riconoscimento, rispettivamente quando vengono utilizzati anticorpi, aptameri, acidi nucleici ed enzimi. La maggior parte dei biosensori nel monitoraggio ambientale sono riconosciuti come immunosensori e biosensori enzimatici, ma lo sviluppo di aptasensori è recentemente aumentato a causa delle caratteristiche vantaggiose degli aptameri, come la facilità di modifica, la stabilità termica, la sintesi in vitro e la capacità di progettare la loro struttura, di differenziare obiettivi con diversi gruppi funzionali e di reibridizzare.
Lo studio della progettazione di biosensori per il monitoraggio di inquinanti organici, elementi potenzialmente tossici e agenti patogeni nell’ambiente ha portato allo sviluppo sostenibile della civiltà a causa dei problemi di inquinamento ambientale che riguardano la salute umana. Varie tecniche cromatografiche (come la gascromatografia e la cromatografia liquida ad alte prestazioni combinate con l’elettroforesi capillare o la spettrometria di massa) sono metodi analitici convenzionali utilizzati per il monitoraggio ambientale degli inquinanti, ma richiedono reagenti costosi, un pretrattamento del campione che richiede tempo e attrezzature costose. Pertanto, per il monitoraggio degli inquinanti responsabili degli effetti negativi sugli habitat e sulla salute umana, sono disperatamente necessari dispositivi di biosensing più sensibili, convenienti, veloci, facili da usare e compatti per superare l’ingrandimento dei problemi ambientali. In caso di rilascio accidentale di pesticidi o di avvelenamento acuto, per esempio, i metodi comuni non sono appropriati per le misurazioni in situ, dove sono necessarie apparecchiature veloci, miniaturizzate e portatili come i biosensori di monitoraggio ambientale. A questo proposito, il ruolo delle nanotecnologie nella creazione di dispositivi di biosensing rapidi e intelligenti è cruciale per il successo del rilevamento degli inquinanti ambientali; i biosensori più recenti includono nanomateriali e nuovi nanocompositi nei loro sistemi, che sono utili per migliorare le prestazioni analitiche, come la sensibilità e i limiti di rilevamento.
Per il rilevamento e il monitoraggio di diversi inquinanti ambientali, sono stati documentati biosensori, compresi immunosensori, aptasensori, genosensori e biosensori enzimatici che utilizzano anticorpi, aptameri, acidi nucleici ed enzimi come elementi di riconoscimento.
Pesticidi
I pesticidi sono tra gli inquinanti ambientali più significativi a causa della loro grande presenza nell’ambiente. Gli insetticidi organofosforici, per esempio, sono comunemente usati in agricoltura e rappresentano un gruppo di pesticidi che, a causa della loro alta tossicità, sono di immensa preoccupazione ambientale. Metodologie in situ facili, reattive e miniaturizzate come i biosensori sono state quindi stabilite come strategie analitiche per il loro rilevamento e monitoraggio, senza la necessità di un pre-trattamento completo del campione.
Sono stati proposti biosensori amperometrici enzimatici monouso (acetilcolinesterasi) per la rilevazione di insetticidi organofosforici utilizzando paraoxon come analita modello applicando un monostrato autoassemblato di cisteamina su elettrodi d’oro serigrafati. I biosensori monouso hanno mostrato uno spettro lineare fino a 40 ppb con un limite di rilevamento di 2 ppb e una sensibilità di 113 μA mM cm-2. Utilizzando il monostrato auto-assemblato, il buon risultato analitico potrebbe essere dovuto all’immobilizzazione enzimatica altamente orientata. Recuperi del 97 ± 5 per cento (n = 3) sono stati riportati dopo essere stati testati in campioni di acqua di fiume con 10 ppb di paraoxon, indicando l’efficacia di tali biosensori enzimatici. Inoltre, l’uso di elettrodi serigrafati monouso dispensa da metodi che richiedono tempo come la riattivazione degli enzimi immobilizzati utilizzando, per esempio, soluzione di obidoxime e ioduro di pralidoxime (PAM) o l’uso della membrana enzimatica rinnovabile necessaria per la seconda applicazione dei biosensori.
Le nanoparticelle a base di ossido di iridio sono state utilizzate nel biosensore enzimatico monouso con tirosinasi basato su elettrodi di carbonio serigrafati a basso costo per il rilevamento del clorpirifos in campioni di acqua di fiume. La risposta lineare del biosensore (0,01-0,1 μM) e il basso limite di rilevamento (3 nM) sono stati riportati, che potrebbero essere dovuti all’alta conduttività delle nanoparticelle di ossido di iridio e all’efficienza della tirosinasi. Sono stati effettuati test di recupero in campioni di acqua di fiume con l’aggiunta di 0,1 μM di clorpirifos e sono stati ottenuti recuperi del 90 ± 9,6 per cento con una deviazione standard residua (RSD) inferiore al 10 per cento (n = 3) per dimostrare l’applicabilità del biosensore.
L’acetamiprid è stato rilevato da aptasensori colorimetrici e i campioni d’acqua da aptasensori impedimetrici in campioni ambientali reali, come campioni di suolo fresco di superficie. Un intervallo lineare di 75 nM a 7,5 μM e un limite di rilevamento di 5 nM sono stati osservati con l’aptasensore colorimetrico, mentre un intervallo lineare più ampio (50 fM a 10 μM) e un limite di rilevamento inferiore (17 fM) sono stati osservati con l’aptasensore impedimetrico. Nanoparticelle d’oro, nanotubi di carbonio a più pareti (MWCNT) e nanofibre di ossido di grafene ridotto sono stati utilizzati in quel biosensore come un composito per sostenere l’aptamero acetamiprid sulla superficie dell’elettrodo, che potrebbe essere responsabile di un maggiore trasferimento di elettroni e migliori prestazioni analitiche del biosensore. Un limite di rilevamento correlato (33 fM) è stato osservato da un aptasensore basato su nanoparticelle d’argento ancorate all’ossido di grafene nanocomposito drogato con azoto costruito per il rilevamento di acetamiprid in campioni di acque reflue.
L’acetamiprid è stato rilevato da aptasensori colorimetrici e i campioni d’acqua da aptasensori impedimetrici in campioni ambientali reali, come campioni di suolo fresco di superficie. Un intervallo lineare di 75 nM a 7,5 μM e un limite di rilevamento di 5 nM sono stati osservati con l’aptasensore colorimetrico, mentre un intervallo lineare più ampio (50 fM a 10 μM) e un limite di rilevamento inferiore (17 fM) sono stati osservati con l’aptasensore impedimetrico. Nanoparticelle d’oro, nanotubi di carbonio a più pareti (MWCNT) e nanofibre di ossido di grafene ridotto sono stati utilizzati in quel biosensore come un composito per sostenere l’aptamero acetamiprid sulla superficie dell’elettrodo, che potrebbe essere responsabile di un maggiore trasferimento di elettroni e migliori prestazioni analitiche del biosensore. Un limite di rilevamento correlato (33 fM) è stato osservato da un aptasensore basato su nanoparticelle d’argento ancorate all’ossido di grafene nanocomposito drogato con azoto costruito per il rilevamento di acetamiprid in campioni di acque reflue.
Patogeni
L’esistenza di agenti patogeni nelle matrici ambientali, e specialmente nei compartimenti idrici, potrebbe rappresentare un serio rischio per la salute umana, e alcuni biosensori sono stati recentemente proposti per il monitoraggio dell’ambiente. Per esempio, per il rilevamento di Legionella pneumophila metabolicamente attiva in campioni d’acqua ambientali complessi, sono stati proposti biosensori ottici rapidi e precisi basati sulla risonanza plasmonica di superficie. In uno studio, il principio di rilevamento si basava sull’identificazione dell’RNA batterico da parte della sonda rivelatrice di RNA immobilizzata sulla superficie dorata del biochip. Per l’amplificazione del segnale, sono stati utilizzati punti quantici coniugati con streptavidina, e il periodo di rilevamento è stato di circa tre ore, indicando la fattibilità del dispositivo di biosensing per il rilevamento di batteri di successo nella gamma di 104-108 104-108 CFU mL-1.
Elementi potenzialmente tossici
La contaminazione da metalli pesanti e ioni corrispondenti delle acque naturali può comportare rischi significativi per la salute umana, e le analisi compatte, a basso costo e rapide dei metalli pesanti sono una preoccupazione prioritaria a livello globale. Come obiettivo modello per testare un biosensore ottico del DNA per il rilevamento di ioni di metalli pesanti che sono estremamente tossici e inquinanti comuni nell’ambiente, sono stati utilizzati gli ioni di mercurio (Hg2+). Il biosensore era compatto, a basso costo e rapido con uno screening in situ di Hg2+ in acque naturali in meno di 10 minuti. Il principio di rilevamento è incentrato sulla capacità di alcuni ioni metallici di legarsi selettivamente a certe basi per formare stabili duplex di DNA mediati dal metallo; nel caso di Hg2+, le basi di timina possono essere coordinate selettivamente per formare complessi timina-Hg2+-timina stabili. Nell’intervallo di rilevamento tra 0 e 1000 nM, è stato raggiunto un limite di rilevamento di 1,2 nM, che è inferiore al valore massimo richiesto dalla United States Environmental Protection Agency (10 nM)
Per il rilevamento di Pb2+ in campioni di acqua (campioni di acqua di stagno e di lago) utilizzando DNAzimi/perle magnetiche carbossilate e aptameri di DNA, sono stati recentemente suggeriti due biosensori ottici basati sulla fluorescenza. I limiti di rilevamento di 5 nM e 61 nM, rispettivamente, sono stati osservati dai biosensori basati su DNAzimi e DNA aptameri, con un rispettivo intervallo di rilevamento lineare da 0 a 50 nM e da 100 a 1000 nM. L’uso del colorante unico senza etichetta (SYBER Green I), che è stato intercalato con il DNA a doppio filamento, mostrando forti intensità di fluorescenza, come si vede nella Figura 5. Inoltre, l’assenza di intensità di fluorescenza biosensore è osservato solo con il colorante (curva a). Con il DNAzyme + Pb2+ (curva b) l’intensità di fluorescenza aumenta con l’aggiunta del colorante + DNAzyme + Pb2+, illustrando la sensibilità del biosensore verso il Pb2+.
Figura 5. Spettri di emissione di fluorescenza per il rilevamento di Pb2+
Tossine
Le tossine nocive come le brevetoxine e le microcistine sono create dall’eutrofizzazione dei sistemi acquatici dalle fioriture algali di cianobatteri, e quindi sono necessari sistemi accurati e convenienti per il rilevamento precoce di tali tossine. Per il rilevamento sensibile della brevetoxina-2, una neurotossina marina, è stato utilizzato un aptasensore elettrochimico composto da elettrodi d’oro funzionalizzati con monostrati autoassemblati di cisteamina. Un limite di rilevamento di 106 pg mL-1 è stato raggiunto e una forte selettività è stata osservata per la brevetoxina-2 contro altre tossine di vari gruppi, come l’acido okadaico e la microcistina. La fattibilità dell’aptasensore per il rilevamento del brevetoxin-2 in campioni reali è stata raggiunta analizzando crostacei e sono stati riportati forti recuperi (102-110 per cento), indicando nessuna interazione con la risposta dell’aptasensore dalla matrice del crostaceo.
Sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino
Nei campioni d’acqua, il bisfenolo A è stato rilevato come sostanza chimica che altera il sistema endocrino da aptasensori basati sul principio della fluorescenza con aptamers funzionalizzati (fluoresceina amidite) e nanoparticelle d’oro e basati su fibra ottica a onde evanescenti. L’aptasensore in fibra ottica a onde evanescenti è stato compatto ed è risultato essere rapido, economico, sensibile e selettivo per il rilevamento del bisfenolo A in campioni di acqua, con il vantaggio di non richiedere alcuna fase di preconcentrazione o trattamento. Inoltre, l’aptasensore può essere riutilizzato per 90 s mediante rigenerazione con una soluzione di sodio dodecil solfato (SDS) allo 0,5% e ulteriore lavaggio con una soluzione salina tampone fosfato (PBS) (pH 7,2) per oltre un centinaio di cicli di test senza alcuna perdita notevole di efficienza. Limiti di rilevamento simili (0,1 e 0,45 ng mL-1) sono stati osservati in entrambi i biosensori ottici in cui la sonda molecola di DNA, che è la sequenza complementare di una piccola frazione dell’aptamero del bisfenolo A, è stata adsorbita per interazione elettrostatica nella superficie delle nanoparticelle d’oro e immobilizzata covalentemente sulla superficie della fibra. Ultimamente, per il rilevamento del bisfenolo A in campioni di acqua di fiume utilizzando nanotubi di carburo di molibdeno, è stato proposto un altro aptasensore basato sulla fluorescenza. Con un tale aptasensore senza etichetta, poco costoso e facile da usare, è stato ottenuto un basso limite di rilevamento di 0,23 ng mL-1. La specificità del aptasensore è stata valutata analizzando altre molecole con strutture simili a quella del bisfenolo A (ad esempio, 4,4J-bifenolo, bisfenolo AF, e 4,4J-sulfonildifenolo) e per queste molecole sono stati identificati solo segnali di fondo che mostrano una elevata specificità per il bisfenolo A.
Un immunosensore elettrochimico monouso e senza etichetta basato su un transistor a effetto di campo con SWCNT è stato recentemente impiegato in campioni di acqua di mare per valutare un’altra sostanza chimica che altera il sistema endocrino, il 4-nonilfenolo. L’immunosensore ha un’alta riproducibilità (0,56 ± 0,08%), un recupero medio dal 97,8% al 104,6% e un basso limite di rilevamento (5 μg L-1), che è inferiore alla concentrazione massima raccomandata di 7 μg L-1 specificata dai regolamenti corrispondenti. In campioni di acqua di mare come il 4-nonilfenolo, il biosensore potrebbe essere utilizzato per rilevare sostanze prioritarie pericolose, anche a basse concentrazioni e con una metodologia facile e a basso costo.
Altri composti ambientali
Metodologie analitiche nuove, veloci e accurate sono state necessarie per il rilevamento precoce e il monitoraggio di vari altri composti pericolosi liberati durante le fioriture algali. Grazie all’eccellente sensibilità e specificità delle sonde di acido nucleico ai loro partner di legame complementari, sono stati sviluppati biosensori per rilevare l’RNA algale. Per il rilevamento selettivo e sensibile dell’RNA di 13 organismi algali nocivi, è stato recentemente riportato un genosensore elettrochimico basato su un elettrodo d’oro serigrafato; il genosensore potrebbe distinguere gli obiettivi dell’RNA da campioni ambientali (campioni di acqua di mare drogata) contenenti 105 cellule, considerati il limite di rilevamento.
Test: LO3 Livello avanzato
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