Der Prozess der Biogaserzeugung wurde bereits im Abschnitt Grundstufe beschrieben. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in Entwicklungsländern das Interesse an der Entwicklung von Technologien zur Erzeugung erneuerbarer Energiequellen gestiegen ist.

Wichtigste Schritte zu modernen BIOPLASTICS

• Biokunststoffe sind keine wirkliche Innovation: Naturharze wurden seit der Antike verwendet (z.B. Bernstein, Schellack etc.)
• Ab 1860 wurden die ersten auf Zellulose basierenden Kunststoffe freigegeben (z. B. Zelluloid, Zellophan)
• In den 1940er Jahren fertigte Henry Ford Autoteile mit Kunststoffen aus Soja
• In den 50er Jahren aus Öl gewonnene Kunststoffe
• Ölkrise in den 70er Jahren: Das Interesse an Biokunststoffen wurde wiederentdeckt. Derzeit steigt die Nachfrage nach Biokunststoffen, vor allem aufgrund der drängenden Umweltprobleme (Ressourcenverknappung, Treibhauseffekt, Müllentsorgung etc.). Abb. 5, 6 und 7 geben einige grundlegende Informationen zu Biokunststoffen.

Abb. 5. Biokunststoffe und europäische

Kunststoff und Gummi sind polymere Materialien, die aus Monomeren bestehen. Diese werden hauptsächlich aus Erdöl hergestellt und das gewonnene Material ist daher nicht erneuerbar. Rund 4 % des weltweiten Ölverbrauchs werden als Rohstoff in der Kunststoffproduktion verwendet, eine ähnliche Menge wird im Produktionsprozess als Energie verwendet. Neben Erdöl erfordert die Kunststoffherstellung den Einsatz chemischer Zusatzstoffe wie Weichmacher, Flammschutzmittel, Hitze- und UV-Stabilisatoren, Biozide, Pigmente und Füllstoffe. Mehrere Zusatzstoffe sind nach den EU-Verordnungen als gefährlich eingestuft (krebserzeugend, erbgutverändernd, schädlich für die Fortpflanzungsgesundheit oder für Wasserorganismen oder mit anhaltenden negativen Auswirkungen auf die Umwelt).

In den 60er Jahren wurde Plastik zum ersten Mal als ein Problem der Meeres- und Ozeanverschmutzung betrachtet und es wurden negative gesundheitliche Auswirkungen auf Mensch und Umwelt beschrieben. Tatsächlich setzen Kunststoffe während des gesamten Lebenszyklus des Produkts giftige Chemikalien frei.

Als mögliche Lösung stellte sich das Kunststoffrecycling heraus. Recycling ist jedoch nicht die einzige Lösung, um die Plastikmüllkrise zu lösen, die die Umwelt verschmutzen. Kunststoff kann nicht recycelbar sein, nur ein- oder zweimal recycelbar sein oder eine definierte Anzahl von Malen, aber nicht für immer. Nach dieser Grenze landet der Kunststoff auf einer Deponie. Darüber hinaus erlauben viele Plastikkonsumenten ihrem Plastik nicht einmal eine so lange Lebensdauer. Erneuerbare Kunststoffe, d. h. Kunststoffe, die aus erneuerbaren Quellen stammen und in der Umwelt leicht biologisch abbaubar sind, können eine Lösung für das Problem der Biokunststoffvergiftung bieten.

Abb. 6. Biobasierte und biologisch abbaubare Kunststoffe

Abb. 7. Wichtigste weltweit produzierte

Biobasiert wird in der europäischen Norm EN 16575 als „aus Biomasse gewonnen“ definiert. Biologisch abbaubare Materialien sind Materialien, die von Mikroorganismen wie Bakterien oder Pilzen zu Wasser, Kohlendioxid oder Methan und Biomasse abgebaut werden können. Die biologische Abbaubarkeit hängt jedoch von den Umgebungsbedingungen ab: Anwesenheit von Mikroorganismen, Temperatur und Verfügbarkeit von Sauerstoff und Wasser. Kompostierbare Materialien sind Materialien, die unter Kompostierungsbedingungen zerfallen. Die Bedingungen für die industrielle Kompostierung erfordern eine erhöhte Temperatur (55˚C – 60˚C) in Kombination mit einer hohen relativen Luftfeuchtigkeit und der Anwesenheit von Sauerstoff, und sie sind im Vergleich zu anderen Abbaubedingungen wie Boden, Oberflächenwasser und Meerwasser tatsächlich optimal. Die Einhaltung der EN 13432 gilt als gutes Maß für die Kompostierbarkeit von Verpackungsmaterialien. Nach dieser Norm ist Kunststoffverpackungen können als kompostierbar bezeichnet werden. Im Folgenden werden einige Details zu den 3 Hauptkategorien von Biokunststoffen gegeben.

Kunststoffe auf Stärkebasis

75% des gesamten organischen Materials auf der Erde liegt in Form von Polysacchariden vor. Ein wichtiges Polysaccharid ist Stärke. Pflanzen synthetisieren und speichern Stärke in ihrer Struktur als Energiereserve. Stärke kommt in Samen, Knollen oder Wurzeln der Pflanzen vor. Stärkequellen sind Mais, Weizen, Reis, Kartoffeln, Tapioka, Erbsen und viele andere pflanzliche Ressourcen. Der größte Teil der weltweit produzierten Stärke wird aus Mais gewonnen. Stärke wird im Allgemeinen durch Nassmahlverfahren aus Pflanzenressourcen gewonnen. Stärke besteht aus zwei Arten von Glucosepolymeren: Amylose und Amylopektin. Amylose ist im Wesentlichen ein lineares Polymer, in dem Glucoseeinheiten überwiegend durch α-D-(1,4)-glucosidische Bindungen verbunden sind. Amylopektin ist ein verzweigtes Polymer, das periodische Verzweigungen enthält, die durch α-D-(l, 6)-glucosidische Bindungen mit dem Rückgrat verbunden sind.

Abb. 8. Stärkebasierte Technologie von Novamont

Eine wichtige Kunststoffklasse stellen stärkebasierte Kunststoffe dar. Seit Anfang der 1990er Jahre ist es durch Forschung und Technologieentwicklung möglich, natürliche Polymere wie Stärke (aus Mais, Kartoffel etc.) mit biologisch abbaubaren Makromolekülen (polymere Komplexbildner) zu komplexieren, um thermoplastische und biologisch abbaubare innovative Materialien im industriellen Maßstab zu erhalten. Insbesondere die stärkebasierte Technologie von Novamont (Abb. 8) verwendet Verarbeitungsbedingungen, die die Kristallinität von Amylose und Amylopektin in Gegenwart von Makromolekülen, die mit Amylose einen Komplex bilden können, fast vollständig zerstören können. Sie können natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein und sind biologisch abbaubar. Der von Amylose mit dem Komplexbildner gebildete Komplex ist im Allgemeinen kristallin und ist durch eine einzelne Helix von Amylose gekennzeichnet, die um den Komplexbildner herum gebildet wird. Im Gegensatz zu Amylose interagiert Amylopektin nicht mit dem Komplexbildner und verbleibt in seinem amorphen Zustand. Die Quelle der Stärke, dh ihr Verhältnis zwischen Amylose und Amylopektin, die Verarbeitungsbedingungen und die Art der Komplexbildner erlauben das Engineering verschiedener supramolekularer Strukturen mit sehr unterschiedlichen Eigenschaften. In den letzten Jahren wurden viele erfolgreiche Anstrengungen unternommen, um den Anteil nachwachsender Rohstoffe zur Herstellung biologisch abbaubarer Polyester zu erhöhen. Novamont ist damit einer der wichtigsten Player bei stärkebasierten Biokunststoffen.

Polymilchsäure-Kunststoffe

Synthetische biologisch abbaubare Polylactone wie Polymilchsäure (PLA), Polyglycolsäure (PGA) und Polycaprolacton (PCL) sind Polymere, die durch einfache Hydrolyse der Esterbindungen abgebaut werden. Die hydrolytischen Produkte eines solchen Abbauprozesses werden dann in ungiftige Nebenprodukte umgewandelt (Abb. 9).

Abb. 9. PLA-Lebenszyklus

PLA-Kunststoffe werden aus der Fermentation von landwirtschaftlichen Nebenprodukten wie stärkereichen Substanzen wie Mais, Weizen oder Zucker und Maisstärke gewonnen. Der Prozess umfasst die Umwandlung von Mais oder anderen Kohlenhydratquellen in Glukose, gefolgt von einer Fermentation in Milchsäure (Abb. 9 und 10).

Fig. 10. PLA production from starch

Von Milchsäure abgeleitetes PLA ist ein thermoplastischer, biologisch abbaubarer aliphatischer Polyester mit großem Potenzial für Verpackungsanwendungen. Die Milchsäuremonomere werden entweder direkt polykondensiert oder unterliegen einer Ringöffnungspolymerisation von Lactid, was zur Bildung von PLA-Pellets führt. Die Eigenschaften von PLA als Verpackungsmaterial hängen vom Verhältnis der beiden optischen Isomere des Milchsäuremonomers ab. Bei Verwendung von 100 % L-PLA-Monomeren führt dies zu einer sehr hohen Kristallinität und einem sehr hohen Schmelzpunkt, wohingegen 90/10% D/L-Copolymere die Anforderungen von Bulk-Verpackungen erfüllen. PLA ist das erste biobasierte Polymer, das in großem Maßstab kommerzialisiert und zu Spritzgussobjekten, Folien und Beschichtungen geformt werden kann. PLA hat als Verpackungsmaterial High-Density-Polyethylen, Low-Density-Polyethylen (LDPE), Polyethylenterephthalat und PS ersetzt.

Die Haupteigenschaften von PLA sind: i) die mechanische Beständigkeit und Wärmeempfindlichkeit sind denen von herkömmlichen Kunststoffen ähnlich; ii) Härte, Steifigkeit und Elastizitätsgrad sind PET ähnlich, iii) es kann Fette, Öle, Alkohol und aliphatische Moleküle enthalten, iv) geringe Beständigkeit gegen Säuren und Basen ist aber gute Beständigkeit gegen UV-Strahlung, v) es kann bedruckt werden und gefärbt, vi) es kann durch Standardmaschinen, die für traditionelle Kunststoffe verwendet werden, in Waren umgewandelt werden, vii) die Nachnutzungsphase kann die Kompostierung in Industrieanlagen beinhalten.

Polyhydroxyalkanoate

Polyhydroxyalkanote (PHAs) sind biologisch abbaubare Polymere, die von manchen Bakterien als Speichersubstanz in Form von intrazellulären Granulaten angereichert werden. PHA gehört zu den Biopolymeren, die die herkömmlichen petrochemischen Kunststoffe mit ihren parallelen Materialeigenschaften effektiv ersetzen können. Ihre Produktion im großen Maßstab ist jedoch noch immer durch die hohen Herstellungskosten im Vergleich zu herkömmlichen Kunststoffen auf Basis fossiler Brennstoffe begrenzt, da der PHA-Preis je nach Polymerzusammensetzung mit 2,2 bis 5,0 €/kg mindestens dreimal so hoch ist wie die wichtigsten Polymere auf petrochemischer Basis, die weniger als 1,0 €/kg kosten (Berechnungen im Jahr 2016).

In den meisten Unternehmen, die PHAs herstellen, werden meist Reinkulturen verwendet. Das Problem bei der Verwendung von Reinkulturen sind die Voraussetzungen für Sterilität, veredelte Substrate, wenn keine pflanzlichen Rohstoffe verwendet werden, was den Kommerzialisierungsprozess einschränkt. All diese Probleme sollen mit Mixed Microbial Cultures (MMCs) überwunden werden: Diese kombinieren die Umwandlung von Abfällen in eine wertschöpfende Produktproduktion. Die biologische Behandlung von Abwasser und Schlammmanagement zur Rückgewinnung von Kohlenstoff aus Abwasser als PHAs ist ein Weg, um die Umweltschutzinfrastruktur am Ende der Rohrleitung in Bioraffinerien umzuwandeln. Integrationsstrategien für die Produktion von MMC-PHA in Abwasserbehandlungsprozessen wurden für industrielle Prozessabwässer und kommunale Abwasserbehandlung vorgeschlagen.

Eines der am besten charakterisierten Mitglieder der PHA-Familie ist Polyhydroxybutirat (PHB), das von Mikroorganismen produziert wird, die es im Zellzytoplasma speichern. 1926 wurde erstmals eine mikrobielle Produktion von linearem Polyester aus D(-)-3-Hydroxybuttersäure als intrazelluläres Granulat entdeckt, die sowohl bei grampositiven als auch bei gramnegativen Bakterien unter Hungerbedingungen auftrat (Abb. 11).

Abb. 11. Polyhydroxybutirat

Die Kosten sind der Hauptnachteil der PHB-Produktion während der Industrialisierung. Die industrielle Herstellung von PHB ist teurer als die von Petroplastik. Die Produktion von PHB in großen Mengen wird auf etwa 4,4 USD/kg geschätzt, dh weitaus teurer als die Produktionskosten für Polypropylen, die nahe 1 USD/kg liegen. Die finanziellen Schwierigkeiten stehen zweifellos im Zusammenhang mit den Produktionskosten, sowohl vor- als auch nachgelagerten Prozessen. CA, 40 % bzw. 50 % der Gesamtproduktionskosten von PHB wurden den Rohmaterial- bzw. Trenn-/Reinigungssystemen zugewiesen. Bei Bioextraktionstechniken wird Gentechnik am häufigsten verwendet, um Mikroorganismen einzuführen, und sie sind in der Lage, PHB effektiv aus PHB-akkumulierenden Zellen zu extrahieren. Es gibt mehrere Ansätze, die untersucht wurden, darunter ein Bakteriophagen-vermitteltes Lysesystem und räuberische Bakterien, die besser sind als die herkömmlichen Extraktionsansätze, die umweltschädliche Lösungsmittel produzieren, mit höheren Abbaukosten. Aufgrund der nicht umwelt- und wirtschaftsunfreundlichen Eigenschaften herkömmlicher Extraktionsverfahren wird daher Bioextraktionssystemen mehr Aufmerksamkeit geschenkt. Gentechnik wird am häufigsten verwendet, um Mikroorganismen einzuführen, und sie sind in der Lage, PHB effektiv aus PHB-akkumulierenden Zellen zu extrahieren

Diese Einheit konzentriert sich im Wesentlichen auf die Technologien, die die Untersuchung der Mikrobiota in Böden oder komplexen Matrizen ermöglichen. Die wichtigsten Technologien sind unten dargestellt (Abb. 12).

Abb. 12: Techniken zur Untersuchung der Mikrobiomkomplexität

Der kulturelle Ansatz ist in dem von Digit-Biotech produzierten Video gut beschrieben. Diese „klassische Methode“ sieht die Identifizierung von Mikroorganismen durch die Isolierung von Reinkulturen vor, gefolgt von Tests, die einige morphophysiologische und biochemische Eigenschaften analysieren. Diese Analysen reichen oft nicht aus, um die meisten Arten von Mikroorganismen zu identifizieren und beschränken sich zudem auf kultivierbare Arten, die einen sehr geringen Prozentsatz aller in der Natur vorkommenden Arten ausmachen. Diese Tests haben auch die ernsthafte Einschränkung, dass sie einen beträchtlichen Zeitaufwand erfordern. Sie haben jedoch den großen Vorteil der Gewinnung durch den Isolierungsansatz von Zielmikroorganismen, die im Bioremediationsansatz verwendet werden können.

In den letzten Jahrzehnten hat die Forschung auf dem Gebiet der Umweltmikrobiologie gezeigt, dass mikrobielle Gemeinschaften eine funktionelle Rolle bei der Kontrolle von Ökosystemen spielen, die nicht einzelnen Arten, sondern den Gemeinschaften selbst als „funktionale Einheiten“ zugeschrieben wird. Diese funktionelle Aktivität mikrobieller Gemeinschaften ist in vielen Fällen für wichtige Prozesse für den Menschen verantwortlich, darunter der biologische Abbau von Altabfällen in Kläranlagen und Deponien, die Kompostierung und allgemein alle Prozesse, bei denen chemische Umwandlungen der von die Aktivitäten stattfinden. Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE), Real-Time-PCR (oder quantitative PCR), und der Gesamtgenom-Ansatz (Hochdurchsatz-Sequenzierung und Shotgun-Sequenzierung) sind die wichtigsten Technologien, die für die Untersuchung mikrobieller Populationen in der Umwelt verwendet werden.

DGGE: Es handelt sich um eine elektrophoretische Trenntechnik zur Trennung und Analyse von DNA-Fragmenten, die sich auch in der Nukleotidsequenz eines einzelnen Basenpaars unterscheiden. Bei der klassischen Elektrophorese, die auf Agarose- oder Acrylamidgel durchgeführt wird, werden DNA-Fragmente auf der Basis des Molekulargewichts getrennt; die Laufgeschwindigkeit nimmt parallel zur Längenzunahme des Fragments ab. Im Gegensatz dazu werden in der DGGE DNA-Fragmente mit gleichem Molekulargewicht nach dem Denaturierungsmuster getrennt. Das Vorhandensein von Hitze oder chemischen Denaturierungsmitteln ermöglicht die Denaturierung der beiden Filamentbestandteile eines doppelsträngigen DNA-Moleküls (dsDNA). Temperatur und Konzentration des Denaturierungsmittels, bei dem die Trennung der beiden Filamente erfolgt, hängen stark von der Sequenz des Fragments selbst ab. Ausschlaggebend sind insbesondere: Menge der Wasserstoffbindungen, die zwischen komplementären Basen aufgebaut werden und Art der Wechselwirkungen, die zwischen Basen aufgebaut werden, die auf demselben Strang benachbart sind (Stapelwechselwirkung). Ein DNA-Molekül hat daher Domänen mit charakteristischen Schmelztemperaturen oder Tm, bestimmt durch die Nukleotidsequenz. DNA-Fragmente, die im Molekulargewicht fast identisch sind, sich aber auch in einem einzigen Nukleotid unterscheiden, können durch voneinander verschiedene Tm- und Schmelzdomänen charakterisiert werden. Die DGGE-Analyse wird auf einem Polyacrylamidgel durchgeführt, das einen denaturierenden Gradienten enthält, so dass die dsDNA während des Laufs einer Erhöhung der Denaturierungsbedingungen mit nachfolgender Trennung an den Schmelzdomänen unterliegt. Im oberen Teil des Gels, wo milde Denaturierungsbedingungen vorliegen, die Schmelzdomänen bei niedrigeren Tm beginnen teilweise zu denaturieren, wodurch verzweigte Moleküle mit geringerer Mobilität entstehen. Die Zunahme der Denaturierungsbedingungen entlang des Polyacrylamidgels kann die vollständige Dissoziation von teilweise denaturierten Fragmenten in einzelsträngiger DNA (ssDNA) bestimmen. Experimentell wird die vollständige Dissoziation der beiden dsDNA-Stränge durch die Einführung von Domänen am Ende jedes Filaments verhindert, die durch einen hohen Gehalt an G + C und eine hohe Tm gekennzeichnet sind. An einem Ende der dsDNA werden durch Einbau einer GC-Klemme während der Amplifikationsreaktionen G + C-reiche Regionen künstlich erzeugt. Der Einbau der GC-Klemme wird durch die Verwendung von Primern ermöglicht, die durch eine Sequenz von ca. 30-40 GC am 5′-Ende gekennzeichnet sind. Das Vorhandensein der GC-Klemme der gleichen Sequenz am Ende jedes Moleküls bewirkt, dass die Unterschiede zwischen den Hubprofilen der analysierten Fragmente hauptsächlich durch Variationen in der Sequenz der niedrigschmelzenden Domänen bestimmt werden. Da Tm durch die Nukleotidsequenz bestimmt wird, kann das Vorliegen einer einzelnen Mutation ein anderes Denaturierungsprofil und folglich einen anderen Elektrophoreselauf erzeugen. Daher kann das Wiederauftreten von Polymorphismen in hochkonservierten Genen von der DGGE analysiert werden und nützliche Informationen zur Charakterisierung der Struktur mikrobieller Gemeinschaften liefern. Tatsächlich erhält man bei der denaturierenden Gradienten-Gelelektrophorese ein elektrophoretisches Profil, das durch eine Reihe von Banden gebildet wird, in dem in erster Näherung die Anzahl der Banden ist proportional zur Anzahl der vorhandenen Arten und die Position jeder Bande ist für jede Art unterschiedlich. Die DGGE-Technik bietet daher einen einfachen Ansatz, um mikrobielle Gemeinschaftsprofile zu erhalten, mit denen räumliche und zeitliche Unterschiede in der Gemeinschaftsstruktur identifiziert oder Strukturänderungen als Reaktion auf Umweltstörungen überwacht werden können.

Echtzeit-PCR: Es ist eine Technik, die es ermöglicht, eine Ziel-DNA-Sequenz zu amplifizieren und gleichzeitig zu quantifizieren. Dabei werden fluoreszierende Farbstoffe wie Sybr Green verwendet, die in den kleinen Sulcus des DNA-Doppelstrangs interkalieren, oder Sonden mit spezifischen Sequenzen, die aus mit fluoreszierenden Mitteln markierten Oligonukleotiden bestehen. Die emittierte Fluoreszenz wird ständig gemessen und liefert „Echtzeit“-Informationen über die Menge des produzierten Amplikons. Aus einer Amplifikationsreaktion wird ein Graph mit einer sigmoidalen Kurve erhalten; diese setzt so schnell wie möglich ein, je größer die Menge an Ausgangs-DNA ist und wächst mit exponentiellem Trend weiter, bis sie einen Maximalwert (Plateau) erreicht, bei dem sich die Reaktion aufgrund der Erschöpfung der Substrate verlangsamt.

Bei der Untersuchung eines Real-Time-PCR-Graphen werden drei Parameter festgelegt:

– die Fluoreszenz-Basislinie oder Basislinienregion;

– die Schwellenlinie, parallel zur Grundlinie;

– Der für jede Probe spezifische Schwellenwertzyklus oder CT identifiziert den Wert des PCR-Zyklus, in dem die exponentielle Phasenkurve die Schwellenwertlinie schneidet.

Die meisten Real-Time-PCR-Instrumente sind so programmiert, dass sie die Wellenlängen des SYBR Green-Emissions- und Anregungsspektrums (jeweils 495 nm und 537 nm) ablesen. Dieser Farbstoff ist sehr lichtempfindlich, er bindet nur an doppelsträngige DNA und damit nur an das neu synthetisierte Amplikon. Die Proben werden auf der Grundlage von Eichkurven quantifiziert, die unter Verwendung bekannter Mengen von 16 S rDNA-Genkopien erhalten wurden. Der Vergleich des von der unbekannten Probe emittierten Signals mit den zur Erstellung der Kalibrierkurve verwendeten Fluoreszenzwerten ermöglicht die Quantifizierung einer bestimmten mikrobiellen Spezies. Neben der quantitativen Messung von Zielbakterien ermöglichen Interkalatoren wie SYBR Green die Unterscheidung von Amplikons unterschiedlicher Länge und den Nachweis eventuell vorhandener unspezifischer Amplifikationen.

Sequenzierung der nächsten Generation: Die Besonderheit dieser 2006 eingeführten Technologie besteht nicht nur in der Möglichkeit, ein einzelnes DNA-Fragment auf einmal zu sequenzieren und diesen Prozess auf Millionen von Fragmenten gleichzeitig auszudehnen, sondern auch in der Fähigkeit, DNA-Fragmente in beide Richtungen zu sequenzieren.

Der erste Schritt umfasst einzelsträngige DNA-Fragmente, an deren Enden eindeutige Sequenzen, genannt „Index“, auf einen Zellstrom geladen werden, wo sie auf einer Oberfläche eingefangen werden, die „Oligonukleotide noch“ enthält, die zu den Indizes komplementär sind, auf denen sie werden für die Herstellung der Bibliotheken immobilisiert. Die Hybridisierung zwischen letzteren und den DNA-Fragmenten erfolgt durch Erhitzen und Kühlen, gefolgt von Inkubation mit spezifischen Reagenzien und einer isothermen Polymerase. Durch eine „überbrückte“ Amplifikation wird jedes Fragment eindeutig von den anderen amplifiziert, wodurch ein Cluster von Klonen entsteht. Wenn die Cluster-Generierung abgeschlossen ist, sind die generierten Modelle nach entsprechender Denaturierung bereit für die eigentliche Sequenzierung.

Illumina verwendet eine Technologie, die auf kettenterminierenden fluoreszierenden Nukleotiden mit einem OH bei 3 ‚ basiert; dies stellt sicher, dass eine einzige Base pro Zyklus eingearbeitet wird. Es folgt ein Bildgebungsschritt, um das in jedem Cluster eingebaute Nukleotid zu identifizieren, und ein chemischer Schritt, um die fluoreszierende Gruppe und das terminale OH zu entfernen, um den Einbau einer anderen Base im nächsten Zyklus zu ermöglichen.

Am Ende der Sequenzierung, die ca. 4 Tage dauert, wird die Sequenz jedes Clusters Selektionsprozessen (Trimming) unterzogen, um die minderwertigen Produkte zu eliminieren. Bei der Datenanalyse werden die Fragmente unterschiedlicher Länge ausgerichtet und überlagert, so ist es möglich, die Abfolge des Ausgangsfilaments zu erkennen. In einem Standardverfahren werden mindestens 40-50 Millionen Sequenzen analysiert.

Die Shotgun-Sequenzierung ist die Sequenz aller Genome, die in einer komplexen Matrix, wie einer Bodenprobe, vorhanden sind. Die Shotgun-Sequenzierung ist daher der effizienteste Weg, um ein großes Stück DNA zu sequenzieren. Dazu wird die Ausgangs-DNA nach dem Zufallsprinzip in viele kleinere Stücke zerlegt, eine Art Schrotflinte, wobei jedes dieser Stücke dann einzeln sequenziert wird. Die aus den verschiedenen Stücken erzeugten resultierenden Sequenzlesevorgänge werden dann von einem Computerprogramm analysiert, wobei nach Sequenzabschnitten von unterschiedlichen Lesevorgängen gesucht wird, die miteinander identisch sind. Wenn identische Regionen identifiziert werden, werden sie miteinander überlappt, wodurch die beiden Sequenzlesevorgänge zusammengefügt werden können. Dieser Computerprozess wird immer wieder wiederholt und liefert schließlich die vollständige Sequenz des Ausgangsstücks der DNA.

Zahlreiche biotische und abiotische Belastungen, wie der massive Einsatz von Pestiziden in der Landwirtschaft und der Klimawandel, gefährden das Überleben bestäubender Insekten mit potenziell schädlichen Folgen sowohl für Agrarökosysteme als auch für natürliche Systeme. Tatsächlich sind Bienen für die Bestäubung von 84 % der Kulturpflanzenarten verantwortlich, von denen 35 % von globaler Bedeutung sind und 78 % der Wildpflanzen. Es genügt zu sagen, dass allein 70 % der Saatkulturen (wie Karotten, Zwiebeln, Knoblauch usw.) strikt auf Insektenbestäubung angewiesen sind, ebenso wie 80 % der 264 interessierenden Kulturpflanzenarten in Europa. Daraus folgt, dass die Aktivität bestäubender Insekten, einschließlich Bienen, auf wirtschaftlicher Ebene eine wesentliche Rolle spielt, deren monetäre Schätzung allein in Europa etwa 15 Mrd. € / Jahr beträgt, während sie weltweit auf 153 Mrd. € / Jahr anwächst.

Neben einem unkalkulierbaren Wert für die Erhaltung der Biodiversität und des Gleichgewichts in den verschiedenen Ökosystemen liefern Bienen also Honig, Bienenwachs, Propolis, Pollen und Gelée Royale: In Europa ergaben die 2010 erhobenen Daten eine Produktion von rund 220 000 Tonnen 000 Honig mit Preisen zwischen 1,50 und 40 €/kg je nach Herkunftsgebiet. Oder in Australien bewegt sich die Produktion von Honig und Bienenwachs jährlich um einen Handelswert von 90 Millionen US-Dollar, was einmal mehr die Bedeutung der Imkerei im Panorama unterstreicht. Weltwirtschaft. Honigbienenvölker sind von 6 Millionen in den 1940er Jahren auf heute etwa 2,6 Millionen rapide zurückgegangen. Der hohe jährliche Verlust an Bienenvölkern wird immer noch beobachtet und ist für Imker zur Norm geworden.

Bruten, die von „Colony Collapse Disorder“ (CCD) oder „Hive Depopulation Syndrome“ betroffen waren, zeigten ebenfalls signifikante Anzeichen eines Ungleichgewichts. Die Ursachen dieses Syndroms sind noch unklar, es wird jedoch vermutet, dass sie auf veränderte Umweltfaktoren, Mangelernährung, das Vorhandensein von Krankheitserregern und den massiven Einsatz von Insektiziden zurückzuführen sind. Die Symptomatologie sieht das Vorhandensein von Bruten, die ihre Larven trotz Anwesenheit der Königin verlassen, und Appetitlosigkeit auf Pollen- und Nektarvorräte, die nicht sofort verzehrt werden (Abb. 13).

Abb. 13. Einblicke in die Koloniekollaps-Störung

Eine der möglichen Ursachen für dieses Absterben kann mit der Darmmikrobiota-Dysbiose als mikrobielle Veränderung in Bezug auf Menge und Zusammensetzung zusammenhängen. Mit diesem Begriff bezeichnen wir das Phänomen, das die positiven Funktionen der Mikrobiota negativ beeinflusst und mit spezifischen Stoffwechselstörungen verbunden ist. Tatsächlich könnten diese Mängel ernsthafte Probleme für die Entwicklung junger Erwachsener verursachen, indem sie ihre Fähigkeit beeinträchtigen, Resistenzgene zu entwickeln, einschließlich derer für die Synthese von Vitellogenin, und die Funktionen des Immunsystems hemmen, da nachgewiesen wird, dass dieselbe Mikrobiota die seine Wirksamkeit (Abb. 14).

Abb. 14. Folgen einer veränderten mikrobiellen Zusammensetzung des Darms bei Bienen

Vor einigen Jahren haben wir versucht zu verstehen, welche Faktoren die Mikrobiota destabilisieren können und kamen zu dem Schluss, dass Dysbiose sowohl durch biotische als auch durch abiotische Faktoren verursacht wird. Betrachtet man biotischen Stress, so hat sich gezeigt, dass die Ernährung, das Vorhandensein bestimmter Krankheitserreger und Erkrankungen (zB CCD) sowie widrige Umweltbedingungen eine grundlegende Rolle spielen. Der Nährstoffmangel wirkt sich destruktiv auf die normale Entwicklung der mikrobiellen Darmflora aus, was die Sterblichkeit der Honigbienen sowie die Anfälligkeit für Krankheiten und Krankheitserreger erhöht. Darüber hinaus induzieren die anormalen Temperaturen bei den Wirten einen Stresszustand, der dramatische Auswirkungen auf die Symbionten hat. die Folge davon ist, die Sterblichkeit der Honigbienen zu erhöhen sowie die Anfälligkeit für Krankheiten und Krankheitserreger zu erhöhen. Darüber hinaus induzieren die anormalen Temperaturen bei den Wirten einen Stresszustand, der dramatische Auswirkungen auf die Symbionten hat. Die Folge davon ist, die Sterblichkeit der Honigbienen zu erhöhen sowie die Anfälligkeit für Krankheiten und Krankheitserreger zu erhöhen. Darüber hinaus induzieren die anormalen Temperaturen bei den Wirten einen Stresszustand, der dramatische Auswirkungen auf die Symbionten hat.

Bei abiotischen Stressoren sind die Schäden fast ausschließlich auf den Einsatz von Insektiziden, Fungiziden, Akariziden und Antibiotika zurückzuführen. Tatsächlich besteht die Gefahr, dass die Bienen während der Nahrungssuche indirekt aufgenommen werden und die Wirkstoffe sowohl auf den behandelten Hauptkulturen als auch auf den benachbarten, der Drift ausgesetzten Pflanzen treffen. Dies könnte zu ernsthaften Problemen und Ungleichgewichten im Stoffwechsel und der Immunabwehr führen: Tatsächlich besteht die Möglichkeit, dass die Exposition gegenüber bestimmten Substanzen die Fähigkeit der Bienen beeinträchtigt, ihre mikrobielle Darmpopulation zu regulieren.

Aus diesen Gründen zielt eine der innovativsten Zukunftsperspektiven darauf ab, die tiefgreifende Beziehung zwischen Mikroorganismen und Honigbienen zu verstehen, um ihre dramatische Lebensdauer und Bedingungen zu verbessern.

Darmdisbiose: ein Beispiel

Angesichts des wachsenden Interesses der Öffentlichkeit an diesem Produkt fällt die erste objektive Analyse auf die Wirkung von Glyphosat (N-Phosphonomethyl-Glycin). Es ist ein nicht-selektives systemisches Nachauflaufherbizid, also ein Totalherbizid. Sein Wirkmechanismus unterbricht den Stoffwechselweg, der für die Synthese von Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan verantwortlich ist, und hemmt die Synthese von 3-Phosphoshikimat-1-Carboxyvinyltransferase (EPSP-Synthase). Dieses Herbizid gilt seit jeher als eines der am wenigsten giftigen Produkte für Tiere, da ihnen dieser Stoffwechselweg fehlt. Trotzdem wurde gezeigt, dass es Nicht-Zielorganismen mit hochtoxischen Wirkungen gegenüber Regenwürmern, Mikroalgen, Wasserbakterien, Rhizosphäre und Endophyten beeinflussen kann.

Insbesondere Motta et al. (2018) führten eine Studie zur Charakterisierung der Mikrobiota von Bienen durch, die Glyphosat ausgesetzt waren, und kamen zu dem Schluss, dass die absolute Häufigkeit von S. alvi, G. apicola, Lactobacillus sp. und Bifidobacterium sp. (Abb. 15) deutlich zurückgegangen ist.

Abb. 15. Analysenzur Bienendarmmikrobiota

Mikrobiota von Bienen durch, die Glyphosat ausgesetzt waren, und kamen zu dem Schluss, dass die absolute Häufigkeit von S. alvi, G. apicola, Lactobacillus sp. und Bifidobacterium sp. (Abb. 15) deutlich zurückgegangen ist. Das Produkt beeinträchtigte die Bakterienflora, indem es ihr Wachstum stoppte, ohne sie jedoch direkt abzutöten. Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Wirkung auf die Zellteilung in den frühen Tagen der Kolonisation abnahm. Die Bienen, die auf dem Feld auf das Herbizid gestoßen sind, hätten den Wirkstoff nämlich im Inneren des Bienenstocks getragen, der, da er sehr stabil und wasserunlöslich ist, lange Zeit auf der Oberfläche hätte verbleiben können. Auch im Feld bedeutet Persistenz, dass die Kontamination lange anhalten kann.

Wie wird die Mikrobiota erworben?

Abb. 16. Der Wachstumszyklus einer

Natürliche Bakterien, die von Honigbienen aus Blüten aufgenommen werden, während sie Nektar und Pollen sammeln, befinden sich hauptsächlich im Mitteldarm und Hinterdarm der Honigbiene. Die bei Honigbienen natürlich vorkommenden Darmbakterien sind dynamisch. Während der Entwicklung der Larven (Abb. 16) schwankt die Bakterienpopulation. Larven erhalten einige Bakterien von den Ammenbienen, die sie füttern. Während der Verpuppung wird die Darmschleimhaut abgestoßen und der Darm einer neu aufkommenden erwachsenen Honigbiene ist steril. Der Darm wird schnell wieder mit charakteristischen Mikrobiota besiedelt. Wie kommt es dazu? Hauptwege sind oral Trohallaxis, Interaktion mit Bienenstockmaterial und fäkal-orale Übertragung. Insbesondere beginnt sich die charakteristische Mikrobiota erwachsener Bienen etwa vier Tage nach dem Flimmern zu entwickeln.

Obwohl die Faktoren, die die Entwicklung der Mikrobiota für jedes Lebewesen ermöglichten, noch unbekannt sind, ist es bewiesen, dass soziale Bienen je nach Familie, zu der sie gehören, eine charakteristische Mikroflora besitzen. Es hat sich zum Beispiel gezeigt, dass die Analyse der Mikrobiota verschiedener Gattungen von eusozialen corbiculaten Apoidea wie Bombus spp., Megachile spp. und Apis spp., die wichtigsten Bakteriengattungen  rezidivierend waren (Snodgrassella spp., Gilliamella spp., Bifidobacterium spp. und Lactobacillus spp.), aber die Arten variierten in Bezug auf die Insektenarten. Daher die Hypothese, dass die Mikrobiota das Ergebnis einer dynamischen Koevolution zwischen Mikroorganismen und Wirten ist, abhängig von der Umwelt und den genotypischen Variationen, denen die Arten im Laufe der Jahrhunderte ausgesetzt waren, deren Reichtum auch mit der Größe einzelner Bienen und ganzer Völker korreliert. Tatsächlich ist die Etablierung einer artspezifischen mikrobiellen Flora das Ergebnis einer langen Selektion, bei der die optimalen Nutzverhältnisse sowohl für die Mikroorganismen als auch für die Wirte festgestellt wurden.

Wer und wo sind sie?

Es wurde geschätzt, dass sich im Darm von erwachsenen Arbeiterinnen etwa 1 Milliarde Bakterienzellen befinden, von denen 95 % speziell im Hinterdarm lokalisiert sind (Abb. 17). Dabei wurde eine spezifische Unterscheidung zwischen Ileus und Rektum festgestellt; in den ersten drei Arten von Proteobakterien wie G. apicola, F. perrara und S. alvi, die einen dichten Biofilm entsprechend den Malpighischen Röhren bilden und sich entlang der Ileumwand fortsetzen. Im Rektum herrscht jedoch eine dichte Bakteriengemeinschaft vor, die aus drei Klassen von Gram-positiven, wie Firmicutes (Firm-4, Firm-5) und Bifidobakterien besteht. Was den Mitteldarm betrifft, so wurde festgestellt, dass hauptsächlich Lactobacillus spp. und Acetobacteraceae, d. h. jene Taxa, die auch in Pollen, Nektar und allgemeiner im Bienenstock vorkommen. Es kann daher gesagt werden, dass im Mitteldarm keine vorangepasste Mikrobiota existiert und dass diese in Abhängigkeit von der Umgebung und den Essgewohnheiten des Einzelnen variiert. Quantitativ gesehen gibt es hier also eine viel weniger reichhaltige Flora als im Rektum. Der Mitteldarm enthält auch wenige Bakterien, und diese sind im proventrikulären Bereich neben dem Hinterdarm konzentriert.

Abb. 17. Die Kernbienenmikrobiota

Was sind die Funktionen der Darmmikrobiota?

In den letzten Jahren hat sich die wissenschaftliche Gemeinschaft zunehmend für die Rolle der Mikrobiota für das Wohlergehen von Honigbienen interessiert (Abb. 18). Zahlreiche Studien und Forschungen haben gezeigt, dass Interaktionen mit dem Wirt sowohl auf metabolischer und ernährungsphysiologischer Ebene als auch in Bezug auf die Immunantwort auf Krankheitserreger unterstützende Wirkungen haben. Was die Nahrungsergänzung angeht, ist eine ausgewogene Bakterienflora für eine korrekte Aufnahme von Nährstoffen notwendig, da sie dank ihrer enzymatischen Aktivität am Abbau komplexer Zucker beteiligt ist. Der Artenreichtum ist nicht nur für das Vorhandensein von Cellulasen, Hemicellulasen und ligninolytischen Enzymen im Darm verantwortlich, die für den Verdauungsprozess von Pollenkörnern nützlich sind, sondern ermöglicht auch die Koexistenz verschiedener Zuckerkatalysewege (insbesondere für Gammaproteobakterien, Firmicutes und Bifidobacteriaceae). Tatsächlich wurde geschätzt, dass 91% der Proteintranskripte, die mit der Verdauung von Pflanzenmakromolekülen und den Fermentationsphänomenen von monomeren Untereinheiten verbunden sind, von Bakterien produziert werden. Ein weiteres konkretes Beispiel betrifft Pektin-Lyasen, die in der Lage sind, die in den Zellen der Pollenkörnerwand vorhandenen Pektine abzubauen. Letzteres ist auch ein ausgezeichneter Indikator für die hohe genetische Variabilität und Anpassungsfähigkeit innerhalb derselben Spezies von Mikroorganismen. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass nur einige Stämme von G. apicola sie besitzen, während andere davon völlig frei sind. Die Bedeutung einer größeren Verdauungskapazität und damit der Fähigkeit, nicht abbaubare Nährstoffe zu verstoffwechseln, wurde in verschiedenen Studien nachgewiesen. (Zhenget al. (2017) zum Beispiel). Durch den Vergleich von Bienen mit normaler Mikrobiota und anderen ohne jegliche Art von Darmflora zeigten sie deutliche physiologische Unterschiede. Bei ersteren beeinflussten die Symbionten die Darmgröße, das Gewicht der Individuen, die Werte von Vitellogenin und Insulin sowie die Zuckerempfindlichkeit positiv. Diese Ergebnisse legten dann nahe, dass die Mikrobiota den Appetit und das Wachstum des Bienenkörpers durch die Zunahme von Signalen im Zusammenhang mit der Anwesenheit von Insulin beeinflussen könnte.

Neben der Hydrolyse komplexer Kohlenhydrate produzieren Darmmikroorganismen nützliche Stoffwechselsubstrate wie Vitamin B und andere und kurze Fettsäureketten. Beispielsweise wurde festgestellt, dass die Gattungen Lactobacillus sp. und Bifidobacterium sp. sind an den Fermentationsprozessen von Pollen und Nektar beteiligt, so dass sie für den Vitaminwert von Honig verantwortlich sind. Das Phänomen der Symbiose mit dem Wirt geht über die Ernährung und den Stoffwechsel hinaus: Die Mikrobiota spielt eine wichtige Rolle bei der Unterstützung des Immunsystems. Tatsächlich könnten die Bakterien in erster Linie die Produktion der bieneneigenen Abwehrmoleküle direkt anregen. Nach dem Kontakt zwischen der Epitheloberfläche und dem Peptidoglycan (Hauptbestandteil der Zellwand grampositiver Bakterien) das Immunsystem könnte die Gene aktivieren, um 6 antimikrobielle Peptide zu produzieren, wie zum Beispiel: Abaecin, Hymenoptaecin, Apidicin, Defensin-1 und Defensin-2. Die Produktion dieser Verbindungen wird dann durch die Veränderungen der mikrobiellen Membranen selbst verstärkt und kann auch durch Exposition gegenüber einigen pathogenen und nicht-pathogenen Mikroorganismen induziert werden. Frischella perrara zum Beispiel, ein Symbiont, der die Ileumregion im Enddarm besiedelt, stimuliert vor allem die Produktion von Apidicin. Zweitens kann die Mikrobiota direkt für die Produktion antimikrobieller Verbindungen verantwortlich sein, was unter anderem durch zahlreiche Studien bestätigt wird. Saraivaet al. (2015), zum Beispiel hat dies aufgenommen.

Abb. 18. Funktionen der

Was können wir tun?

Nach unseren und allgemeinen Erfahrungen bei Mensch und Tier können biotische und abiotische Belastungen die Zusammensetzung der Darmmikrobiota negativ beeinflussen und somit spezifische Veränderungen der Mikroorganismenaktivitäten auf Darmebene bewirken.

Wir müssen uns fragen, ob irgendeine Art von Mikrobiota-Modulation durch die Verabreichung ausgewählter Stämme diese Störung wiederherstellen, das Bienensterben reduzieren und/oder die Gesundheit der Honigbienen verbessern könnte.

Probiotika sind „lebende Mikroorganismen, die bei Verabreichung in ausreichender Menge einen Nutzen für die Gesundheit des Wirts bringen, ausgenommen Hinweise auf Biotherapeutika und nützliche Mikroorganismen, die nicht in Lebensmitteln verwendet werden“ (FAO/WHO, 2001). Ihre Verabreichung darf daher nicht mit negativen Auswirkungen auf Organismen und Umwelt verbunden sein. Die Wirkungsweise dieser Mikroorganismen lässt sich in folgende Funktionen zusammenfassen:

• SCHUTZFUNKTION: Dislokation von Krankheitserregern, Konkurrenz um Nährstoffe, Konkurrenz mit Rezeptoren und Produktion antimikrobieller Moleküle (zB Bakteriocine, organische Säuren …);
• STRUKTURFUNKTION: Barrierewirkung, Biofilm an der Darmhaarwand, Entwicklung des Immunsystems;
• STOFFWECHSELFUNKTION: Differenzierung und Vermehrung von Darmepithelzellen, Katalyse von krebserregenden Substanzen in der Nahrung, Synthese von Vitaminen, Fermentation von unverdaulichem Zucker, Ionenabsorption und Energieeinsparung.

Der Hauptwirkungsmechanismus von Probiotika scheint jedoch die Stimulierung des Immunsystems zu sein: Nach der Kohäsion mit der Darmwand können sie eine Reihe von Kaskadensignalen stimulieren, die die Synthese antimikrobieller Peptide aktivieren. In der Praxis sind sie in der Lage, die zuvor beschriebenen Aufgaben, die die Mikrobiota der Biene von Natur aus erfüllt, zu erfüllen und sich als hypothetisch optimales Hilfsmittel zu deren Sicherung und Optimierung sowie zur Verbesserung der Lebensaussichten der Biene zu erweisen.

Wie bei der menschlichen und tierischen Ernährung sind die wichtigsten Bakterien, die zu diesen Vorteilen in der Lage sind, Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Bacillus spp.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Einsatz von Probiotika vor kurzem auch im Bienenstock selbst evaluiert wurde. Obwohl Bienen lieber frischen Pollen verzehren, müssen sie sich unter bestimmten Bedingungen, wie Saisonalität, mit den gespeicherten Reserven selbst versorgen. Die feuchte Umgebung (50-60% RH), die nach der Pollensammlung entsteht, erhöht das Risiko eines unkontrollierten Bakterien- und vor allem Pilzwachstums. Es besteht eine klare Notwendigkeit, die Bestände im Bienenstock zu erhalten, um Infektionen zu vermeiden, die tödliche Folgen haben könnten, wie zum Beispiel verkalkte Larven durch Ascosphaera apis oder Darminfektionen durch Nosema spp.