Обучение „Биотехнологии“

ОР2_ОН

ОР3_ОН

Биосензори § Биочипове за устойчиво бъдеще

Начално ниво

Биочипове се появиха като иновативна микротехнологична платформа за анализ на биомолекула през 80-те години.

Съдържание

Биосензори и биочипове: Общ преглед

Проекти за биосензори: Дизайн и експлоатация

Електрохимични биосензори
Ензим-базирани биосензори
Имунологичен биосензор
ДНК биосензори
Бъдещето на клиничните биосензори

Проекти за биочипове: Дизайн и експлоатация

ДНК микрочипове
Микрофлуиден чип
Протеинов микрочип
Приложения на биочипове

Биосензори и биочипове: Общ преглед

Проекти за биосензори: Дизайн и експлоатация

Електрохимични биосензори
Ензим-базирани биосензори
Имунологичен биосензор
ДНК биосензори
Бъдещето на клиничните биосензори

Проекти за биочипове: Дизайн и експлоатация

ДНК микрочипове
Микрофлуиден чип
Протеинов микрочип
Приложения на биочипове

Биосензори и биочипове: Общ преглед

Биочипове се появиха като иновативна микротехнологична платформа за анализ на биомолекула през 80-те години. Различни технологии, като науки за живота, информационни технологии, микроелектроника и микромеханика, са включени в разработването на основните технологии. Биочиповете се считат за важни потенциални инструменти в съвременните научни изследвания в областта на науките за живота, медицинската диагностика, откриването на лекарства, мониторинга на безопасността на храните и селското стопанство като високоефективни, миниатюризирани, автоматизирани и рентабилни устройства. Очаква се биочиповете да позволят драстично да се увеличат скоростта и обхватът на аналитичния процес и да осигурят огромна икономическа печалба. Освен това, през последните години многобройни правителства и индустриални компании в света инвестираха сериозно в този сектор. Засега биочип технологията е само в ранната си еволюция. Това е област, която непрекъснато се променя. Бъдещето на научните изследвания и разработките за биочипове е светло, но в тази област има и яростна конкуренция.

При биомедицинските изследвания и науките за живота миниатюризацията на химичните и биомедицински лабораторни процеси върху микрочипове е бързо разрастваща се област. Технологиите „лаборатория върху чип“ ще донесат много предимства пред техните макроразмери. По-специално, по-високите съотношения на повърхността към обема водят до намалени химически изисквания, намалени отпадъци, по-добър контрол, бърза обработка и значителна способност за паралелна обработка и включване на процеса. Технологиите „лаборатория върху чип“ имат потенциала да имат значително социално-икономическо въздействие. В лабораторната медицина напълно интегрираните микро устройства за химичен синтез и диагностика на заболявания представляват научен пробив и промяна на парадигмата в химическата обработка. Проектът за човешкия геном има огромен принос за тази технология.

В областта на анализа, биосензорите позволяват големи иновации, които едновременно улесняват и са улеснени от развитието на синтетичната биология. Потенциалът на биосензорите да идентифицират широк спектър от молекули лесно и точно ги прави изключително важни за различни индустриални, медицински, екологични и научни приложения. Стратегиите за проектиране на биосензори са толкова многобройни, колкото и техните приложения, като основните групи биосензори включват нуклеинови киселини, протеини и транскрипционни фактори. Въз основа на очакваната употреба и параметрите, необходими за оптимална производителност, всеки от тези видове биосензор има предимства и ограничения. По-специално, съображения като специфичност на лиганда, чувствителност, динамичен обхват, функционален обхват, изходен режим, време за активиране, лекота на използване и лекота на инженерство трябва да бъдат взети предвид при избора на дизайна на биосензора.

Проекти за биосензори: Дизайн и експлоатация

Биосензорите са сензори, които трансформират процесите на биоразпознаване чрез физико-химичен преобразувател във видими сигнали, с електронни и оптични техники като два основни преобразувателя. Създаването на биосензори отговаря на бързо нарастващата днешна нужда от клинична диагностика. Комбинация от предимства се постига чрез използването на биосензори. Биосензорите, първо, са силно чувствителни. Това е така, защото биомолекулите имат висок афинитет към своите цели, например, антителата улавят антигени с дисоциационна константа в наномоларната скала, а взаимодействията ДНК-ДНК са много по-силни от антиген-антитяло. Второ, биологичното разпознаване обикновено е много избирателно. Ензимът и субстратът наподобяват например ключалка и ключ. Такава висока селективност често води до биосензори, които са селективни. Трето, производството на евтини, интегрирани и готови за употреба биосензорни устройства стана относително лесно да се развие поради развитието на съвременната електронна индустрия. Способността за откриване на патогени или извършване на генетичен анализ в болниците със сигурност се подобрява от тези биологични сензори и по-важното е, че те са особено полезни за малки клиники и дори за анализ на точково обслужване.

За биосензори с клинично приложение са разработени редица нови техники. По принцип биосензорите са аналитични устройства, изградени от елемент на биологично разпознаване и оптичен/електронен преобразувател. Биологичният елемент е отговорен за улавянето на разтворените аналити, а преобразувателят трансформира свързващия процес в измерима вариация на сигнала. По естеството на разпознаването биосензорите, те могат да се категоризират като на базата на ензими, имунологичните биосензори и ДНК биосензорите. В допълнение се предлагат електронни биосензори (електрически или електрохимични), оптични биосензори (флуоресцентен, повърхностен плазмонен резонанс или Раман) и пиезоелектрични биосензори (кварцов кристален микробаланс) в зависимост от вида на преобразувателя.

Електрохимични биосензори

За биологично засичане, където електродите функционират или като донори на електрони, или като акцептори на електрони, електрохимичните техники са особено полезни. Обширни електрохимични експерименти показват, че теорията за електронен трансфер на Маркус също е в съответствие с хетерогенния електронен трансфер между електроди и ограничени на повърхността редокс молекули, подобно на донорно-акцепторните двойки в хомогенни разтвори. Това означава, че промените в малки разстояния в окислително-редукционните повърхностни молекули могат да доведат до големи вариации в хетерогенните скорости на електронен трансфер, които трябва да се превърнат в откриваеми промени в електрохимичните сигнали. Хелинга и колеги, например, предложиха електрохимична сензорна стратегия, която използва протеинови лиганд-медиирани шарнирно-огъващи движения. Златен електрод първо беше покрит със самосглобяем монослой (SAM), който дава гъвкава платформа за специфично обектно обездвижване. След това малтозо-свързващият протеин (MBP) беше прикрепен на повърхността на златния електрод с определена ориентация, като редокс репортерната група на рутений (Ru (II)) е фиксирана в определен диапазон над електрода. Тъй като лигандът малтоза се свързва с активния център на ензима, репортерът Ru (II) се отдалечава от електрода, причинявайки движение на шарнирно огъване (Фигура 1).

Figure 1. Construction and operation of electrochemical biosensor

Фигура 1 – Маркиран с рутений малтозо-свързващ протеин (MBP), е място, специално прикрепено към самосглобяем монослой (SAM), покрит със златен електрод. Процесът на свързване с протеин-лиганд посредничи на зависими промени между редокс-репортерната група Ru (II) и повърхностно модифициран златен електрод, който по този начин променя потока на тока между двата компонента. Откъс с разрешение от Benson DE, Conrad DW, de Lorimier RM, et al. 2001. Проектиране на биоелектронни интерфейси чрез използване на шарнирно-огъващи движения в протеините. Science, 293: 1641–4. Copyright 2001 © AAAS.

Тази индуцирана промяна на разстоянието, свързана с малтозата, води до намаляване на електрохимичните сигнали, зависещо от концентрацията, като по този начин осигурява начин малтозата да бъде електронно засечена. Показано е също така използването на този силно обобщен сензорен подход за откриване на различни аналити с група протеини или ензими, подложени на лиганд-свързващи индуцирани конформационни промени.

Ензим-базирани биосензори

Първите документирани някога биосензори са биосензори, базирани на глюкозооксидаза (GOD), създадени от Кларк и Лайънс през 1962 г. Хипергликемията, представляваща хронично повишена концентрация на кръвна глюкоза, е често срещана при захарен диабет. В резултат на това редовният контрол на концентрацията на глюкоза в кръвта е от съществено значение за пациентите с диабет. Ползата от електрохимията, съчетана с ензимна катализа, е този биосензор и неговите по-нови версии. Биосензорът на Кларк представлява електрод, имобилизиран с GOD Окислената форма на GOD взаимодейства с глюкозата в присъствието на глюкоза и произвежда глюконова киселина и редуциран GOD, като участват два електрона и два протона. Тъй като разтвореният кислород реагира с намален GOD, това глюкозно окисление също консумира кислород в разтвора, като по този начин произвежда водороден пероксид, окислява GOD и понижава кислородното налягане. В резултат на това чрез електрохимично засичане на кислород с кислороден електрод на Кларк, електродът може да открие глюкозата. Този вид сензор се счита за биосензор от „първо поколение“. Компанията Yellow Springs Instrument (Охайо, САЩ) предлага на пазара този биосензор от първо поколение през 70-те години.

Биосензорът от второ поколение замества естествено съществуващия субстрат кислород с малки изкуствени редокс молекули, които действат като редокс медиатори и обменят електрони между електроди и ензими. За да се подобри ефективността на сензора, тоест чувствителност и съотношение сигнал/шум, бяха използвани различни разтворими окислително-възстановителни молекули, като фероцен, тионин, метиленово синьо, метил виологен. Тези медиатори първоначално бяха разтворени в разтвор. Те получават електрони от електродите и след това, или обратно, тези електрони се пренасочват към редокс центъра на ензимите. Имобилизираните медиатори бяха предложени като стъпка напред, за да се подобрят безреагентните биосензори. Например, за водороден пероксид, Ruan et al през 1998 г. документират сензор в твърдо състояние без реагенти. Златните електроди първо бяха модифицирани с L-цистеин, а след това пероксидази от хрян (HRP) бяха свързани чрез глутаралдехид към аминовата група на цистеин, а тионинът беше свързан с ензима по същата химическа връзка. В резултат на това златният електрод беше имобилизиран както от ензима, така и от медиатора, който можеше да открие водороден пероксид в тествания разтвор без допълнително добавяне на реагент. Съществено предимство на тази конфигурация на биосензора е, че медиаторът е фиксиран върху повърхността на електрода, като по този начин се предотвратява проблема с дифузията.

Алтернативно решение, включващо използването на редокс полимери, беше посочено от Хелър и колеги. Първо, те приготвиха легиран полимер с Os²⁺ комплекс. Този тип полимер функционира като „молекулярна жица“ и обменя електрони между ензима и електрода. След това Os-полимерът и глюкозната оксидаза се коимобилизират върху въглеродния електрод, което генерира чувствителен отговор на присъствието на глюкоза. Те успяха да направят почти 100% имобилизирани ензимни молекули, които са електроактивни чрез използването на тези окислително-възстановителни полимери, което допринесе за много висока чувствителност на метод за откриване на глюкоза.

Комерсиализацията на ензимен биосензор от второ поколение беше доста успешна. През 1987 г. е създадена MediSense, който замества глюкозни сензори Exactech™. Този успех доведе до революция в здравеопазването за пациенти с диабет. Вместо да пътуват до болници, те могат да контролират концентрацията си на кръвна глюкоза у дома. Системите MediSense и по-късно амперометричните биосензорни системи се състоят от GOD покрити еднократни въжени електроди и медиатори (тест ленти) за еднократна употреба. Сензорът започва да функционира, когато капчица кръв е приложена към тест лентата и записва амперометричния отговор, който се трансформира в цифра, показана на дисплей, индикираща концентрацията на глюкоза.

Съвсем наскоро, проектирайки реконструиран GOD ензим, Xiao et al (2003) публикува ново поколение глюкозни биосензори. Те първо получиха апо-ГОД ензим, свободен от кофактора на флавин аденин динуклеотид (FAD), след което функционализираха и реконструираха 1,4-нм златна наночастица с FAD в апо-GOD. Чрез използване на дитиол монослой, такъв реконструиран ензим се свързва със златни електроди (Фигура 2). Те демонстрираха, че оборотът на електронен трансфер на този изкуствен ензим достига до 5000 s^-1, приблизително 8 пъти по-висок от нормалния ензим (700 s^-1). Златната наночастица в тази система служи като електронно реле за електрическото окабеляване на редокс центъра на ензима. В тази област, глюкозният биосензор, създаден от Xiao et al, представлява нов път, свободен от медиатори и силно чувствителен. Съвсем наскоро, използвайки въглеродни нанотръби с една стена (SWNTs) вместо златни наночастици, групата на Willner документира модифицирана версия на този сензор и постигна подобна ефективност. Въпреки че все още няма комерсиализация на тази технология, се очаква модерните биосензори да бъдат допълнително подобрени.

Фигура 2 – (А) Сглобяване на Au-NP-реконституиран GOx електрод чрез (a) адсорбция на Au-NP-реконституиран GOx към дитиолов монослой, свързан с Au-електрод и (b) адсорбцията на Au-NP, функционализирани с FAD, върху модифицирания дитиол Au електрод, последвано от възстановяване на апо-GOx върху функционалните NP (16). (B) STEM изображение на GOx, възстановено с Au-FAD хибриден NP. Стрелките показват Au клъстери. Откъс с разрешение от Xiao Y, Patolsky F, Katz E, et al. 2003. Включване в ензими: наносвързване на редокс ензими от златна наночастица. Science, 299: 1877–81. Copyright 2003 © AAAS.

Имунологичен биосензор

За да се идентифицират екологични или клинично важни цели, имунологичните биосензори зависят от силно специфична имунологична система, т.е. антитела и антигени. В действителност имунологичните биосензори са модерен вариант на ензимно-свързания имуносорбентен анализ (ELISA), с по-ниски разходи, увеличена скорост и удобство на обслужване и чувствителност, която е сравнима или дори по-висока.

Сред най-често срещаните са електрохимичните имунологични биосензори. Предлагат се два вида имунологични биосензори. Първо, електродът се имобилизира с улавящо антитяло, което улавя определен целеви антиген. Чрез вторично антитяло, маркирано с редокс молекули или ензими, се постига сигнална трансдукция. Второ, електродният антиген е имобилизиран, като открива специфични антитела.

Ju и колегите му създадоха амперометричен имунологичен биосензор за карциноембрионален антиген (CEA). Тионин и HRP-белязани CEA антитела се коимобилизират върху стъклен въглероден електрод, свързан с глутаралдехид. В разтвора, който е свързан с електродната реакция на тионина, HRP каталитично редуцира водороден пероксид, което води до катализиран сигнал. Редокс центърът на HRP беше частично блокиран чрез улавяне на CEA, което доведе до затихване на амперометричните сигнали.

Rusling и колеги наскоро се възползваха от SWNT, за да подобрят имунологичните биосензорни характеристики (Фигура 3).

Фигура 3 – Схематична диаграма на процедурата за анализ на сандвич HSA. Откъс с разрешение от Yu X, Kim SN, Papadimitrakopoulos F, et al. 2005. Протеинов имуносензор, използващ въглеродни нанотръби с една стена с електрохимично откриване на ензимни маркери. Mol Biosyst, 1: 70–8. Copyright 2003 © Royal Society of Chemistry.

Използвайки самосглобяващо се посредничество от метал, те проектираха вертикално подравнени масиви от SWNTs (SWNT гора) върху пиролитични графитни електроди. След това Anti-HSA, използвайки EDC/ NHS, беше ковалентно свързан с карбоксилираните краища на гората от SWNT. По-нататък електродът се инкубира с вторично HRP-белязано анти-HSA антитяло след свързване с HSA целта. Целта HSA в тестовия разтвор може да бъде идентифицирана въз основа на каталитичния сигнал на HRP за водороден прекис. Чувствителността на откриване, която беше около 1 nМ, беше значително подобрена чрез използването на SWNT гори. Това вероятно се дължи на подобрената реактивност на електронен трансфер на HRP, капсулиран в горите SWNT.

Един от най-подходящите клинични инструменти са имунологичните анализи. Въпреки това, съществуващите методи за анализ, като ELISA, изискват големи и скъпи инструменти, както и добре обучени специалисти. За разработването на евтини, миниатюризирани и компактни устройства, електрохимичните методи са добре адаптирани. В резултат на това е изключително желателно разработването на електрохимични имунологични биосензори, които да отговарят на полевия анализ и анализ на точката на употреба. Важно е да се спомене, че използването на еднократно отпечатани електроди може да бъде от решаващо значение за тази цел, сравнима с биосензорите за глюкоза. За да се извършат анализи с висока производителност (HTS), също е важно да се установят микрочипове на антитела, базирани на електрохимия.

ДНК биосензори

Наблюдава се огромен научен и технологичен интерес към идентифицирането на ДНК хибридизационни събития. Бързо нарастващият интерес към клинична диагностика, базирана на чипове, особено демонстрира това значение. Поради това през годините са разработени разнообразни техники, включително оптични, акустични и електронни подходи. През последните десетилетия флуоресцентното откриване доминира сред най-съвременните геносензори сред тях. Електрохимичните методи обаче, които се оказаха ефективни при прости химически видове, особено метални йони, привлякоха все по-голям интерес към приложенията за откриване на биологични видове.

Предимствата на електронната детекция включват: 1) електрохимичното откриване обикновено е евтино, като по този начин позволява високо чувствителен и бърз скрининг; 2) няколко електроактивни съединения, напр. металоцените, са стабилни и нечувствителни към околната среда, за разлика от флуорофорите, които често имат проблеми с „фото избелване“; 3) подходящият молекулярен дизайн и синтез, които генерират разнообразни производни, всеки със специфичен редокс потенциал; 4) бързо установената силициева индустрия проправи пътя за масово производство на интегрални схеми, правейки електронната детекция особено подходяща и съвместима с технологиите, базирани на микрочипове; 5) експоненциалният растеж на науката и технологиите на интерфейса разкри разгадани мистерии в прецизния контрол на повърхностните свойства, които са една от ключовите барикади в биоелектронните приложения.

При умерено приложени напрежения самата ДНК е електрохимично безшумна, докато се предвиждат значителни смущения при високи напрежения, които карат ДНК базите да се окисляват/ редуцират. Милън беше първият, който предложи секвенционно-селективно откриване на ДНК въз основа на показатели за електроактивна хибридизация, които осигуряват електронни сигнали и двойно и едноверижно ДНК разграничение. Детекциите от тип „сандвич“ бяха предложени в опит да се намали високият фон, получен от незначителното свързване на индикатори за хибридизация със сДНК. Въведена е ДНК верига, притежаваща електроактивен маркер, която да действа като сигнална молекула в допълнение към имобилизирана ДНК сонда. По същия начин, със сонди с наночастици, Парк и колеги през 2002 г. разработиха базирана на решетки електрическа ДНК детекция, която демонстрира висока чувствителност и селективност. Технология, базирана на относително високата окислителна активност на гуанин и неговото сътрудничество от екзогенни редокс катализатори, е разработена от Торп една година по-късно. Разграничението на ds/ ss се получава от факта, че гуанинът има относително ниска реактивност на електронен трансфер в дуплекси поради стеричния ефект. При откриването на PCR продукти, този метод е силно чувствителен, но относително беден при различаване на хибридизационни събития. Освен това този метод е възможен само на ITO повърхности досега, тъй като високият окислителен потенциал все още изключва използването на злато.

Въпреки напредъка, разработването на универсален (т.е. без реагент) сензор, който конкретно сигнализира за улавяне на целта, все още е много важно (т.е. избягване на по-нататъшното лечение със сигнални молекули или индикатори за хибридизация). Жизнеспособно средство за тази цел се осигурява от ДНК или РНК аптамери. Аптамерите са добре структурирана ДНК или РНК, които имат висок афинитет и селективност за определени цели, както и естествени ензими, като по този начин показват превъзходна стабилност спрямо крехките ензими. Те са много обещаващ инструмент за терапия и диагностика. Дотогава, за почти всяка дадена цел, добре развитата in vitru селекция успя да произведе аптамери. С оглед на тези предимства, олигонуклеотидните аптамери се предвиждат да бъдат биосензорните компоненти на следващото поколение. Лесна, организирана подобна на фиба ДНК с електроактивен маркер (електронна ДНК фиба) беше използвана от Fan и колеги като градивен елемент за определяне на хибридизационни събития (Фигура 4).

Фигура 4 – Олигонуклеотид на стеблов контур, притежаващ терминален тиол и фероценова група, се имобилизира на златен електрод чрез самосглобяване. При липса на цел, структурата на стволовия контур държи фероценовия маркер в непосредствена близост до повърхността на електрода, като по този начин осигурява бърз електронен трансфер и ефективен редокс на фероценовия маркер. При хибридизация с целевата последователност се наблюдава голяма промяна в окислително-редукционните токове, вероятно защото фероценовият маркер е отделен от повърхността на електрода. Откъс с разрешение от Fan C, Plaxco KW, Heeger AJ. 2003. Електрохимичен разпит на конформационни промени като безреактивен метод за специфично за последователността откриване на пикомоларна ДНК. Proc Natl Acad Sci U S A, 100: 9134–7. Copyright 2003 © Националната академия на науките на Съединените американски щати.

ДНК, подобна на фиба, беше невероятно завладяващ аптамер, който формира основата за разпознаване на хомогенна хибридизация на флуоресцентни „молекулярни маяци“. ДНК последователността е проектирана така, че при липса на цели, този „маяк“ е в близко състояние, докато бъде „включен“, когато достигне конкретната си генна цел. Наличието на конструкцията на стволовия контур в структурата предлага превключвател за включване/ изключване, както и строгост за диференциране спрямо несъответствието на единична ДНК хибридизация. Тиолиран край дава лепкав край на златната повърхност на тази електронна ДНК фиба, докато фероценовият маркер трансдуцира електронни сигнали в другия край. Първоначалната фиба локализира фероцена близо до повърхността на електрода, като по този начин позволява междуфазния електронен трансфер. След хибридизация, образуването на линейна дуплексна структура нарушава фибата и насилва фероцена и електрода. Тази значителна промяна на разстоянието (до няколко нм) ефективно блокира междуфазния електронен трансфер и води до намаляване на съответните електрохимични токови сигнали. Тази стратегия предлага възможност за идентифициране на 10 pМ ДНК цели. По-важното е, че такъв дизайн се възползва от интегрирането в рамките на една повърхностно ограничена структура на фиба на улавящата част (последователност на сондата) и сигналната част (електроактивни видове). За разлика от повечето предложени по-рано твърдо-телни ДНК сензори, този дизайн следователно е ефективен без реагенти, т.е. това осигурява основата за разработването на преносим, непрекъснат ДНК анализатор, който може да бъде полезен за медицински и военни приложения.

Като двойна спирала на ДНК беше предложена среда за електронен трансфер (ET) на дълги разстояния чрез нейното базово подреждане. Въпреки че този въпрос се обсъжда дълго време, Бартън и колеги са доказали електрохимично, че добре ориентираните златни електродни ДНК филми позволяват електронен трансфер на голям обсег и че такъв ЕТ е силно чувствителен към основни подреждания като несъответствия. Те откриха, че електроактивните интеркалатори като метиленово синьо (MB) могат ефективно да бъдат намалени чрез напълно съвпадащ ДНК-дуплекс-модифициран електрод. Съществуването на само едно несъответствие обаче превръща подобната на тел ET среда в изолатор, като напълно нарушава ET между MB и електрода. Чрез циклични волтаметрични или кулометрични анализи, които са в основата на сензор за бърз скрининг на ДНК мутация, такава разлика може лесно да бъде прочетена. Бартън и колеги също демонстрираха, че електрокатализата може да подобри чувствителността на тази стратегия. В разтвор добавянето на ферицианид постоянно извлича електрони от електрохимично редуциран MB, усилвайки електронния поток през двойната спирала на ДНК. Това помага за откриване на ~ 108 молекули ДНК с 30-μм електрод. Те също така са разработили ДНК-базирани сензори за откриване на ДНК-свързващи протеини паралелно с откриването на ДНК. Смята се, че някои ДНК-свързващи протеини или ензими взаимодействат с двойката основи на ДНК, трансформирайки двойната спирала на ДНК от ефективни ET проводници в изолатори. Те установиха чувствителен начин за електрическо изследване на различни ДНК-свързващи протеини въз основа на сравнимата сензорна стратегия. От решаващо значение е, че тези сензори разграничават успешно протеините, които се свързват с ДНК, но те не нарушават подреждането на основите. Това със сигурност потвърждава, че прекъсването на сигнала при свързване с протеини се дължи на промяната на ET средата, имаща отношение към подреждането на основата.

Бъдещето на клиничните биосензори

Въпреки бързото подобрение в развитието на биосензорите, клиничните приложения на биосензорите все още са редки, с изключение на глюкозният апарат. Това е в пряк контраст с критичната необходимост от тестване на място в малките клиники. Предполагаме, че долупосочените спецификации са от значение.

Първо, висока чувствителност: Подобряването на чувствителността е непрекъснат приоритет в развитието на биосензорите. Ясно е, че критерият за чувствителност варира при всеки отделен случай. Например, тъй като нивата на глюкоза са високи в кръвта, човек не се нуждае от много висока чувствителност за откриване на глюкоза. Това е основна част от причината, поради която глюкозните апарати са успешни. Въпреки това, в много ситуации, за да се отговори на изискванията на молекулярната диагностика и детекцията на патогени, е много важно да се установят високочувствителни биосензори с оптимално едномолекулно детектиране.

Второ, висока селективност: При прилагането на биосензори това може да е значителна пречка. Повечето от биосензорите, споменати в литературата, функционират много добре в лабораториите, но в реални тестови проби редица проблеми могат да бъдат открити. В резултат, за да се предотврати неспецифична повърхностна адсорбция, е важно да се установят нови подходи за модификация на повърхността.

Трето, мултиплексирането е от решаващо значение за спестяване на времето за анализ, което е особено важно за лабораторните или клиничните анализи. Ето защо е важно да се създадат масиви от електроди с висока плътност, както и електрохимични инструменти, които могат да провеждат голям брой анализи едновременно.

Четвърто, за да се увеличи преносимостта, е от съществено значение да се създадат миниатюризирани биосензори, като по този начин се удовлетворят изискванията на тестването на място.

Пето, уместно е да се интегрира и силно автоматизира идеален биосензор. Решение на тази цел се предлага от съвременните технологии на лаборатория върху чип (микрофуидици). Можем да очакваме всички тези функции да бъдат интегрирани в успешните биосензори в бъдеще и да могат лесно да откриват малките цели за кратък период от време.

Проекти за биочипове: Дизайн и експлоатация

Терминът „биочип“ придоби няколко значения. Всяко устройство или компонент, въвеждащи биологични материали, извлечени от биологични видове или синтезирани в лаборатория върху твърд субстрат, могат да се считат за биочип в най-общия смисъл. На практика обаче, както миниатюризациите, обикновено във формат на микрочипове, така и възможността за евтино масово производство, често участват в биочипове. Електронният чип за нос или изкуствен нос, електронният език, чипът за полимеразна верижна реакция, микрочипът на ДНК микрочипове (генен чип), протеиновият чип и биохимичната лаборатория върху чип са някои примери, които отговарят на тези квалификации. В генният чип и протеиновият чип са направени най-динамичните биочип изследвания.

Много внимание е отделено по-специално на биочипове, интегриращи конвенционална биотехнология с полупроводникова обработка, микро-електро-механични системи (MEMS), оптоелектроника и цифрово получаване и обработка на сигнали и изображения.

Обикновено се предполага, че хиляди гени и техните производни (т.е. РНК и протеини) в даден жив организъм действат по сложен и координиран начин, който създава мистерията на живота. Традиционните методи в молекулярната биология обаче обикновено работят на база „един ген в един експеримент“, което предполага, че пропускателната способност е много ограничена и е трудно да се постигне „цялостната картина“ на генната функция. Нова технология, наречена ДНК микрочип, спечели значително внимание сред биолозите през последните десетилетия. Тази технология има за цел да измери целия геном на един чип, така че междувременно изследователите да могат да получат по-добра картина на взаимодействията между хиляди гени.

Генен или ДНК чип съответства на двуизмерен масив от малки реакционни клетки (100 х 100 μм всяка), произведени с помощта на високоскоростна роботика върху твърд субстрат. Силициева пластина, тънък лист стъкло, пластмаса или найлонова мембрана може да бъде твърдият субстрат. Трилиони полимерни молекули от определена последователност от едноверижни ДНК фрагменти се имобилизират във всяка реакционна клетка (Фигура 5).

Фигура 5 – Схематична илюстрация на генен чип

ДНК фрагментите могат да бъдат или къси (около 20 до 25) базови последователности (A, T, G и C) или по-дълги комплементарни ДНК вериги (кДНК). Във всяка клетка уникалната последователност от бази (напр. CTATGC …) е предварително избрана или конфигурирана в зависимост от очакваната употреба. Сондите се наричат още разпознати последователности на едноверижни ДНК фрагменти, имобилизирани върху субстрата. Двуверижни ДНК фрагменти се образуват, когато неизвестни фрагменти от едноверижни ДНК проби, наречени мишена, реагират (или хибридизират) със сондите на чипа, където мишената и сондата се допълват според правилото за комплементарност (А е сдвоена с T и G е сдвоена с C). Целевите проби често са белязани, например с флуоресцентни съединения, багрила или радиоизотопни молекули, за да се улесни диагностиката или анализът на хибридизирания чип. Всеки е маркериран със собствен различим маркер, когато целите съдържат повече от един тип проба. Този тип ДНК микрочипове осигурява платформа, при която, въз основа на размера на масива, неизвестната цел или цели могат теоретично да бъдат дефинирани с много висока скорост и висока производителност чрез съпоставяне на компонентите, участващи в изследванията и развитието на технологията на биочип с десетки хиляди различни видове сонди чрез паралелна хибридизация и свързаните технически дисциплини са посочени на Фигура 6. По принцип биочип технологията е интердисциплинарна; важно е учените и инженерите от различни дисциплини да си сътрудничат синергично, за да прокарат тази нова технология от лабораторен интерес към практически устройства и системи.

Фигура 6 – Компонентите и свързаните с тях технически дисциплини, участващи в научноизследователската и развойна дейност на биочип технологията

ДНК микрочипове

По отношение на свойството на масивната ДНК последователност с известна идентичност, има два варианта на ДНК микрочип технологията:

Тип I: сонда кДНК (с дължина 500 ~ 5000 бази) се имобилизира с помощта на робот, поставен чрез зацапване върху твърда повърхност като стъкло и се излага или поотделно, или в смес на набор от цели. Известно е, че тази стратегия, „традиционно” наричана ДНК микрочип, е разработена в Станфордския университет.

Тип II: in situ (върху чип) или чрез конвенционален синтез, придружен от имобилизация на чипа, се синтезира масив от олигонуклеотидни (20 ~ 80-мерни олиго) или пептидни нуклеинови киселини (ПНК) сонди. Масивът е изложен на хибридизирана, маркирана ДНК на пробата и определя идентичността /изобилието от комплементарни последователности. Този метод, „исторически” наречен ДНК чипове, е създаден в Affymetrix INC., която продава своите фотолитографски произведени продукти под търговската марка Genechip. Чиповете на основата на олигонуклеотид са разработени от няколко компании, използващи алтернативни in-situ технологии за синтез или отлагане.

В зависимост от вида на имобилизираната молекула, биочипът се прави предимно в два формата. Масивите кДНК се означават също като биочипове, съдържащи PCR продукти от 200 базови двойки до 2KB размер, имобилизирани по дължината на молекулата чрез ковалентно кръстосано свързване към повърхността на масива. Алтернативно, олигонуклеотидните сонди могат или да бъдат синтезирани in situ върху масива, или ковалентни връзки към крайните части могат да бъдат фиксирани от предварително синтезирани олигосистеми. Genechip технологията включва няколко различни части, като производство, подготовка на проби и хибридизация на целевата последователност, детектиране на резултати от хибридизацията, дизайн на олигонуклеотидната сонда и анализ на изображението на хибридизацията и различни приложения, както се вижда на Фигура 7.

Фигура 7 – Няколко важни аспекта, свързани с технологията на генетичен чип

Първо, според конкретна цел, много подходящи генни последователности ще бъдат избрани от базата данни на ДНК (единичен нуклеинов полиморфизъм за специфични гени, диференциална експресия за дадена група гени или идентификация на мутация). Чрез определяне на последователността и дължината на всяка сонда и нейното точно положение върху чипа, ще бъдат проектирани серия уникални олигонуклеотидни сонди въз основа на избраните последователности. С метода на зацапване или синтеза върху чипа може да се извърши синтез на ДНК микрочип. Обикновено целевите гени са необходими за усилване и маркиране на флуоресценцията. В повечето случаи ще е необходим избор на подходящи PCR праймери, оптимизиране на условията на амплификация и хибридизация. За резултатите от хибридизацията на генетичен чип има няколко различни стратегии за откриване. Традиционен подход е флуоресцентната детекция. За обработката на толкова голямо количество, получено от генетичен чип, е необходим анализ на данни, базиран на флуоресцентни изображения и конфигурация на базата данни. Използването на PCR продукти, съответстващи на гените като сондови молекули, е често срещана платформа за получаване на микрочипове. Биологичните източници на кДНК библиотеки предлагат ефективен шаблон за PCR амплификация на сондите. Следователно тази платформа се нарича кДНК масиви.

Използването на олигонуклеотидни сонди вместо PCR продукти има няколко предимства. Първо, те обикновено са с подобна дължина и могат да бъдат създадени по такъв начин, че да имат сходни свойства на хибридизация. Второ, те могат да бъдат конфигурирани да хибридизират срещу специфичния генен регион; PCR продуктът също позволява кръстосана хибридизация между хомоложни гени, смущаващи членове на профилите на генната експресия на едно и също генно семейство. Освен това, необходимостта от досадно PCR усилване на молекулите на сондата се елиминира от олигонуклеотидни масиви и намалява риска от грешка поради обработка на клонинги и замърсяване по време на трансфера.

Микрофлуиден чип

През последните десетилетия микрофлуидната технология се развива бързо и осигурява множество приложения в науките за живота. Благодарение на отделните предимства, осигурени от миниатюризацията на системата, се появи революцията на микрофлуидиците, включително висока аналитична ефективност, повишена чувствителност, подобрена аналитична ефективност, бързо умножаване на паралелизацията, способност за управление и обработка на намалени обеми на реагенти и драстично намалени инструментални отпечатъци.

Микрофлуидите може едновременно да предлагат аналитична ефективност и висока производителност като технология за миниатюризация, без липсата на точност и автоматизация. Микрофлуидната технология е не само мощен инструмент за бърз скрининг и изследване на разработването на лекарства по време на процеса на прилагането им, но и за нейните миниатюризирани устройства за намаляване на разходите и консумацията на реагент.

През последните няколко години беше постигнат значителен напредък в разработването на компоненти и системи за скрининг на лекарства, базирани на микрофлуиди. За скрининг на лекарства се използват различни видове микрофлуидни чипове за подобряване на ефективността на скрининга и намаляване на разходите. Няколко често срещани типа чип технологии са описани в следващите параграфи (Фигура 8).

Фигура 8 – Приложение на микрофлуиден чип при скрининг на лекарства. (А) Илюстрация на анализ на комбинация от лекарства в системата от капчици, при която клетките в капчиците са били последователно стимулирани от две лекарства; (Б) Човешки рак на гърдата върху чип, вляво е диаграма на дуктален карцином in situ (DCIS), вграден в млечния канал, а вдясно е възпроизвеждане на микроустройство на микроархитектурата на DCIS и околните тъканни слоеве; (В) Различни концентрации на сенсибилизатор и лекарство се генерират последователно в дифузионните градиентни смесители последователно към перфузионните клетки, култивирани в микрокамери надолу по веригата; (Г) Проектиране и дизайн на чип на мозъчен рак, който съдържа схема на слоевете, протокол за време за подготовка на чипове, канална система с форма на коледно дърво и финално хидрогелно устройство с микроканали и микроямки.

Капкови микрофлуиди – За да се извършват експерименти в непрекъснат или сегментиран поток, капковата микрофлуидна технология използва течни капчици, разделени от несмесваща се течност като нанолитър, за да отделят пиколитърните реакционни съдове. Такива методи показват значителни предимства, като намалено използване на пробата, подобрена скорост на реакция и повишена ефективност и възпроизводимост, обработка на невероятно малки обеми със стабилен контрол на състава.

Въз основа на последователният процес на капковата техника, капкови микрофлуидни методи могат да бъдат използвани за скрининг на лекарствени комбинации (Фигура 8А), за скрининг на различни комбинации за дозиране и продължителност на приложение и за усъвършенстване на оптималния минимално консумиран режим на дозиране, който е важен за комбинирани болестни ситуации.

Орган-върху-чип – Подробното регулиране на микромащабната структура и поток позволява прецизното моделиране на микромащабните структури на органната тъкан. Органите-върху-чипове са биомиметични системи, които са микроинженерни и представляват основни функционални единици на живите човешки органи. Досега функциите на множество органи и тъкани, като черния дроб, бъбреците, белите дробове и червата, са възпроизведени като in vitro модели. Тези системи могат да се използват като in vitro модели, които позволяват да се симулират и фармакологично модулират сложни биологични процеси.

Органният чип симулира основните процеси на човешкото тяло, като използва редица клетки, за да създаде биомиметичен чип със сходни физиологични функции върху уникалната структура на чипа, който е сравним с действителната външна среда на заболяването в сравнение с типичния модел на едноклетъчна култура.

За да се възпроизведе сложната микроархитектура на раковата тъкан, е създадена микросистема, която позволява съвместно култивиране на туморни сфероиди на гърдата със съседни клетки в компартментализирана 3D микрофлуидна система, за да помогне за създаването на платформа за скрининг на лекарства срещу рак на гърдата (Фигура 8Б). За изследване на миграцията на ракови клетки и скрининг на противоракови лекарства може да се използва ко-култура с множество тъкани с микрофлуидна система.

Други микрофлуидни чипове за скрининг на лекарства – Има няколко други технологии, прилагани към микрофлуидни чипове за скрининг на лекарства, в допълнение към гореспоменатите съществуващи методи, които разширяват идеите на изследователите. Най-значимият и интегриран аспект на разработването на лекарства в повечето фармацевтични и няколко биотехнологични индустрии по света е изключителната HTDS система.

С използването на микрофлуидни масивни системи с отворен достъп и клетъчни микрочипове могат да се проверят различни концентрации и комбинации от лекарства. Различни конфигурации и масиви от малки културни камери могат да бъдат генерирани от различен дизайн на чипа. Генераторите на градиентна концентрация могат да осигурят ефективен градиент на концентрация на течност и тези устройства са внедрени и комбинирани с микрофлуидни технологии от няколко изследователски групи за оптимизиране на HTDS системи. Дифузионните микрофлуидни смесители на Фигура 8В също могат да разпознаят напълно автоматичен HTDS.

Платформите за клетъчни масиви са изградени с използване на полидиметилсилоксанов (PDMS) материал в определени микрофлуидни канали за скрининг на лекарства. Структурата на чиповете обаче е трудна и има някои недостатъци, като скъпи силициеви форми и биомолекулярна абсорбция. Като естествен извънклетъчен матрикс (ECM), поли (етилен гликол) диакрилат (PEGDA) хидрогел има идентични механични свойства и водно съдържание. Микрофлуидните хидрогелове PEGDA са често използвани за капсулиране на клетки и са пропускливи за съединения като вода, биомолекули и химикали. За да се изследва ефекта на комбинаторно лечение на две лекарства, бяха използвани микрофлуидни устройства, изработени от тези видове материали и комбинирани с 3D технологии за култура на мозъчни клетки (Фигура 8Г).

Привлекателността на микрофлуидния чип е, че за да изпълнява различни функции, той може да има множество проектирани структури и може да се комбинира, за да разшири обхвата си на приложение с различни устройства и оборудване за тестване. Необходими са обаче значителни усилия за проектиране, производство и оптимизация. Всеки модел има свои уникални характеристики. Използва се не само за скрининг на лекарства, но и за тестване на лекарства.

Протеинов микрочип

При изследването на протеините, протеиновите микрочипове са полезни инструменти по безпристрастен, високопроизводителен начин, тъй като позволяват паралелно да се характеризират до хиляди индивидуално пречистени протеини. Приспособимостта на тази технология е позволила да се използва в широк спектър от приложения, включително изследване на молекулярни взаимодействия с протеоми, анализ на посттранслационни промени, откриване на нови лекарствени цели и оценка на взаимодействията патоген-гостоприемник. В допълнение, технологията вече се оказа ефективна при профилиране на специфичността на антителата, както и при идентифициране на нови биомаркери за автоимунни заболявания и в частност рак.

Протеините са сложни биомолекули с широк спектър от структури и функции и като такива изучаването им по начин с висока производителност е предизвикателство. Съществуват три основни типа протеинови микрочипове: функционална, аналитична и обратна фаза. Функционалните протеинови микрочипове се сглобяват по начин с висока проходимост с пречистени /синтезирани протеини, което позволява да се изследват стотици и дори хиляди различни протеини паралелно с техните биохимични свойства. За да се открият или измерват сложни биологични проби, аналитичните протеинови микрочипове използват афинитетни реагенти, имобилизирани върху масива. И накрая, сложни биологични проби, имобилизирани върху масива, се използват от протеинови микрочипове с обратна фаза, които използват афинитетни реагенти за идентификация.

Функционалните протеинови микрочипове са по-способни да идентифицират слаби взаимодействия, по-гъвкави са за протеини с ниско съдържание на изобилие и по-способни да анализират сурови проби като серум в сравнение с други методи, като масова спектрометрия. По отношение на разликите в покритието на протеоми, дължините на протеините и производствените канали, до момента са произведени няколко различни типа функционални протеинови микрочипове.

Развитие на Функционалния Протеинов Микрочип – Целият набор от протеини, които могат да бъдат експресирани от даден геном, се означава като протеом. Обикновено създаването на пречистен протеомен микрочип изисква сглобяването на цял геномен набор от отворени рамки за четене (ORF), клонирани в експресионен вектор, кодирана протеинова експресия в клетките, високопроизводително индивидуално пречистване на протеини и протеинова имобилизация върху микрочип.

Приложение на дрождеви протеомни микрочипове – За профилиране на протеомни широкомолекулни взаимодействия, функционалните протеинови микрочипове, особено пречистени протеомни микрочипове, са полезни и позволяват подробен, обективен скрининг. Изследователите са използвали функционални протеинови микрочипове при фундаментални изследвания за изучаване на протеин-протеинови взаимодействия, протеин-липидни взаимодействия, протеин-ДНК взаимодействия, протеин-клетки /лизати, свързване на малки молекули, взаимодействия протеин-РНК и PTMs, като ацетилиране, SUMOилация, гликозилиране, убиквитилиране, фосфорилиране и метилиране (Фигура 9А-9Ж). Ние обобщаваме представителни проучвания в таблица I въз основа на приложенията за изследвания, показани на Фигура 9.

Фигура 9 – Приложение на функционален протеинов микрочип. Приложенията на функционални протеинови микрочипове за разпитване на свойствата на свързване с протеини включват A-протеин-протеинови взаимодействия; Б-протеин-липидни взаимодействия; В-протеин-клетъчни /лизатни взаимодействия; Г-свързване с малка молекула; Д-взаимодействия ензим-субстрат; Е-взаимодействия протеин-ДНК; Ж-протеин-РНК взаимодействия; З-Специфичност на антитела /Серумно профилиране. PTM пост-транслационна модификация.

Приложения на биочипове

Най-новите приложения на биочипове са включени в Таблица 1.


Биочип в храната	Биочип, откриващ генетично модифицирани организми (gmo’s) в храната.
Биочип в диагностиката	ДНК биочип, който революционизира начина, по който медицинската професия извършва тестове за кръв.
Биочип при епидемия от туберкулоза	Биочип технологията се очаква да помогне в борбата с новия сорт устойчиви на лекарства щамове на болестта.
Биочип при рак	Биосензор чип технологията осигурява бърз и лесен достъп до критична информация относно увреждане на ДНК от съединения, произвеждащи рак и подпомага ранно откриване на рак на дебелото черво.
Биочип в разработването на лекарства	ДНК чипове, които откриват генетични разлики между хората, които реагират на лекарството и тези, които не го правят, започвайки от фаза II или в средния етап на клиничните изпитвания.

Препратки

Adams DA, Brus L, Chidsey CED, et al. 2003. Charge transfer on the nanoscale: current status. J Phys Chem B, 107: 6668-97.
Ashley GW, Henise J, Reid R, et al. 2013. Hydrogel drug delivery system with predictable and tunable drug release and degradation rates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110: 2318–2323.
Bard AJ, Faulkner LR. 2001. Electrochemical Methods. New York: John W Willey & Sons.
Benson DE, Conrad DW, de Lorimier RM, et al. 2001. Design of bioelectronic interfaces by exploiting hinge-bending motions in proteins. Science, 293:1641–4.
Boon EM, Ceres DM, Drummond TG, et al. 2000. Mutation detection by electrocatalysis at DNA-modified electrodes. Nature Biotech, 18:1096–100.
Boon EM, Livingston AL, Chmiel NH, et al. 2003. DNA-mediated charge transport for DNA repair. Proc Natl Acad Sci U S A, 100:12543–7.
Boon EM, Salas JE, Barton JK. 2002. An electrical probe of protein-DNA interactions on DNA-modiﬁed surfaces. Nat Biotechnol, 20:282-6.
Brazill SA, Kim PH, Kuhr WG. 2001. Capillary gel electrophoresis with sinusoidal voltammetric detection: A strategy to allow four-“color” DNA sequencing. Anal Chem, 73:4882–90.
Burgstaller P, Girod A, Blind M. 2002. Aptamers as tools for target prioritization and lead identification. Drug Discov Today, 7:1221–8.
Choi Y, Hyun E, Seo J, et al. 2015. A microengineered pathophysiological model of early-stage breast cancer. Lab Chip, 15: 3350–3357.
Cooper MA, Dultsev FN, Minson T, et al. 2001. Direct and sensitive detection of a human virus by rupture event scanning. Nature Biotechnol, 19:833–7.
Dai Z, Yan F, Yu H, et al. 2004. Novel amperometric immunosensor for rapid separation-free immunoassay of carcinoembryonic antigen. J Immuno Methods, 287:13–20.
Das, H.K. 2005. “Functional Gernomics using Microarrays Technology.” Text book of Biotechnology, pp .1276-1288, Wiley Dreamtech Publisher.
Drummond TG, Hill MG, Barton JK. 2003. Electrochemical DNA sensors. Nat Biotechnol, 21:1192–9.
Fan C, Plaxco KW, Heeger AJ. 2003. Electrochemical interrogation of conformational changes as a reagentless method for the sequence-speciﬁc detection of picomolar DNA. Proc Natl Acad Sci U S A, 100:9134–7.
Fan C, Plaxco KW, Heeger AJ. 2005. Biosensors based on binding-modulated donor-acceptor distances. Trends Biotechnol, 23:186–92.
Fan Y, Nguyen DT, Akay Y, et al. 2016. Engineering a brain cancer chip for high-throughput drug screening. Sci. Rep., 6: 25062.
Fritz J, Cooper EB, Gaudet S, et al. 2002. Electronic detection of DNA by its intrinsic molecular charge. Proc Natl Acad Sci U S A, 99:14142–6.
Gao Z, Binyamin G, Kim H-H, et al. 2002. Electrodeposition of redox polymers and co-electrodeposition of enzymes by coordinative crosslinking. Angew Chem Int Ed, 41:810–13.
Gaylord BS, Heeger AJ, Bazan GC. 2002. DNA detection using watersoluble conjugated polymers and peptide nucleic acid probes. Proc Nat Acad Sci U S A, 99:10954.
Grifﬁths AD, Tawﬁk DS. 2000. Man-made enzymes – from design to in vitro compartmentalisation. Curr Opin Biotech, 11:338–53.
Heeger AJ. 2000. Nobel Lecture: Semiconducting and Metallic polymers: The fourth generation of polymeric materials [online]. URL: http:// wwwnobelse.
Hook F, Ray A, Norden B, et al. 2001. Characterization of PNA and DNA immobilization and subsequent hybridization with DNA using acoustic- shear-wave attenuation measurements. Langmuir, 17:8305–12.
Hsiung LC, Chiang CL, Wang CH, et al. 2011. Dielectrophoresis-based cellular microarray chip for anticancer drug screening in perfusion microenvironments. Lab Chip, 11: 2333–2342.
Li Z, Su W, Zhu Y, et al. 2017. Drug absorption related nephrotoxicity assessment on an intestine-kidney chip. Biomicrofluidics, 11: 034114.
Lin D, Li P, Lin J, et al. 2017. Orthogonal screening of anticancer drugs using an open-access microfluidic tissue array system. Anal. Chem., 89: 11976–11984.
Liu J, Zhang Y, Jiang M, et al. 2017. Electrochemical microfluidic chip based on molecular imprinting technique applied for therapeutic drug monitoring. Biosens. Bioelectron., 91: 714–720.
Moore CD, Ajala O.Z, Zhu H. 2016. Applications in high-content functional protein microarrays. Curr. Opin. Chem. Biol., 30: 21–27.
Palecek E, Jelen F. 2002. Electrochemistry of nucleic acids and development of DNA sensors. Crit Rev Anal Chem, 32:261–70.
Palecek E. 2004. Surface-attached molecular beacons light the way for DNA sequencing. Trends Biotechnol, 22:55–8.
Park SJ, Taton TA and Mirkin CA. 2002. Array-based electrical detection of DNA with nanoparticle probes. Science, 295:1503–6.
Patolsky F, Lichtenstein A, Willner I. 2001. Detection of single-base DNA mutations by enzyme-ampliﬁed electronic transduction. Nature Biotech, 19:253–7.
Patolsky F, Weizmann Y, Wilner I. 2004. Long-range electrical contacting of redox enzymes by SWCNT connectors. Angew Chem Int Ed, 43:2113–17.
S. Mi, Z. Du, Y. Xu, et al. 2016. Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening. Sci. Rep., 6: 35544.
Schuster GB. 2000. Long-range charge transfer in DNA: transient structural distortions control the distance dependence. Acc Chem Res, 33:253-60. Sullivan CKO. 2002. Aptasensors–the future of biosensing? Anal Bioanal Chem, 372:44–8.
Stone HA, Stroock AD, Ajdari A. 2004. Engineering ﬂows in small devices: microﬂuidics toward a lab-on-a-chip. Annu. Rev. Fluid Mech., 36: 381–411.
Sugiura S, Hattori K, Kanamori T. 2010. Microfluidic serial dilution cell-based assay for analyzing drug dose response over a wide concentration range. Anal. Chem., 82: 8278–8282.
Taton TA, Mirkin CA, Letsinger RL. 2000. Scanometric DNA array detection with nanoparticle probes. Science, 289:1757–60.
Thorp HH. 2003. Reagentless detection of DNA sequences on chemically modiﬁed electrodes. Trends Biotechnol, 21:522–4.
Umek RM, Lin SW, Vielmetter J, et al. 2001. Electronic detection of nucleic acids–A versatile platform for molecular diagnostics. J Mol Diag, 3:74–84.
Van Hove AH, Antonienko E, Burke K, et al. 2015. Temporally tunable, enzymatically responsive delivery of proangiogenic peptides from poly (ethylene glycol) hydrogels. Adv. Healthc. Mater., 4: 2002–2011.
Whitesides GM, Grzybowski B. 2002. Self-assembly at all scales. Science, 295:2418–21.
Willner I. 2002. Biomaterials for sensors, fuel cells, and circuitry. Science, 298:2407.
Wosnick JH, Swager TM. 2000. Molecular photonic and electronic circuitry for ultra-sensitive chemical sensors. Curr Opin Chem Biol, 4:715–20.
Xiao Y, Patolsky F, Katz E, et al. 2003. Plugging into enzymes: nanowiring of redox enzymes by a gold nanoparticle. Science, 299:1877–81.
Xu H, Wu H, Huang F, et al. 2005. Magnetically assisted DNA assays: High selectivity using conjugated polymers for ampliﬁed ﬂuorescent transduction. Nucleic Acids Res, 33:e83.
Yu CJ, Wan YJ, Yowanto H, et al. 2001. Electronic detection of single-base mismatches in DNA with ferrocene-modiﬁed probes. J Am Chem Soc, 123:11155–61.
Yu X, Kim SN, Papadimitrakopoulos F, et al. 2005. Protein immunosen- sor using single-wall carbon nanotube forests with electrochemical detection of enzyme labels. Mol Biosyst, 1:70–8.

Adams DA, Brus L, Chidsey CED, et al. 2003. Charge transfer on the nanoscale: current status. J Phys Chem B, 107: 6668-97.
Ashley GW, Henise J, Reid R, et al. 2013. Hydrogel drug delivery system with predictable and tunable drug release and degradation rates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110: 2318–2323.
Bard AJ, Faulkner LR. 2001. Electrochemical Methods. New York: John W Willey & Sons.
Benson DE, Conrad DW, de Lorimier RM, et al. 2001. Design of bioelectronic interfaces by exploiting hinge-bending motions in proteins. Science, 293:1641–4.
Boon EM, Ceres DM, Drummond TG, et al. 2000. Mutation detection by electrocatalysis at DNA-modified electrodes. Nature Biotech, 18:1096–100.
Boon EM, Livingston AL, Chmiel NH, et al. 2003. DNA-mediated charge transport for DNA repair. Proc Natl Acad Sci U S A, 100:12543–7.
Boon EM, Salas JE, Barton JK. 2002. An electrical probe of protein-DNA interactions on DNA-modiﬁed surfaces. Nat Biotechnol, 20:282-6.
Brazill SA, Kim PH, Kuhr WG. 2001. Capillary gel electrophoresis with sinusoidal voltammetric detection: A strategy to allow four-“color” DNA sequencing. Anal Chem, 73:4882–90.
Burgstaller P, Girod A, Blind M. 2002. Aptamers as tools for target prioritization and lead identification. Drug Discov Today, 7:1221–8.
Choi Y, Hyun E, Seo J, et al. 2015. A microengineered pathophysiological model of early-stage breast cancer. Lab Chip, 15: 3350–3357.
Cooper MA, Dultsev FN, Minson T, et al. 2001. Direct and sensitive detection of a human virus by rupture event scanning. Nature Biotechnol, 19:833–7.
Dai Z, Yan F, Yu H, et al. 2004. Novel amperometric immunosensor for rapid separation-free immunoassay of carcinoembryonic antigen. J Immuno Methods, 287:13–20.
Das, H.K. 2005. “Functional Gernomics using Microarrays Technology.” Text book of Biotechnology, pp .1276-1288, Wiley Dreamtech Publisher.
Drummond TG, Hill MG, Barton JK. 2003. Electrochemical DNA sensors. Nat Biotechnol, 21:1192–9.
Fan C, Plaxco KW, Heeger AJ. 2003. Electrochemical interrogation of conformational changes as a reagentless method for the sequence-speciﬁc detection of picomolar DNA. Proc Natl Acad Sci U S A, 100:9134–7.
Fan C, Plaxco KW, Heeger AJ. 2005. Biosensors based on binding-modulated donor-acceptor distances. Trends Biotechnol, 23:186–92.
Fan Y, Nguyen DT, Akay Y, et al. 2016. Engineering a brain cancer chip for high-throughput drug screening. Sci. Rep., 6: 25062.
Fritz J, Cooper EB, Gaudet S, et al. 2002. Electronic detection of DNA by its intrinsic molecular charge. Proc Natl Acad Sci U S A, 99:14142–6.
Gao Z, Binyamin G, Kim H-H, et al. 2002. Electrodeposition of redox polymers and co-electrodeposition of enzymes by coordinative crosslinking. Angew Chem Int Ed, 41:810–13.
Gaylord BS, Heeger AJ, Bazan GC. 2002. DNA detection using watersoluble conjugated polymers and peptide nucleic acid probes. Proc Nat Acad Sci U S A, 99:10954.
Grifﬁths AD, Tawﬁk DS. 2000. Man-made enzymes – from design to in vitro compartmentalisation. Curr Opin Biotech, 11:338–53.
Heeger AJ. 2000. Nobel Lecture: Semiconducting and Metallic polymers: The fourth generation of polymeric materials [online]. URL: http:// wwwnobelse.
Hook F, Ray A, Norden B, et al. 2001. Characterization of PNA and DNA immobilization and subsequent hybridization with DNA using acoustic- shear-wave attenuation measurements. Langmuir, 17:8305–12.
Hsiung LC, Chiang CL, Wang CH, et al. 2011. Dielectrophoresis-based cellular microarray chip for anticancer drug screening in perfusion microenvironments. Lab Chip, 11: 2333–2342.
Li Z, Su W, Zhu Y, et al. 2017. Drug absorption related nephrotoxicity assessment on an intestine-kidney chip. Biomicrofluidics, 11: 034114.
Lin D, Li P, Lin J, et al. 2017. Orthogonal screening of anticancer drugs using an open-access microfluidic tissue array system. Anal. Chem., 89: 11976–11984.
Liu J, Zhang Y, Jiang M, et al. 2017. Electrochemical microfluidic chip based on molecular imprinting technique applied for therapeutic drug monitoring. Biosens. Bioelectron., 91: 714–720.
Moore CD, Ajala O.Z, Zhu H. 2016. Applications in high-content functional protein microarrays. Curr. Opin. Chem. Biol., 30: 21–27.
Palecek E, Jelen F. 2002. Electrochemistry of nucleic acids and development of DNA sensors. Crit Rev Anal Chem, 32:261–70.
Palecek E. 2004. Surface-attached molecular beacons light the way for DNA sequencing. Trends Biotechnol, 22:55–8.
Park SJ, Taton TA and Mirkin CA. 2002. Array-based electrical detection of DNA with nanoparticle probes. Science, 295:1503–6.
Patolsky F, Lichtenstein A, Willner I. 2001. Detection of single-base DNA mutations by enzyme-ampliﬁed electronic transduction. Nature Biotech, 19:253–7.
Patolsky F, Weizmann Y, Wilner I. 2004. Long-range electrical contacting of redox enzymes by SWCNT connectors. Angew Chem Int Ed, 43:2113–17.
S. Mi, Z. Du, Y. Xu, et al. 2016. Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening. Sci. Rep., 6: 35544.
Schuster GB. 2000. Long-range charge transfer in DNA: transient structural distortions control the distance dependence. Acc Chem Res, 33:253-60. Sullivan CKO. 2002. Aptasensors–the future of biosensing? Anal Bioanal Chem, 372:44–8.
Stone HA, Stroock AD, Ajdari A. 2004. Engineering ﬂows in small devices: microﬂuidics toward a lab-on-a-chip. Annu. Rev. Fluid Mech., 36: 381–411.
Sugiura S, Hattori K, Kanamori T. 2010. Microfluidic serial dilution cell-based assay for analyzing drug dose response over a wide concentration range. Anal. Chem., 82: 8278–8282.
Taton TA, Mirkin CA, Letsinger RL. 2000. Scanometric DNA array detection with nanoparticle probes. Science, 289:1757–60.
Thorp HH. 2003. Reagentless detection of DNA sequences on chemically modiﬁed electrodes. Trends Biotechnol, 21:522–4.
Umek RM, Lin SW, Vielmetter J, et al. 2001. Electronic detection of nucleic acids–A versatile platform for molecular diagnostics. J Mol Diag, 3:74–84.
Van Hove AH, Antonienko E, Burke K, et al. 2015. Temporally tunable, enzymatically responsive delivery of proangiogenic peptides from poly (ethylene glycol) hydrogels. Adv. Healthc. Mater., 4: 2002–2011.
Whitesides GM, Grzybowski B. 2002. Self-assembly at all scales. Science, 295:2418–21.
Willner I. 2002. Biomaterials for sensors, fuel cells, and circuitry. Science, 298:2407.
Wosnick JH, Swager TM. 2000. Molecular photonic and electronic circuitry for ultra-sensitive chemical sensors. Curr Opin Chem Biol, 4:715–20.
Xiao Y, Patolsky F, Katz E, et al. 2003. Plugging into enzymes: nanowiring of redox enzymes by a gold nanoparticle. Science, 299:1877–81.
Xu H, Wu H, Huang F, et al. 2005. Magnetically assisted DNA assays: High selectivity using conjugated polymers for ampliﬁed ﬂuorescent transduction. Nucleic Acids Res, 33:e83.
Yu CJ, Wan YJ, Yowanto H, et al. 2001. Electronic detection of single-base mismatches in DNA with ferrocene-modiﬁed probes. J Am Chem Soc, 123:11155–61.
Yu X, Kim SN, Papadimitrakopoulos F, et al. 2005. Protein immunosen- sor using single-wall carbon nanotube forests with electrochemical detection of enzyme labels. Mol Biosyst, 1:70–8.