Benefici ambientali derivanti dalle moderne applicazioni biotecnologiche e ICT
LIVELLO DI BASE
Aggiornamenti recenti sulla legislazione sulle energie rinnovabili Direttiva (UE) 2018/2001 del Parlamento europeo e del Consiglio dell’11 dicembre 2018 sulla promozione dell’uso dell’energia da fonti rinnovabili.
Sommario
Energia rinnovabile: biotecnologie per la produzione di biogas e bioetanolo
Aggiornamenti recenti sulla legislazione sulle energie rinnovabilià Direttiva (UE) 2018/2001 del Parlamento europeo e del Consiglio dell’11 dicembre 2018 sulla promozione dell’uso dell’energia da fonti rinnovabili. Il quadro 2030 per il clima e l’energia comprende obiettivi a livello UE e obiettivi politici per il periodo dal 2021 al 2030. Gli obiettivi chiave sono:
– Ridurre le emissioni di CO2 (dai livelli del 1990) del 40%
– Aumentare le fonti energetiche rinnovabili del 32%
– Migliorare l’efficienza energetica del 32,5%
Biogas
Il biogas è la miscela di gas prodotta dalla decomposizione della materia organica in assenza di ossigeno (anaerobicamente), costituita principalmente da metano e anidride carbonica. Il biogas può essere prodotto da materie prime come rifiuti agricoli, letame, rifiuti urbani, materiale vegetale, liquami, rifiuti verdi o rifiuti alimentari. Il biogas è una fonte di energia rinnovabile (Fig. 1). Il biogas è considerato una risorsa rinnovabile perché il suo ciclo di produzione e utilizzo è continuo, e non genera anidride carbonica netta. Mentre il materiale organico cresce, viene convertito e utilizzato. Poi ricresce in un ciclo che si ripete continuamente. Dal punto di vista del carbonio, nella crescita della biorisorsa primaria viene assorbita dall’atmosfera tanta anidride carbonica quanta ne viene rilasciata quando il materiale viene infine convertito in energia.
Il biogas è prodotto dalla digestione anaerobica con organismi metanogeni o anaerobici, che digeriscono materiali organici all’interno di un sistema chiuso, o dalla fermentazione di materiali biodegradabili. Questo sistema chiuso è chiamato digestore anaerobico o biodigestore.
Il biogas è principalmente metano (CH4) e anidride carbonica (CO2) e può avere piccole quantità di solfuro di idrogeno (H2S) e umidità (Fig. 2). Dopo la purificazione da H2S e umidità, il biogas può essere usato per produrre elettricità ed energia termica. In questo modo, il biogas può essere usato in un sistema di co-generazione (una specie di motore a gas) per convertire l’energia nel gas in elettricità e calore.
Il metano da biogas (dopo l’eliminazione della CO2) può essere utilizzato come combustibile e per qualsiasi scopo di riscaldamento. Il biogas può quindi essere pulito e aggiornato agli standard del gas naturale, quando diventa biometano.
Il biogas può essere prodotto da una grande varietà di materie grezze (materie prime). Il ruolo più importante nel processo di produzione del biogas è svolto dai microbi che si nutrono della biomassa (dettagli nel relativo power point). I materiali adatti alla produzione di biogas includono:
- rifiuti biodegradabili provenienti da imprese e impianti industriali, come il lattosio in eccedenza proveniente dalla produzione di prodotti lattiero-caseari senza lattosio
- cibo avariato dai negozi
- rifiuti organici generati dai consumatori
- fanghi provenienti da impianti di trattamento delle acque reflue
- letame e biomassa da campo dall’agricoltura
Il materiale viene in genere consegnato al pozzo di ricezione dell’impianto di biogas tramite camion o veicolo per la gestione dei rifiuti. Una consegna di materia solida come i rifiuti organici sarà successivamente sottoposta a schiacciamento per rendere la sua consistenza il più uniforme possibile. A questo punto, anche l’acqua contenente sostanze nutritive ottenute da un’ulteriore fase del processo di produzione viene mescolata con la materia prima per portare il tasso di materia solida a circa un decimo del volume totale.
Questo è anche il momento in cui qualsiasi rifiuto indesiderato non biodegradabile, come la plastica degli imballaggi o i rifiuti alimentari scaduti dei negozi, viene separato dalla miscela. Questi rifiuti vengono portati in un impianto di trattamento dei rifiuti dove vengono utilizzati per generare calore ed elettricità. La biomassa che è passata attraverso la slurrificazione è combinata con la biomassa consegnata sotto forma di liquame all’impianto di biogas e pompata nel serbatoio di pre-digestore dove gli enzimi secreti dai batteri scompongono la biomassa in una consistenza ancora più fine. Uno schema di un impianto di biogas è presentato in Fig. 3.
I solidi e i liquidi residui creati nella produzione di biogas sono chiamati digestato. Questo digestato va in un reattore post-digestore e da lì ulteriormente in serbatoi di stoccaggio. I digestati sono adatti per usi come la fertilizzazione dei campi. I digestati possono anche essere centrifugati per separare le parti solide e liquide.
I digestati solidi sono usati come fertilizzanti in agricoltura o in paesaggistica e possono anche essere trasformati in terreno da giardinaggio attraverso un processo di maturazione che coinvolge il compostaggio. I digestati vengono centrifugati per ottenere acqua di processo per la slurrificazione dei rifiuti organici all’inizio del processo. Questo aiuta a ridurre l’uso di acqua pulita. Il liquido centrifugato è ricco di sostanze nutritive, in particolare di azoto, che può essere ulteriormente separato usando metodi come la tecnologia dello stripping e usato come fertilizzante o fonte di nutrimento nei processi industriali. Il metano che può essere ottenuto da diversi sottoprodotti/rifiuti è mostrato nella Fig. 4.
Fasi della produzione del biogas. La digestione anaerobica è un processo a più fasi in cui l’idrolisi è uno dei passaggi principali. Durante l’idrolisi le macromolecole del substrato insolubile complesso vengono idrolizzato in intermedi più semplici e solubili dai batteri.
Un gran numero di specie microbiche, agendo di concerto, sono in grado di utilizzare substrati organici come carboidrati, proteine e lipidi per produrre acidi grassi volatili (VFA), che possono essere convertiti in metano e anidride carbonica da microrganismi metanogeni. I batteri espelleno enzimi che idrolizzano il substrato di particolato a piccole molecole trasportabili, che possono passare attraverso la membrana cellulare. Una volta all’interno della cellula, queste semplici molecole vengono utilizzate per fornire energia e sintetizzare componenti cellulari. I polisaccaridi vengono convertiti in zuccheri semplici; l’idrolisi della cellulosa da parte degli enzimi cellulasi produce glucosio; la degradazione dell’emicellulosa provoca monosaccaridi come xilosio, glucosio, galattosio, pentosi, arabinosio e mannosio, mentre l’amido viene convertito in glucosio dagli enzimi amilasi. Di seguito sono descritti uno schema del processo e esempi di microrganismi coinvolti (Fig. 5).
Fig. 5. Metanogenesi in habitat anaerobici
I metanogeni sono Archea. Essi possono vivere in habitat diversi e sono un gruppo eterogeneo di microrganismi. Mancano di nuclei cellulari e sono quindi procarioti. Gli Archaea sono stati inizialmente classificati come batteri, ricevendo il nome di archaebatteri (nel regno Archaebacteria), ma questo termine è caduto in disuso. Le cellule arcaiche hanno proprietà uniche che le separano dagli altri due domini, batteri ed eucarioti. Gli Archaea sono ulteriormente divisi in più phyla riconosciuti. La classificazione è difficile perché la maggior parte non sono stati isolati in laboratorio e sono stati rilevati solo dalle loro sequenze genetiche in campioni ambientali. Archaea e batteri sono generalmente simili per dimensioni e forma, anche se alcuni archaea hanno forme molto diverse. Nonostante questa somiglianza morfologica con i batteri, gli archei possiedono geni e diversi percorsi metabolici che sono più strettamente legati a quelli degli eucarioti, in particolare per gli enzimi coinvolti nella trascrizione e traduzione. Altri aspetti della biochimica degli archei sono unici, come la loro dipendenza dai lipidi eterei nelle loro membrane cellulari. Gli Archaea usano più fonti di energia rispetto agli eucarioti: queste vanno dai composti organici, come gli zuccheri, all’ammoniaca, agli ioni metallici o anche all’idrogeno gassoso. Gli archaea tolleranti al sale (gli Haloarchaea) usano la luce solare come fonte di energia, e altre specie di archaea fissano il carbonio, ma a differenza delle piante e dei cianobatteri, nessuna specie conosciuta di archaea fa entrambe le cose. Gli Archaea si riproducono asessualmente per fissione binaria, frammentazione o gemmazione; a differenza dei batteri, nessuna specie conosciuta di Archaea forma endospore. I primi archaea osservati erano estremofili, che vivevano in ambienti estremi, come sorgenti calde e laghi salati senza altri organismi. Il miglioramento degli strumenti di rilevamento molecolare ha portato alla scoperta di archaea in quasi tutti gli habitat, compreso il suolo, gli oceani e le paludi. Gli archei sono particolarmente numerosi negli oceani, e gli archei nel plancton possono essere uno dei gruppi di organismi più abbondanti del pianeta. Gli archaea sono una parte importante della vita sulla Terra. Fanno parte del microbiota di tutti gli organismi. Nel microbioma umano, sono importanti nell’intestino, nella bocca e sulla pelle. La loro diversità morfologica, metabolica e geografica permette loro di svolgere molteplici ruoli ecologici: la fissazione del carbonio, il ciclo dell’azoto, il ricambio dei composti organici, il mantenimento delle comunità microbiche simbiotiche e sintrofiche, la formazione del metano.
I substrati per la metanogenesi sono una vasta gamma e sono elencati di seguito.
Fig. 6. Substrati per metanogenesi
Bioetanolo
Verrà descritto l’uso del bioetanolo in Europa e saranno presentati i principali microrganismi utilizzati per la produzione di bioetanolo (lieviti e batteri) e le loro prestazioni saranno confrontate.
Fig. 7. Produzione di etanolo vs bioetanolo
L’etanolo è ampiamente usato come solvente, reagente, nell’industria alimentare e nel carburante automobilistico (Fig. 7 e 8). La produzione di etanolo per fermentazione si basa sull’uso di materie prime, microrganismi e tecnologie diverse da quelle utilizzate per la produzione di bevande alcoliche (vino e birra) al fine di avere la massima resa in etanolo nel più breve tempo possibile e con i costi più bassi. Il 95% della produzione mondiale di etanolo è il BIOETANOLO (processo di fermentazione dello zucchero), mentre che solo il 5% è prodotto dal processo chimico di reazione dell’etilene con vapore.
Fig. 8. Uso del bioetanolo sul mercato dell’UE
Il bioetanolo è il principale combustibile utilizzato come sostituto della benzina per i veicoli di trasporto su strada. L’etanolo o alcol etilico (C2H5OH) è un liquido limpido incolore, biodegradabile, a basso contenuto di tossicità e causa poco inquinamento ambientale se versato. L’etanolo brucia producendo anidride carbonica e acqua. L’etanolo è un carburante ad alto numero di ottani e ha sostituito il piombo come potenziatore di ottani nella benzina. Miscelando l’etanolo con la benzina possiamo anche ossigenare la miscela di carburante in modo che bruci più completamente e riduca le emissioni inquinanti. Le miscele di etanolo sono ampiamente vendute negli Stati Uniti. La miscela più comune è 10% etanolo e 90% benzina (E10). I motori dei veicoli non richiedono modifiche per funzionare con l’E10 e anche le garanzie dei veicoli non ne risentono. Solo i veicoli a carburante flessibile possono funzionare con miscele di etanolo fino all’85% e 15% di benzina (E85).
Le principali fonti di zucchero necessarie per produrre etanolo provengono da colture di combustibile o di energia. Queste colture sono coltivate specificamente per uso energetico e comprendono colture di mais, mais e grano (bioetanolo di 1a generazione), paglia di scarto, salicee alberi popolari, rifiuti forestali e agricoli, residui della produzione di pasta di legno, rifiuti solidi urbani (bioetanolodi seconda generazione), bioetanolo di terza generazione è stato derivato dalla biomassa algale tra cui microalghe e macroalghe (Fig. 9).
Fig. 9. Primo, secondo e thirg
Benefici del bioetanolo. Il bioetanolo ha una serie di vantaggi rispetto ai carburanti convenzionali. Proviene da una risorsa rinnovabile, cioè le colture e non da una risorsa finita e le colture da cui deriva possono crescere bene in Europa (come i cereali, la barbabietola da zucchero e il mais). Un altro vantaggio rispetto ai combustibili fossili sono le emissioni di gas serra. La rete di trasporto su strada rappresenta il 22% di tutte le emissioni di gas a effetto serra e attraverso l’uso del bioetanolo, alcune di queste emissioni saranno ridotte poiché le colture di carburante assorbono la CO2 che emettono attraverso la crescita. Inoltre, la miscelazione del bioetanolo con la benzina aiuterà a prolungare la vita delle scorte di petrolio in diminuzione e a garantire una maggiore sicurezza del carburante, evitando una pesante dipendenza dalle nazioni produttrici di petrolio. Incoraggiando l’uso del bioetanolo, l’economia rurale riceverebbe anche una spinta dalla coltivazione delle colture necessarie. Il bioetanolo è anche biodegradabile e molto meno tossico dei combustibili fossili. Inoltre, utilizzando il bioetanolo nei motori più vecchi può aiutare a ridurre la quantità di monossido di carbonio prodotto dal veicolo migliorando così la qualità dell’aria. Un altro vantaggio del bioetanolo è la facilità con cui può essere facilmente integrato nel sistema di carburante esistente per il trasporto stradale. In quantità fino al 5%, il bioetanolo può essere miscelato con il carburante convenzionale senza bisogno di modifiche al motore.
Il bioetanolo può essere prodotto dalla biomassa attraverso i processi di idrolisi e di fermentazione degli zuccheri. I rifiuti di biomassa contengono una miscela complessa di polimeri di carboidrati dalle pareti cellulari delle piante come cellulosa, emicellulosa e lignina. Per produrre zuccheri dalla biomassa, la biomassa viene pretrattata con acidi o enzimi al fine di ridurre la dimensione della materia prima e di distruggere la struttura della pianta. La cellulosa e le porzioni di emi cellulosa vengono scomposte (idrolizzate) da enzimi o acidi diluiti in zucchero saccarosio che viene poi fermentato in etanolo. La lignina che è anche presente nella biomassa è normalmente usata come combustibile per le caldaie degli impianti di produzione dell’etanolo.
Ci sono tre metodi principali per estrarre gli zuccheri dalla biomassa: idrolisi acida concentrata, idrolisi acida diluita e idrolisi enzimatica. Il primo funziona aggiungendo il 70-77% di acido solforico alla biomassa che è stata essiccata al 10% di umidità. L’acido viene aggiunto nel rapporto di 1,25 acido per 1 biomassa e la temperatura viene controllata a 50 °C. Viene poi aggiunta acqua per diluire l’acido al 20-30% e la miscela viene nuovamente riscaldata a 100 °C per 1 ora. Il gel prodotto da questa miscela viene poi pressato per rilasciare una miscela di zucchero acido e viene usata una colonna cromatografica per separare la miscela di acido e zucchero. Il processo di idrolisi con acido diluito è uno dei metodi più antichi, semplici ed efficienti per produrre etanolo dalla biomassa. L’acido diluito è usato per idrolizzare la biomassa in saccarosio. La prima fase utilizza lo 0,7% di acido solforico a 190 °C per idrolizzare l’emicellulosa presente nella biomassa. Il secondo stadio è ottimizzato per produrre la frazione di cellulosa più resistente. Ciò si ottiene utilizzando lo 0,4% di acido solforico a 215 °C. Gli idrolati liquidi vengono poi neutralizzati e recuperati dal processo. Invece di usare l’acido per idrolizzare la biomassa in saccarosio, possiamo usare gli enzimi per scomporre la biomassa in modo simile.
Il mais, una delle fonti più agricole per ottenere l’etanolo, può essere trasformato in etanolo mediante la fresatura a secco o il processo di fresatura a umido. Nel processo di fresatura a umido, il chicchi di mais è intriso di acqua calda, questo aiuta a scomporsi le proteine e rilasciare l’amido presente nel mais e aiuta ad ammorbidire il nocciolo per il processo di fresatura. Il mais viene quindi macinato per produrre prodotti germinali, fibre e amido. Il germe viene estratto per produrre olio di mais e la frazione di amido subisce centrifugazione e saccarinazione per produrre torta bagnata al glutine. L’etanolo viene quindi estratto mediante il processo di distillazione. Il processo di fresatura a umido viene normalmente utilizzato nelle fabbriche che producono diverse centinaia di milioni di galloni di etanolo ogni anno. Il processo di fresatura a secco comporta la pulizia e la scompizione del chicchi di mais in particelle fini utilizzando un processo di fresatura a martello. Questo crea una polvere con una consistenza del tipo di farina del corso. La polvere contiene il germe di mais, l’amido e la fibra. Per produrre una soluzione zuccherina la miscela viene quindi idrolita o scomposta in zuccheri di saccarosio utilizzando enzimi o un acido diluito. La miscela viene quindi raffreddata e il lievito viene aggiunto per fermentare la miscela in etanolo.
Processo di fermentazione dello zucchero
Il processo di idrolisi scompone la parte cellulosica della biomassa o del mais in soluzioni zuccherine che possono quindi essere fermentate in etanolo. Il lievito viene aggiunto alla soluzione, che viene quindi riscaldata.
Fig. 10. Fermentazione alcolica del lievito
Le caratteristiche principali del microrganismo da utilizzare nella produzione industriale di etanolo sono:
– elevate rese di conversione molare dello zucchero (moli di etanolo prodotte/moli di zucchero consumato)
– elevato tasso di produzione (moli di etanolo prodotto/tempo × volume di coltura) mol/Lh o g/Lh
– elevate rese di etanolo in peso (grammi di etanolo/volumi di coltura prodotti, ≥ 120 g/L) g/L
– elevata tolleranza all’etanolo
– produzione il più bassa possibile di prodotti collaterali derivati da fermentazioni laterali (ad es. glicerolo)
Lieviti per la fermentazione del bioetanolo: Microrganismi come i lieviti svolgono un ruolo essenziale nella produzione di bioetanolo fermentando un’ampia gamma di zuccheri in etanolo. Sono utilizzati in impianti industriali a causa di preziose proprietà nella resa dell’etanolo (resa teorica del >90,0%, tolleranza all’etanolo (>40,0 g/L), produttività dell’etanolo (>1,0 g/L/h), crescita in mezzi semplici ed economici e brodo di fermentazione non diluito con resistenza agli inibitori e contaminanti ritardati dalle condizioni di crescita. Come componente principale della fermentazione, i lieviti influenzano la quantità di resa di etanolo. Saccharomyces cerevisiae è il lievito più utilizzato. Da migliaia di anni fa, S. cerevisiae è stato utilizzato nella produzione di alcol, specialmente nell’industria del birrificio e del vino. Mantiene basso il costo di distillazione in quanto dà un’elevata resa di etanolo, un’alta produttività e può resistere ad un’alta concentrazione di etanolo. Al giorno d’oggi, i lieviti vengono utilizzati per generare etanolo combustibile da fonti di energia rinnovabili. Alcuni ceppi di lievito appartenenti alla specie Pichia stipitis, S. cerevisiae e Kluyveromyces fagilis sono stati segnalati come buoni produttori di etanolo da diversi tipi di zuccheri. S. cerevisiae tollera una vasta gamma di pH rendendo così il processo meno suscettibile alle infezioni. Il lievito di panificazione era tradizionalmente usato come coltura iniziale nella produzione di etanolo a causa del suo basso costo e della facile disponibilità. Tuttavia, il lievito di panificazione e altri ceppi di S. cerevisiae non erano in grado di competere con lieviti di tipo selvatico che causavano contaminazione durante i processi industriali. Condizioni stressanti come un aumento della concentrazione di etanolo, temperatura, stress osmotico e contaminazione batterica sono i motivi per cui il lievito non può sopravvivere durante la fermentazione. I lieviti flocculanti sono stati utilizzati anche durante la fermentazione biologica per la produzione di etanolo in quanto facilitano la lavorazione a valle, consentono il funzionamento ad alta densità cellulare e danno una maggiore produttività complessiva. Riduce il costo del recupero delle cellule in quanto si separa facilmente dal mezzo di fermentazione senza centrifugazione. Ci sono sfide comuni per i lieviti durante la fermentazione dello zucchero che sono l’aumento della temperatura (35-45 °C) e la concentrazione di etanolo (oltre il 20%). Il tasso di crescita dei lieviti e il metabolismo aumentano con l’aumentare della temperatura fino a raggiungere il valore ottimale. L’aumento della concentrazione di etanolo durante la fermentazione può causare l’inibizione della crescita e della vitalità dei microrganismi. L’incapacità di S. cerevisiae di crescere in mezzi contenenti alto livello di alcol porta all’inibizione della produzione di etanolo. Gli altri problemi nella fermentazione del bioetanolo da parte del lievito sono la capacità di fermentare gli zuccheri pentosi. S. cerevisiae è il più comunemente usato nella produzione di bioetanolo. Tuttavia, può solo fermentare esosi ma non pentosi. Solo alcuni lieviti dei generi Pichia, Candida, Schizosaccharomyces e Pachysolen sono in grado di fermentare i pentosi in etanolo. L’efficienza della produzione di etanolo su scala industriale sarà aumentata utilizzando lieviti tolleranti agli inibitori. Le sfide comuni dei lieviti possono essere superate utilizzando lievito tollerante all’etanolo e termotollerante. I ceppi tolleranti all’etanolo e termotolleranti che possono resistere alle sollecitazioni possono essere isolati da risorse naturali come suolo, acqua, piante e animali. La fermentazione dell’etanolo ad alta temperatura è un processo benefico in quanto seleziona microrganismi termo-tolleranti e non richiede costi di raffreddamento e cellulasi. Ad esempio, K. marxianus è lievito termotollerante che è in grado di co-fermentare sia gli zuccheri di esosio che di pentosio e può sopravvivere alla temperatura di 42-45 °C.
Zymomonas mobilis per la fermentazione del bioetanolo: Zymomonas mobilis è un batterio gram negativo, anaerobico facultativo, non sporulante, polarmente fagellato, a forma di bastone. È l’unica specie del genere Zymomonas. Ha notevoli capacità di produzione di bioetanolo, che superano il lievito in alcuni aspetti. Originariamente era isolato da bevande alcoliche come il vino di palma africano, la pulque messicana, e anche come contaminante di sidro e birra (malattia del sidro e deterioramento della birra) nei paesi europei. Zymomonas mobilis degrada gli zuccheri in piruvato usando la via Entner-Doudoroff. Il piruvato viene quindi fermentato per produrre etanolo e anidride carbonica come unici prodotti (analoghi al lievito). I vantaggi di Z. mobilis rispetto a S. cerevisiae per quanto riguarda la produzione di bioetanolo sono:
- maggiore assorbimento di zucchero e resa di etanolo (fino a 2,5 volte superiore),
- minore produzione di biomassa,
- maggiore tolleranza all’etanolo fino al 16% (v/v),
- non richiede l’aggiunta controllata di ossigeno durante la fermentazione.
Tuttavia, nonostante questi interessanti vantaggi, diversi fattori impediscono l’uso commerciale di Z. mobilis nella produzione di etanolo cellulosico. Il principale ostacolo è che la sua gamma di substrati è limitata a glucosio, fruttosio e saccarosio. Z. mobilis di tipo selvatico non può fermentare zuccheri C5 come xilosio e arabinosio che sono componenti importanti degli idrolisati lignocellulosici. A differenza di E. coli e lievito, Z. mobilis non può tollerare gli inibitori tossici presenti negli idrolati lignocellulosici come l’acido acetico e vari composti fenolici. La concentrazione di acido acetico negli idrolati lignocellulosici può raggiungere l’1,5% (w/v), che è ben al di sopra della soglia di tolleranza di Z. mobilis. Z. mobilis ingegnerizzato potrebbe superare le sue carenze intrinseche e quindi espandere la sua gamma di substrati per includere zuccheri C5 come xilosio e arabinosio. Ceppi acetici resistenti agli acidi di Z. mobilis sono stati sviluppati da sforzi razionali di ingegneria metabolica, tecniche di mutagenesi o mutazione adattiva. Inoltre, un ampio processo di adattamento è stato utilizzato per migliorare la fermentazione dello xilosio in Z. mobilis. Adattando un ceppo in un’alta concentrazione di xilosio, si sono verificate alterazioni significative del metabolismo. Un cambiamento notevole è stato la riduzione dei livelli di xilitolo, un sottoprodotto della fermentazione dello xilosio che può inibire il metabolismo dello xilosio del ceppo. Una caratteristica interessante di Z. mobilis è che la sua membrana plasmatica contiene opanoidi, composti pentaciclici simili agli steroli eucarioti. Ciò gli consente di avere una tolleranza straordinaria all’etanolo nel suo ambiente, circa il 13%.
Un confronto tra la produzione di bioetanolo da parte di S. cerevisiae e Z. mobilis è mostrato nella Fig. 11.
Fig. 11. Confronto tra diversi agenti microbici che operano la fermentazione
Biotecnologie per la bonifica dei siti contaminati
Acque di scarico
Fig. 12. Posizione e utilizzo dell’acqua
l’acqua è una risorsa da proteggere. Qui sotto trovate le principali località dove si trova l’acqua dolce sulla terra e alcune delle ragioni per cui l’acqua si sta lentamente esaurendo. Quasi il 70% dell’acqua oggi viene consumata per l’agricoltura, circa un quarto per usi commerciali, e circa il 10% viene utilizzato per scopi domestici. Pertanto, il principale settore che utilizza l’acqua è l’agricoltura/agricoltura. L’acqua agricola è usata principalmente per l’irrigazione, così come per l’applicazione di pesticidi e fertilizzanti e per l’allevamento. Ci sono tre fonti per l’acqua agricola: i) l’acqua di falda da pozzi sotterranei; ii) l’acqua di superficie che deriva da canali aperti, ruscelli, canali di irrigazione e deviata da serbatoi; iii) l’acqua piovana che viene solitamente raccolta in barili, vasche e grandi cisterne. L’acqua è spesso avvelenata. Le principali cause di avvelenamento sono: uso domestico dell’acqua (materia organica, tensioattivi….), uso agricolo e industriale dell’acqua (fertilizzanti e pesticidi, acqua derivante da processi industriali), atmosfera (contaminazione dell’acqua piovana da sostanze tossiche presenti nell’atmosfera, derivanti da industrie, aerei, motori di autoveicoli).
La direttiva 2000/60/CE del Parlamento europeo ha stabilito un quadro per le azioni comunitarie nel settore della politica in materia di acque. Questa legislazione stabilisce un quadro per la protezione delle acque superficiali interne, delle acque costiere e delle acque sotterranee. Gli obiettivi della direttiva sono:
– la salvaguardia contro un ulteriore deterioramento;
– il miglioramento dello stato degli ecosistemi;
– la promozione di un uso sostenibile dell’acqua;
– la riduzione dell’inquinamento delle acque sotterranee;
– la riduzione degli scarichi;
– mitigazione degli effetti delle inondazioni e della siccità.
La depurazione delle acque reflue si ottiene attraverso diversi trattamenti che vengono spesso applicati in sequenze: trattamenti primari, secondari (biologici), terziari come indicato nella foto) (Fig. 13 e 14).
Fig. 13 (sopra) e 14 (sotto). Trattamento primario, secondario e terziario per la depurazione biologica delle acque reflue
Le processo fanghi attiva è uno dei più comunemente utilizzati per trattamento secondario delle acque reflue di origine civile e industriale. È un processo di trattamento biologico a crescita sospesa, che utilizza una densa coltura microbica in sospensione per biodegradare materiale organico in condizioni aerobiche e formare spontaneamente un flocculo biologico (denominati fanghi attivi). L’aerazione diffusa o meccanica mantiene l’ambiente aerobico nel reattore. I tempi di ritenzione tipici sono di 5-14 ore nelle unità convenzionali che salgono a 24-72 nei sistemi a bassa velocità. Il processo dei fanghi attivi dipende dall’azione biologica aerobica (Fig. 15). I microrganismi scompongono le sostanze organiche complesse in semplici molecole tra cui acqua e CO2. Questo processo comporta la rimozione di materia organica solubile e sospesa dalle acque reflue. La crescita di microrganismi in presenza di ossigeno disciolto rimuove la maggior parte della materia inquinante; a loro volta, i protozoi crescono e si nutrono di questi organismi. L’equilibrio che ne risulta è di una cultura vivente in sospensione forma nei fiocchi dei fanghi attivi. Gli elementi principali del sistema includono un serbatoio di aerazione (trattamento secondario) in cui le acque reflue vengono accuratamente miscelate con fanghi e ossigeno attivati continuamente. Da questa parte del processo, passa in una vasca di chiarificazione (sedimentazione secondaria), in cui i fanghi depositati vengono rimossi dall’acqua purificata per essere riciclati dalle pompe di fanghi attivi di ritorno. Affinché questo sistema funzioni, devono essere soddisfatti due requisiti: il dispositivo di aerazione deve essere in grado sia di trasferire ossigeno dall’atmosfera al liquido, sia di distribuire questo ossigeno in tutta l’acqua di scarico al microrganismo vivente sospeso. Questo tipo di sistema è adatto per rifiuti a bassa resistenza, tipicamente dell’ordine di 50-200 mg L-1 BOD. Si può anche applicare un pre o post-trattamento delle acque reflue. Dopo il bacino di aerazione, la miscela di microrganismi e acque reflue (liquido misto) fluisce in un bacino di decantazione o chiarificatore dove il fango è lasciato sedimentare. Una parte del volume del fango viene continuamente ricircolato dal chiarificatore, come fango attivato di ritorno, di nuovo al bacino di aerazione per assicurare che una quantità adeguata di microrganismi sia mantenuta nel serbatoio di aerazione. I microrganismi sono di nuovo mescolati con l’acqua di scarico in entrata dove vengono riattivati per consumare i nutrienti organici. Poi il processo ricomincia.
Il processo dei fanghi attivi, in condizioni adeguate, è molto efficiente. Rimuove l’85-95% dei solidi e riduce la domanda biochimica di ossigeno (BOD) della stessa quantità. L’efficienza di questo sistema dipende da molti fattori, tra cui il clima e le caratteristiche delle acque reflue. I rifiuti tossici che entrano nel sistema di trattamento possono interrompere l’attività biologica. Rifiuti pesanti in saponi o detergenti possono causare un’eccessiva schiuma e quindi creare problemi estetici o di disturbo. Nelle aree in cui i rifiuti industriali e sanitari sono combinati, le acque reflue industriali devono spesso essere pretrattate per rimuovere i componenti chimici tossici prima di essere scaricate nel processo di trattamento dei fanghi attivi. Tuttavia, il trattamento microbiologico delle acque reflue è di gran lunga il processo più naturale ed efficace per rimuovere i rifiuti dall’acqua.
Popolazioni microbiche nei fanghi attivati: La comunità microbica che partecipa al processo di depurazione biologica forma agglomerati di fiocchi che sono chiamati fanghi attivi. I fanghi attivi di un impianto di trattamento secondario sono una coltura microbica che si sviluppa attorno a particelle organiche e inorganiche e che metabolizza la materia organica presente nelle acque reflue. I fiocchi dei fanghi attivi tendono a depositarsi nella fase di sedimentazione “secondaria” a causa della gravità. Diversi gruppi di microrganismi sono responsabili del processo di depurazione:
I batteri sono principalmente responsabili della rimozione dei nutrienti organici dalle acque reflue. Essi sviluppano anche uno strato appiccicoso di melma intorno alla parete cellulare che permette loro di raggrupparsi per formare bio-solidi o fanghi che vengono poi separati dalla fase liquida. Il successo della rimozione dei rifiuti dall’acqua dipende dall’efficienza con cui i batteri consumano il materiale organico e dall’abilità dei batteri di attaccarsi insieme, formare fiocchi, e depositarsi fuori dal fluido sfuso. Le caratteristiche di flocculazione (raggruppamento) dei fanghi inattivati dei microrganismi permettono loro di ammassarsi per formare masse solide abbastanza grandi da depositarsi sul fondo del bacino di decantazione.
I FUNGI sono anche organismi eterotrofi che aiutano nella degradazione della materia organica.
I protozoi giocano un ruolo critico nel processo di trattamento rimuovendo e digerendo i batteri dispersi a nuoto libero e altre particelle sospese. Questo migliora la chiarezza dell’effluente delle acque reflue. Come i batteri, alcuni protozoi hanno bisogno di ossigeno, altri richiedono pochissimo ossigeno e alcuni possono sopravvivere senza ossigeno. I tipi di protozoi presenti sono classificati come segue:
Amebe à Poco effetto sul trattamento e muoiono quando la quantità di cibo diminuisce
Flagellati à Si nutrono principalmente di nutrienti organici solubili
Ciliatià Chiarificano l’acqua rimuovendo i batteri sospesi.
I rotiferi e i nematodi sono organismi pluricellulari che sono più grandi della maggior parte dei protozoi e non rimuovono fondamentalmente il materiale organico dalle acque reflue. Anche se possono mangiare i batteri, si nutrono anche di alghe e protozoi. Una dominanza di metazoi si trova di solito in sistemi di età più lunga, vale a dire i sistemi di trattamento lagunare. Anche se il loro contributo nel sistema di trattamento dei fanghi attivi è piccolo, la loro presenza indica le condizioni del sistema di trattamento.
In addition to activated sludge plants, there are other types of secondary wastewater treatment processes. Some of them can be IMMOBILIZED CELLS PROCESSES, as indicated in Fig. 16.
Fig. 16. Immobilized cell tecnologies for the depuration of wastewater
I filtri percolatori sono una tecnologia di depurazione biologica mediante microrganismi che si sviluppano, in ambiente aerobico, su materiali di supporto appropriati, attraverso i quali le acque reflue percolano. Il serbatoio del filtro percolatore è riempito con materiali inerti, naturali o sintetici (ad esempio pietre) attraverso i quali le acque reflue vengono alimentate dall’alto. Le FASI DI DEPURAZIONE comprendono: 1) Trattamenti primari per evitare l’ostruzione del letto; 2) Formazione del biofilm (3-4 mm di spessore); 3) Distacco delle cellule dal biofilm e ricostituzione del biofilm; 4) Sedimentazione finale. I principali vantaggi di questa tecnologia sono il basso costo di allestimento e manutenzione e il fatto che possono tollerare la variazione del carico organico dell’affluente. I principali svantaggi sono le grandi aree per l’allestimento e i problemi di cattivi odori. I biocircoli sono una versione modificata dei filtri percolatori, in cui le superfici che portano il biofilm ruotano attorno ad un asse, immerse per metà nel liquido da trattare; la rotazione permette l’ossigenazione della biomassa aderita al disco. I sistemi anaerobici funzionano bene quando la portata in entrata è bassa e il carico organico in entrata è sufficientemente alto. L’efficienza di depurazione richiesta non è alta (i microrganismi anaerobici sono caratterizzati da un tasso di crescita inferiore e da un metabolismo più lento rispetto a quelli aerobici, quindi la materia organica non è completamente degradata). Queste condizioni sono tipiche di alcune acque reflue industriali, i reattori anaerobici non funzionano bene per il trattamento di effluenti civili su larga scala.
Un altro sistema importante per la depurazione delle acque reflue è la fitodepurazione (Fig. 17), che è una: tecnologia di depurazione caratterizzata da trattamenti biologici, in cui le piante che crescono in terreni saturi d’acqua sviluppano un ruolo chiave aiutate dall’azione diretta dei batteri che colonizzano l’apparato radicale e il portainnesto.
Fig. 17. Caratteristiche generali della fitodepurazione.
Questi trattamenti sono visti sia come alternativa che come supporto ai sistemi tradizionali basati su processi biologici e reazioni chimiche e fisiche. Il termine “Zone umide” indica i sistemi di “Fitodepurazione” delle acque reflue progettati per creare artificialmente le stesse condizioni ecologiche che si stabiliscono naturalmente nelle zone acquatiche. “Fitodepurazione” sistemi ingegnerizzati, progettati e costruiti per riprodurre i processi autodepurativi naturali in un ambiente controllabile. Rispetto alle zone umide naturali, i sistemi di fitodepurazione permettono la scelta del sito, la flessibilità nella dimensione, il controllo dei flussi idraulici e dei tempi di ritenzione. Le funzioni di fitodepurazione possono essere preferite e sfruttate ulteriormente con opportune strategie, come la scelta delle specie vegetali e del substrato e il controllo del flusso dell’acqua. Con i sistemi di fitodepurazione, le sostanze inquinanti vengono rimosse attraverso una combinazione di processi chimici, fisici e biologici. I processi più efficaci sono la sedimentazione, la precipitazione, l’adsorbimento, l’assimilazione dalle piante e l’attività microbica. La tecnologia di fitodepurazione aggiunge la capacità adsorbente del mezzo al tradizionale trattamento depurativo di ossidazione biologica (azione di filtraggio da parte delle radici delle piante che forniscono anche una grande superficie adatta allo sviluppo delle masse microbiche coinvolte nel trattamento) e la rimozione dei nutrienti grazie alla loro crescita. Differenti strategie vengono descritte nella Fig. 18:
Fig. 18. Diverse strategie di fitodepurazione
Le macrofite galleggianti, compreso il giacinto d’acqua (Eichhornia crassipes), sono organismi invasivi dominanti nei sistemi acquatici tropicali e possono giocare un ruolo importante nel modificare lo scambio di gas tra l’acqua e l’atmosfera. Le idrofite sono piante che vivono in acqua e si adattano all’ambiente circostante. O rimangono completamente sommerse nell’acqua o la maggior parte delle loro parti del corpo rimangono sotto l’acqua. Nell’immagine si possono distinguere diversi esempi di sistemi di idrofite emergenti.
Suoli contaminati
Quale destino possono avere nell’ambiente (Fig. 20)?
Fig. 19. Definizione di xenobiotici
Which fate can they have in the environment (Fig. 19)?
Fig. 20. Destino degli xenobiotici nell’ambiente
Xenobiotici non sono necessariamente molecole estrinsece alla biosfera, ma possono anche essere molecole naturali presenti in concentrazioni non naturali nell’ambiente. Non sono necessariamente molecole tossiche, ma, in generale, sono recalcitranti alla biodegradazione.
Le molecole antropogeniche possono derivare da diverse fonti:
1) Industria petrolchimica: – combustibili (miscele di idrocarburi alifatici e aromatici), – prodotti chimici puri per l’industria chimica e farmaceutica (alcoli, eteri, esteri, aldeidi frequentemente sostituito con Cl-, gruppi amminici o nitrici
2) Industria della cellulosa e della carta: utilizzare il legno come materia prima e produrre pasta di legno, carta e altri prodotti a base di cellulosa. – lo sbiancamento della carta con prodotti a base di cloro produce molecole alogenate, compresa la cloro-lignina
3) Industria della plastica sintetica: stirene, cloruro di vinile, solventi, agenti di collegamento incrociato per produrre polimeri.
4) Industria dei pesticidi: benzene e derivati eterociclici, urea, composti organofosforici
5) Industria farmaceutica e cosmetica
6) Industria tessile: reagenti per produrre fibre sintetiche, detergenti per ammorbidire fibre e pesticidi per il controllo di insetti / falene
7) Industria della verniciatura
8) uso domestico di prodotti chimici (prodotti per l’igiene personale, prodotti per la pulizia, ….)
Un tipico esempio di molecole naturali presenti in concentrazioni non naturali è quello delle acque reflue del frantoio: derivano dalla molitura delle olive per produrre olio d’oliva, ma hanno un ALTO COD (vedi sotto) e devono essere trattate prima di essere scartate nell’ambiente.
Bisogna rispondere a diverse domande prima di decidere se un terreno contaminato può essere sottoposto a un trattamento di biorisanamento. Il primo aspetto da considerare è se si tratta di un terreno contaminato cronico o di una contaminazione recente e improvvisa. Nel primo caso, possiamo prendere un po’ di tempo per decidere cosa fare, studiare a fondo la situazione, fare qualche test di laboratorio preliminare e decidere la strategia migliore. Nel secondo caso, dobbiamo agire prontamente seguendo le esperienze che sono state raccolte per gli stessi contaminanti e gli stessi suoli.
Leggere le domande a cui bisogna rispondere prima di DECIDERE LA STRATEGIA DA APPLICARE (Fig. 21).
Fig.21
Una vasta gamma di tecnologie di biorisanamento può essere utilizzata per la decontaminazione di siti contaminati (Fig. 22).
Fig. 22. Tecnologie di biorisanamento in situ ed ex situ
IN SITU significa che il terreno non viene rimosso dalla sua posizione originale e viene trattato nello stesso luogo in cui si è verificata la contaminazione.
ATTENUAZIONE NATURALE: all’interno di questo termine sono inclusi “una varietà di processi fisici, chimici o biologici”. Questi processi, in condizioni favorevoli, agiscono senza l’intervento umano per ridurre la concentrazione, la tossicità e la mobilità dei contaminanti nel suolo o nelle acque sotterranee. Questi processi in situ includono la biodegradazione. Viene eseguito un monitoraggio preciso del processo, al fine di assicurarsi che il terreno sia riparato. L’uso dell’attenuazione naturale è spesso proposto come soluzione correttiva per benzene, toluene, etilbenzene e xilene (BTEX). Più recentemente, è stata proposta un’attenuazione naturale per solventi clorurati, nitroaromatici, metalli pesanti e altri contaminanti per i quali la comprensione scientifica e l’esperienza sul campo sono abbastanza solide. L’attenuazione naturale viene applicata quando vi sono prove solide che i processi di attenuazione naturale stanno trasformando i contaminanti in prodotti innocui.
BIOAUGMENTAZIONE: è l’aggiunta di colture microbiche al fine di accelerare il tasso di degradazione di un contaminante. I microrganismi indigeni presenti nelle aree contaminate possono già essere in grado di abbattere i contaminanti, ma la loro azione può essere inefficiente e lenta. La bioaugmentazione richiede lo studio delle varietà indigene presenti nel luogo per determinare se la biostimolazione è possibile. Le stesse colture batteriche indigene possono essere isolate, coltivate e implementate nel luogo per aumentare la degradazione dei contaminanti. Se la varietà indigena non ha la capacità metabolica di eseguire il processo di correzione, possono essere introdotte varietà esogene con diverse vie di degradazione.
biostimolazione: è l’aggiunta di integratori alimentari per il microbiota indigena per promuoverne il metabolismo. Di solito, si riferisce all’aggiunta di nutrienti limitanti come fosforo, azoto, ossigeno, donatori di elettroni in siti gravemente inquinati per stimolare i batteri esistenti a degradare i contaminanti pericolosi e tossici. L’aggiunta di questi nutrienti migliora il potenziale di degradazione dei microrganismi indigeni. Tra tutte le tecniche di biorimediazione, la biostimolazione è considerata il metodo più efficiente per la bonifica degli idrocarburi, in particolare dei prodotti petroliferi e dei suoi derivati. Ciò è dovuto principalmente alla facile disponibilità di fonti di carbonio che è uno dei nutrienti limitanti di velocità richiesti dai microrganismi indigeni per le loro attività metaboliche dai contaminanti del petrolio. Oltre al tasso menzionato che limita i nutrienti, l’implementazione di altri nutrienti ricca di materia organica può anche innescare ampiamente il processo di correzione. In questo contesto, è stato dimostrato che l’aggiunta di biosolati (materia organica ricca di nutrienti) ottenuta dal trattamento delle acque reflue domestiche e dei fertilizzanti inorganici, ricchi di azoto e fosforo, può migliorare e accelerare il tasso di degradazione degli idrocarburi petroliferi.
BIOVENTING– denominata anche “Bioenhanced Soil Venting”, è una tecnologia in situ basata sulla stimolazione naturale dell’attività biologica indigena con l’introduzione di ossigeno attraverso un fluido d’aria; viene applicata con successo a qualsiasi sostanza organica biodegradabile aerobicamente, in particolare per la bonifica di siti inquinati da derivati del petrolio. L’assunzione di aria è a bassa portata in quanto è progettata solo per fornire l’ossigeno necessario per sostenere l’attività microbica. All’interno dell’area inquinata, i composti tossici vengono rimossi dal flusso d’aria mentre i composti organici sono biodegradabili aerobicamente. L’aria viene iniettata direttamente attraverso uno o più pozzi collegati a pompe per vuoto che forniscono la circolazione forzata dell’aria nel terreno contaminato insaturo. Vengono applicati anche sistemi di bioventilazione passiva che sfruttano lo scambio naturale di aria per trasportare ossigeno, una valvola unidirezione viene installata sopra lo sfiato esterno che consente all’aria di entrare solo quando la pressione all’interno del terreno contaminato è superiore a quella atmosferica.
Fig. 23. Tecnologia di fitoremediazione
FITOREMEDIAZIONE: È il trattamento del suolo contaminato con l’uso di piante per ripulire il suolo contaminato da contaminanti pericolosi (Fig. 23). È più propriamente definito come “l’uso di piante verdi e dei microrganismi associati, insieme a adeguati emendamenti del suolo e tecniche agronomiche per contenere, rimuovere o rendere innocui i contaminanti ambientali tossici”, perché le piante agiscono in sinergia con microrganismi rizosferici che, molto spesso, collaborano fortemente con le piante nella realizzazione del processo. La fitoremediazione si propone come un approccio plant-based economico di bonifica ambientale che sfrutta la capacità delle piante di concentrare elementi e composti dall’ambiente e di disintossicare vari composti. L’effetto di concentrazione deriva dalla capacità di alcune piante chiamate iperaccumulatori di bioaccumulare sostanze chimiche. L’effetto di correzione è molto diverso. I metalli pesanti tossici non possono essere degradati, ma gli inquinanti organici possono essere e sono generalmente i principali obiettivi per il fitoremediazione. Diverse prove sul campo hanno confermato la fattibilità dell’utilizzo di impianti per la pulizia ambientale.
EX SITU significa che il terreno viene rimosso dalla sua posizione originale e trattato molto vicino al sito in cui si è verificata la contaminazione (in loco) o lontano (fuori sede).
LANDFARMING– si tratta di una tecnologia di biorisanamento su larga scala, che richiede lo scavo e il posizionamento dei suoli, sedimenti o fanghi contaminati in situ in cui possono essere trattati; si tratta tipicamente di una tecnologia di bonifica in loco utilizzata per migliorare la degradazione microbica di composti pericolosi. Di solito, i trasportatori e le coperture in plastica vengono utilizzati per controllare la lisciviazione dei contaminanti in sotterraneo al fine di evitare la contaminazione delle falde acquifere. Le condizioni del suolo sono spesso controllate per ottimizzare il tasso di degradazione dei contaminanti, in particolare:
- Contenuto di umidità (di solito mediante irrigazione o irrorazione).
- Aerazione (attraverso la lavorazione del terreno con una frequenza predeterminata, il terreno viene mescolato e aerato).
- pH (tamponato vicino al pH neutro aggiungendo calcare frantumato o calce agricola).
- Altri emendamenti (ad esempio, agenti caricatori di suolo, sostanze nutritive, ecc.).
Il terreno contaminato viene solitamente trattato in strati che hanno uno spessore fino a 1 metro. Quando viene raggiunto il livello di trattamento desiderato, il sollevamento viene rimosso e ne viene posizionato uno nuovo. Molto spesso viene rimossa solo la parte superiore dello strato bonificato, poi il nuovo strato viene costruito aggiungendo altro terreno contaminato al materiale rimanente e mescolato. Questo serve a inoculare il materiale appena aggiunto con una cultura microbica che degrada attivamente e può ridurre i tempi di trattamento. Questa tecnica è stata usata con successo per anni nella gestione e nello smaltimento dei fanghi oleosi e di altri rifiuti delle raffinerie di petrolio. Generalmente, più alto è il peso molecolare della molecola bersaglio (cioè, più anelli all’interno di un idrocarburo policiclico aromatico), più lento è il tasso di degradazione. Inoltre, più il composto è clorurato o nitrato, più è difficile da degradare. I fattori che possono limitare l’applicabilità e l’efficacia del processo includono: (a) grandi requisiti di spazio; (b) le condizioni vantaggiose per la degradazione biologica dei contaminanti non possono essere raggiunte, il che aumenta la lunghezza del tempo per completare la bonifica, in particolare per i composti recalcitranti; (c) i contaminanti inorganici non vengono biodegradati; (d) il potenziale di grandi quantità di particolato rilasciato dalle operazioni; e (e) la presenza di ioni metallici può essere tossica per i microbi e può filtrare dal suolo contaminato nel terreno. La coltivazione del terreno, combinata con altri trattamenti biologici, è ampiamente utilizzata ed è stata applicata con successo a molti tipi di rifiuti, specialmente per lo smaltimento di fanghi oleosi e altri rifiuti della raffineria di petrolio.
COMPOSTAGGIO: Il compostaggio è un processo che lavora per accelerare il decadimento naturale del materiale organico fornendo le condizioni ideali per la crescita dei microrganismi (Fig. 24). Il prodotto finale di questo processo di decomposizione concentrato è un prodotto ricco di nutrienti (compost) che può aiutare le colture, le piante da giardino e gli alberi a crescere.
Fig. 24. Compostaggio
Il biorisanamento del compost si riferisce all’uso di un sistema biologico di microrganismi in un compost maturo e curato per sequestrare o abbattere i contaminanti nell’acqua o nel suolo. I microrganismi consumano i contaminanti nel suolo, nelle acque sotterranee e superficiali e nell’aria. I contaminanti sono digeriti, metabolizzati e trasformati in humus e sottoprodotti inerti, come anidride carbonica, acqua e sali. Il biorisanamento del compost si è dimostrato efficace nel degradare o alterare molti tipi di contaminanti, come idrocarburi clorurati e non, prodotti chimici per la conservazione del legno, solventi, metalli pesanti, pesticidi, prodotti petroliferi ed esplosivi. Il compost usato nel biorisanamento è definito compost “su misura” o “progettato” in quanto è fatto appositamente per trattare contaminanti specifici in siti specifici. L’obiettivo finale in qualsiasi progetto di bonifica è quello di riportare il sito alla sua condizione pre-contaminazione, che spesso include la rivegetazione per stabilizzare il terreno trattato. Oltre a ridurre i livelli di contaminanti, il compost favorisce questo obiettivo facilitando la crescita delle piante. In questo ruolo, il compost condiziona il terreno e fornisce anche nutrienti a un’ampia varietà di vegetazione.
BIOREATTORI: il trattamento di un suolo contaminato in un bioreattore è la migliore tecnologia di bonifica anche se è la più costosa (Fig. 25).
Fig. 25. Esempio di trattamento del suolo in un bioreattore
Si tratta di una tecnologia ex situ off site: il suolo, dopo la sua rimozione dal sito originale, può essere trattato lontano dalla sua posizione originale. Il suolo viene trattato in fase di slurry all’interno di un bioreattore fatto di diversi materiali (vetro, acciaio, cemento o altri materiali) e tutti i parametri del processo di bonifica sono monitorati e controllati per rendere il processo il più efficace possibile (pH, potenziale redox, temperatura, concentrazione dell’inquinante/i, presenza di metaboliti di degradazione). I microrganismi possono quindi lavorare nelle loro condizioni ottimali. Il trattamento di un suolo contaminato in un bioreattore è solitamente applicato per suoli contaminati da molecole particolarmente recalcitranti che sono difficilmente rimosse da altre tecnologie di bonifica (per esempio molecole altamente clorurate).
PUNTI DI FORZA e DI DEBOLEZZA delle tecnologie di biorisanamanto
PUNTI DI FORZA
– Riduzione dei costi rispetto alle strategie chimiche e fisiche (minori costi energetici);
– Ridotto impatto ambientale: il terreno può essere ri utilizzato in situ;
– Il problema (cioè la contaminazione) viene risolto (gli inquinanti scompaiono, non vengono semplicemente spostati da un sito all’altro);
– Accettabilità da parte dell’opinione pubblica.
D PUNTI DI DEBOLEZZA
– Problemi di biodisponibilità degli inquinanti;
– Problemi nel caso in cui gli inquinanti siano più di uno;
-Problemi di condizioni ambientali adeguate (pH, temperatura, disponibilità di ossigeno).
Test: LO7 Livello di base
Referenze
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Vantaggi ambientali derivanti dalle moderne applicazioni biotecnologiche e ICT
LIVELLO AVANZATO
Il processo di produzione del biogas è già stato descritto nella sezione di livello di base. Per riassumere quanto già descritto, nei paesi in via di sviluppo si è aumentato l’interesse per lo sviluppo di tecnologie per la produzione di fonti energetiche rinnovabili.
Sommario
Energia rinnovabile: biotecnologia per la produzione di biogas e bioetanolo (livello B)
Biogas
Il processo di produzione del biogas è già stato descritto nella sezione di livello di base. Per riassumere quanto già descritto, nei paesi in via di sviluppo si è aumentato l’interesse per lo sviluppo di tecnologie per la produzione di fonti energetiche rinnovabili. La digestione anaerobica ha ricevuto una nuova attenzione negli ultimi anni dalla crisi energetica dei primi anni ’70, e soprattutto dopo la guerra del Golfo. Il processo prevede il trattamento di rifiuti agricoli e industriali di vario tipo nella produzione di biogas. L’interesse per il trattamento anaerobico dei rifiuti agroindustriali è in aumento perché è economico, ha un fabbisogno energetico inferiore ed è ecologicamente sano, tra molti altri vantaggi, rispetto ai processi di trattamento aerobico. Il processo produce fanghi digeriti, che vengono utilizzati principalmente come fertilizzante per la produzione vegetale poiché i nutrienti nella materia prima rimangono nei fanghi mineralizzati come composti accessibili. Trattare i rifiuti per produrre carburante mentre riciclare i nutrienti costituisce un ciclo sostenibile.
La digestione anaerobica è un complesso processo naturale in due fasi di degradazione dei composti organici attraverso una varietà di intermedi in metano e anidride carbonica, per azione di un consorzio di microrganismi. L’interdipendenza dei batteri è un fattore chiave nel processo di digestione anaerobica. Nella prima fase, i solidi volatili nel letame vengono convertiti in acidi grassi da batteri anaerobici noti come “acido produttori”. Nella seconda fase, questi acidi vengono ulteriormente convertiti in biogas da batteri più specializzati noti come “metanogeni”. Il processo di digestione anaerobica, che è in funzione in natura da milioni di anni, può essere gestito per convertire il flusso di rifiuti spesso problematico per un agricoltore in una risorsa. L’instabilità sia durante l’avvio che il funzionamento del processo di degradazione anaerobica può essere problematica a causa del basso tasso di crescita specifico dei microrganismi metanogenici coinvolti.
Qui forniamo alcuni dettagli aggiuntivi sui reattori utilizzati per la produzione di biogas. Diversi parametri sono noti per essere importanti per lo sviluppo e la gestione di un impianto di produzione di biogas. soprattutto:
temperatura di lavoro. Il processo può essere eseguito in:
– condizioni psicrofile (20º C) (non molto utilizzate nelle piante convenzionali)
– condizioni mesofile (35 – 42°C)
– condizioni termofile (> 50°C);
Digestione mesofila. Il digestore viene riscaldato a 30-35 °C e la materia prima rimane nel digestore tipicamente per 15-30 giorni. La digestione mesofila tende ad essere più robusta e tollerante del processo termofilo, ma la produzione di gas è inferiore, sono necessari serbatoi di digestione più grandi e la sanificazione, se necessario, è una fase di processo separata.
Digestione termofila. Il digestore viene riscaldato a 55 °C e il tempo di residenza è in genere di 12-14 giorni. I sistemi di digestione termofila offrono una maggiore produzione di metano, un rendimento più veloce, una migliore “uccisione” dei patogeni e dei virus, ma richiedono una tecnologia più costosa, un maggiore apporto energetico e un più alto grado di funzionamento e monitoraggio. Durante questo processo il 30-60% dei solidi digeribili viene convertito in biogas.
Pertanto, il processo in condizioni termofile è più veloce, ma le condizioni mesofile vengono utilizzate quando le caratteristiche del substrato o dei substrati di alimentazione cambiano con il tempo, la stagione, ecc.
à il contenuto solido nel reattore. Possiamo distinguere:
– processi umidi/umidi (5-8% di sostanza secca nel reattore)
– processi semi-secchi (sostanza secca = 8 – 20%)
– processi secchi (sostanza secca >20%)
à le fasi metaboliche nel reattore.
– UNA FASE: l’intera catena microbica è conservata in un unico reattore;
– DUE FASI: la fase fermentativa idrolitica è separata da quella metanogenica.
Come funziona un impianto di biogas? Si prega di controllare il sito web: https://www.youtube.com/watch?v=3UafRz3QeO8
Il seguente quadro (Fig. 1) mostra le diverse configurazioni dei bioreattori che possono essere sviluppate per eseguire la produzione di biogas. Possono differire per due parametri: lo schema idraulico e il modo in cui i microrganismi lavorano nel reattore (celle libere o immobilizzate).
Fig. 1. Reattori per la produzione di biogas
Il reattore a serbatoio agitato continuo (CSTR) è un modello comune per un reattore chimico nell’ingegneria ambientale. Si tratta di un reattore a lotti dotato di girante o di un altro dispositivo di miscelazione per fornire una miscelazione efficiente. Un CSTR ideale presuppone una miscelazione perfetta. In un reattore perfettamente miscelato, l’alimentazione viene miscelata istantaneamente e uniformemente in tutto il reattore all’entrata. Di conseguenza, lo spettacolo è funzione del tempo di residenza e della velocità di reazione. Il contatto con la fase solida del bioreattore può essere migliorato da un serbatoio di sedimentazione che separa il mezzo liquido dalla parte solida, che viene quindi rispedibile al bioreattore (riferito al processo di contatto anaerobico nella figura).
I CSTR sono costituiti da: un reattore serbatoio (di solito a volume costante), un sistema di agitazione per mescolare i reagenti (girante o introduzione a flusso rapido di reagenti), tubi di alimentazione e di uscita per introdurre reagenti e rimuovere i prodotti CSTR sono comunemente utilizzati nella lavorazione industriale. I biodigestori per la produzione di biogas sono reattori a serbatoio agitato continuo in calcestruzzo o acciaio.
Il reattore anaerobico a letto impaccato è riempito con un supporto inerte che fornisce una superficie molto ampia per la crescita microbica. I passaggi influenti attraverso i media e i microbi anaerobici si attaccano al supporto creando un sottile strato di batteri anaerobici chiamato biofilm – questo film dà al digestore il suo nome, reattore a film fisso o reattore a letto impaccato. Questi microbi continuano quindi a crescere rimuovendo il materiale dalle acque reflue mentre scorre. Nella maggior parte dei digestori i microbi galleggiano nel liquido e una parte di questi microrganismi attivi in crescita viene continuamente scaricata con l’effluente. In un digestore a letto impaccato i batteri rimangono attaccati al supporto plastico quando gli effluenti vengono scaricati. I microrganismi sono già “al lavoro” quando viene aggiunto il nuovo influente. I digestori a letto imballato hanno recipienti di reattori più piccoli, tempi di ritenzione più brevi e devono essere caricati con una materia prima che fluirà facilmente attraverso il supporto senza intasamenti. I tempi di ritenzione da tre a cinque giorni sono tipici e i digestori possono essere eseguiti a temperature ambiente in climi caldi, ma di solito vengono riscaldati a temperature mesofile o termofile.
Quali sono i vantaggi del reattore anaerobico a letto impaccato? Una maggiore stabilità e performance nei reattori anaerobici può essere ottenuta se il consorzio microbico viene trattenuto nel reattore. Due mezzi per ottenere ciò sono l’uso di granuli batterici densi come nei reattori UASB o un biofilm microbico attaccato a vettori inerti nei reattori a letto impaccato sopra descritti. La tecnologia UASB (Upflow anaerobic sludge blanket), normalmente indicata come reattore UASB, è infatti una forma di digestore anaerobico che viene utilizzata per il trattamento delle acque reflue e come digestore metanigeno (che produce metano). Una tecnologia simile ma variante all’UASB è il digestore a letto di fango granulare espanso (EGSB) (Fig. 2). Un reattore a letto di fango granulare espanso (EGSB) è una variante del concetto UASB. La caratteristica distintiva è che un tasso più veloce di velocità di flusso verso l’alto è progettato per le acque reflue che passano attraverso il letto di fango. L’aumento del flusso permette un’espansione parziale (e da questo deriva il nome del reattore) del letto di fango granulare, migliorando il contatto acqua reflua-fango e migliorando la segregazione delle piccole particelle sospese inattive dal letto di fango. L’aumento della velocità del flusso è ottenuto utilizzando reattori alti, o incorporando un riciclo dell’effluente (o entrambi).
Fig. 2. Reattore a letto fisso/letto espanso (a sinistra) e reattore UASB (a destra)
L’UASB è un processo anaerobico che forma una coperta di fango granulare che si sospende nel serbatoio. Le acque reflue fluiscono verso l’alto attraverso il mantello e vengono processate dai microrganismi anaerobici. Il flusso verso l’alto combinato con l’azione di sedimentazione della gravità sospende il mantello con l’aiuto di flocculanti. Il manto comincia a raggiungere la maturità a circa tre mesi. Piccoli granuli di fango cominciano a formarsi e contengono materia organica e batteri senza alcuna matrice di supporto, le condizioni di flusso creano un ambiente selettivo in cui solo i microrganismi capaci di attaccarsi l’un l’altro sopravvivono e proliferano. Alla fine gli aggregati formano strutture dense e compatte chiamate “granuli”. Si produce biogas con un’alta concentrazione di metano, che può essere catturato e utilizzato come fonte di energia, per generare elettricità per l’esportazione e per coprire la propria potenza di funzionamento. La tecnologia ha bisogno di un monitoraggio costante quando viene messa in uso per garantire che la coltre di fango sia mantenuta, e non lavata via (perdendo così l’effetto). Il calore prodotto come sottoprodotto della generazione di elettricità può essere riutilizzato per riscaldare le vasche di digestione. Il mezzo di imballaggio nel reattore a letto imballato e il fango granulare nel reattore UASB servono come un filtro che impedisce il lavaggio batterico e fornisce anche una maggiore superficie per un più rapido sviluppo del biofilm e una migliore metanogenesi. L’area superficiale specifica, la porosità, la rugosità della superficie, la dimensione dei pori e l’orientamento del materiale d’imballaggio sono stati trovati per giocare un ruolo importante nelle prestazioni del reattore anaerobico. I reattori a biofilm o a film fisso dipendono dalla tendenza naturale delle popolazioni microbiche miste ad adsorbire sulle superfici e a formare un biofilm. Molti materiali di supporto sono stati studiati per quanto riguarda la loro idoneità come supporti per il biofilm, compresi materiali economici e facilmente disponibili come sabbia, argilla, vetro, quarzo e una serie di materie plastiche. In natura, i microrganismi abitano le superfici esterne e interne di pietra, ghiaia o sabbia. Questa formazione di biofilm diventa un fattore importante per la capacità di autopulizia dell’acqua. La crescita dei microrganismi in un biofilm è la base per il trattamento biologico dell’acqua come la denitrificazione e per l’intensificazione del trattamento aerobico e anaerobico delle acque reflue. L’uso di reattori a letto impacchettato per trattare diversi tipi di acque reflue è stato anche riportato, per esempio, acque reflue casearie e di birreria. La formazione di biofilm su materiali di supporto migliora i tassi di conversione riducendo la sua sensibilità alle variazioni di concentrazione e alle sostanze inibitrici. L’efficienza della rimozione della materia organica nei reattori a letto fisso è direttamente correlata alle caratteristiche del materiale di supporto utilizzato per l’immobilizzazione degli anaerobi. La schiuma poliuretanica reticolare ha un’alta area superficiale specifica. È un’eccellente matrice di colonizzazione per un reattore a filtro anaerobico. La dimensione dei pori era uno dei parametri più importanti per i requisiti microbiologici e ingegneristici nei letti ad alta efficienza. Molti tipi di modelli di letti sono stati considerati per degradare una varietà di rifiuti organici in reattori di digestione anaerobica.
Lo sviluppo di reattori a biomassa fissa ha garantito progressi significativi nella conoscenza e nell’applicazione dei processi anaerobici per il trattamento dei rifiuti. Rispetto alle unità convenzionali, i bioreattori a film fisso funzionano in modo efficiente a tassi di carico organico più elevati, a causa di una ritenzione più efficace della biomassa nella zona di reazione con conseguente maggiore tempo di ritenzione cellulare. I reattori anaerobici a biomassa immobilizzata mostrano anche migliori risposte ai carichi organici d’urto e agli input tossici. In molti casi, i reattori a biomassa immobilizzata recuperano completamente le loro prestazioni dopo tali problemi.
Come funziona un reattore UASB? Si prega di vedere questo video https://www.youtube.com/watch?v=0QsEdlJgllI
Un utile risultato del processo di digestione anaerobica è il digestato. Il digestato è la parte rimanente della biomassa degradata dopo la produzione di biogas: è materia organica stabile ricca di vari nutrienti (N, P, K). A seconda della materia prima utilizzata per la produzione di biogas, il digestato può essere direttamente utilizzabile come fertilizzante organico nello stesso modo in cui i liquami animali grezzi sono sparsi sui campi in agricoltura. Può anche essere ulteriormente migliorato per recuperare nutrienti minerali di alta qualità. L’uso del digestato come fertilizzante organico mostra molteplici vantaggi: permette il riutilizzo delle sostanze nutritive e sostituisce i fertilizzanti minerali di origine fossile. Rispetto al letame grezzo, il digestato è anche igienizzato grazie al processo di produzione del biogas che neutralizza la maggior parte degli agenti patogeni della materia prima originale come i batteri e le malattie delle colture. L’omogeneità e la densità del digestato permettono anche una penetrazione più veloce nel suolo rispetto al letame crudo, rendendo le sostanze nutritive più facilmente accessibili alle piante nel terreno. Se non è adatto per scopi agricoli, il digestato può essere ulteriormente lavorato e utilizzato come materia prima per processi industriali.
Uno schema generale di un impianto di produzione di biogas è presentato qui sotto (Fig. 3)
Fig. 3. Un impianto di produzione di biogas.
Bioetanolo
I paesi di tutto il mondo hanno considerato e indirizzato le politiche verso un maggiore ed economico utilizzo della biomassa per soddisfare la loro futura domanda di energia, al fine di raggiungere gli obiettivi di riduzione dell’anidride carbonica come specificato nel protocollo di Kyoto, nonché per diminuire la dipendenza dalla fornitura di combustibili fossili. Anche se la biomassa può essere una fonte enorme di combustibili per il trasporto come il bioetanolo, la biomassa è comunemente usata per generare sia energia che calore, generalmente attraverso la combustione. L’etanolo è attualmente il biocarburante liquido più usato per i veicoli a motore. L’importanza dell’etanolo sta aumentando a causa di una serie di ragioni come il riscaldamento globale e il cambiamento climatico.
Il mercato globale del bioetanolo è entrato in una fase di crescita rapida e transitoria. Molti paesi del mondo stanno spostando la loro attenzione verso fonti rinnovabili per la produzione di energia a causa dell’esaurimento delle riserve di petrolio greggio. La tendenza si sta estendendo anche al carburante per i trasporti. L’etanolo ha un potenziale come valido sostituto della benzina nel mercato dei carburanti da trasporto. Tuttavia, il costo della produzione di bioetanolo è maggiore rispetto ai combustibili fossili. Il Brasile e gli Stati Uniti sono i due maggiori produttori di etanolo che rappresentano il 62% della produzione mondiale. La produzione su larga scala di etanolo combustibile si basa principalmente sul saccarosio dalla canna da zucchero in Brasile o sull’amido, principalmente dal mais, negli USA. Vedi una figura schematica qui sotto (Fig. 4).
Fig. 4. Produzione schematica di bioetanolo da colture
L’attuale produzione di etanolo basata su mais, amido e sostanze zuccherine può non essere desiderabile a causa del loro valore alimentare e mangimistico. Il costo è un fattore importante per l’espansione su larga scala della produzione di bioetanolo. L’oro verde combustibile dai rifiuti lignocellulosici evita la competizione esistente tra cibo e combustibile causata dalla produzione di bioetanolo basata sul grano. Quindi la produzione di bioetanolo potrebbe essere la via per l’utilizzo efficace dei rifiuti agricoli. La paglia di riso, la paglia di grano, la paglia di mais e la bagassa di canna da zucchero sono i principali rifiuti agricoli in termini di quantità di biomassa disponibile.
I materiali lignocellulosici sono rinnovabili, a basso costo e abbondantemente disponibili. Includono residui di colture, erbe, segatura, trucioli di legno, ecc. Un’ampia ricerca è stata condotta sulla produzione di etanolo dai lignocellulosici. I lignocellulosici sono trattati per la produzione di bioetanolo attraverso tre operazioni principali:
- il pretrattamento per la delignificazione è necessario per liberare la cellulosa e l’emicellulosa prima dell’idrolisi;
- idrolisi della cellulosa e dell’emicellulosa per produrre zuccheri fermentabili tra cui glucosio, xilosio, arabinosio, galattosio, mannosio e fermentazione degli zuccheri riducenti.
- I componenti non carboidrato della lignina hanno anche applicazioni a valore aggiunto
La sfida di trasformazione più importante nella produzione di biocarburanti è il pretrattamento della biomassa. La biomassa lignocellulosica è composta da tre costituenti principali: emicellulosa, lignina e cellulosa. I metodi di pretrattamento si riferiscono alla solubilizzazione e separazione di uno o più di questi componenti della biomassa. Rende la biomassa solida rimanente più accessibile a ulteriori trattamenti chimici o biologici. Il complesso lignocellulosico è costituito da una matrice di cellulosa e lignina legata da catene di emicellulosa. Il pretrattamento viene fatto per rompere la matrice al fine di ridurre il grado di cristallinità della cellulosa e aumentare la frazione di cellulosa amorfa, la forma più adatta per l’attacco enzimatico. Il pretrattamento è intrapreso per apportare un cambiamento nelle dimensioni macroscopiche e microscopiche e nella struttura della biomassa, nonché nella struttura submicroscopica e nella composizione chimica. Rende la biomassa lignocellulosica suscettibile a una rapida idrolisi con maggiori rese di zuccheri monomerici.
Gli obiettivi di un efficace processo di pretrattamento sono:
- formazione di zuccheri direttamente o successivamente per idrolisi per evitare perdite e/o degradazioni degli zuccheri formati
- limitare la formazione di prodotti inibitori
- per ridurre il fabbisogno energetico e ridurre al minimo i costi.
I trattamenti fisici, chimici, fisico-chimici e biologici sono i quattro tipi fondamentali di tecniche di pretrattamento utilizzate. In generale, una combinazione di questi processi viene utilizzata nella fase di pretrattamento.
Tra i pretrattamenti fisici, il primo passo per la produzione di etanolo dai rifiuti solidi agricoli è la riduzione meccanica delle dimensioni attraverso la macinazione, la triturazione o la cippatura. Questo riduce la cristallinità della cellulosa e migliora l’efficienza della lavorazione a valle. La pirolisi è un trattamento fisico: i materiali sono trattati a una temperatura superiore a 300 °C, dove la cellulosa si decompone rapidamente per produrre prodotti gassosi e carbone residuo. Il carbone residuo viene ulteriormente trattato per lisciviazione con acqua o con un acido leggero. Il percolato d’acqua contiene abbastanza fonte di carbonio per sostenere la crescita microbica per la produzione di bioetanolo. Il glucosio è il componente principale del percolato d’acqua. Il pretrattamento della biomassa lignocellulosica in un forno a microonde è anche un metodo fattibile che utilizza l’alta efficienza di riscaldamento di un forno a microonde. Il trattamento a microonde utilizza gli effetti termici e non termici generati dalle microonde in ambienti acquosi. Il calore viene generato nella biomassa dalla radiazione a microonde, risultante dalle vibrazioni dei legami polari nella biomassa e nel mezzo acquoso circostante. Questa caratteristica unica di riscaldamento provoca un effetto di esplosione tra le particelle e migliora la distruzione delle strutture recalcitranti della lignocellulosa. Nel metodo non termico, cioè il metodo di irradiazione con fascio di elettroni, i legami polari vibrano, poiché sono allineati con un campo magnetico in continuo cambiamento e la rottura e l’urto dei legami polari accelerano i processi chimici, biologici e fisici.
Tra i trattamenti fisico-chimici, l’esplosione di vapore è promettente e rende la biomassa più accessibile all’attacco della cellulasi. Questo metodo di pretrattamento non utilizza alcun catalizzatore e la biomassa si fraziona per produrre acido levulinico, xilitolo e alcoli. In questo metodo la biomassa viene riscaldata con vapore ad alta pressione (20-50 bar, 160-290 °C) per alcuni minuti; la reazione viene poi arrestata da un’improvvisa decompressione a pressione atmosferica. Quando il vapore viene lasciato espandere all’interno della matrice lignocellulosica, separa le singole fibre. L’alto recupero di xilosio (45-65%) rende il pretrattamento con esplosione di vapore economicamente attraente.
I metodi di pretrattamento chimico coinvolgono l’uso di acido diluito, alcali, ammoniaca, solvente organico, CO2 o altri prodotti chimici. Questi metodi sono facili da usare e hanno una buona resa di conversione in un breve lasso di tempo. Il pretrattamento acido è considerato come una delle tecniche più importanti e mira a ottenere alti rendimenti di zuccheri dai lignocellulosici. Di solito viene effettuato con acidi concentrati o diluiti (di solito tra lo 0,2% e il 2,5% p/p) a temperature comprese tra 130 °C e 210 °C. Il mezzo acido attacca i polisaccaridi, specialmente le emicellulose che sono più facili da idrolizzare della cellulosa. Tuttavia, il pretrattamento acido provoca la produzione di vari inibitori come l’acido acetico, il furfurale e il 5-idrossimetilfurfurale. Questi prodotti sono inibitori della crescita dei microrganismi. Gli idrolizzati da utilizzare per la fermentazione devono quindi essere detossificati. Il pretrattamento alcalino dei lignocellulosici digerisce la matrice di lignina e rende la cellulosa e l’emicellulosa disponibili per la degradazione enzimatica. Il trattamento alcalino della lignocellulosa distrugge la parete cellulare dissolvendo le emicellulose, la lignina e la silice, idrolizzando gli esteri uronici e acetici e gonfiando la cellulosa. La cristallinità della cellulosa è diminuita a causa del rigonfiamento. Con questo processo, i substrati possono essere frazionati in lignina solubile in alcali, emicellulose e residui, il che rende facile il loro utilizzo per prodotti più preziosi. Il residuo finale (principalmente cellulosa) può essere usato per produrre carta o derivati della cellulosa. I solventi organici sono metodi alternativi per la delignificazione dei materiali lignocellulosici. L’utilizzo di miscele di solvente organico/acqua elimina la necessità di bruciare il bagno e permette l’isolamento delle lignine (per distillazione del solvente organico). Esempi di tali pretrattamenti includono l’uso di acido formico al 90% e quello di anidride carbonica pressurizzata in combinazione (miscela alcol/acqua al 50% e anidride carbonica al 50%). Altri vari solventi organici che possono essere usati per la delignificazione sono metanolo, etanolo, acido acetico, acido performico e peracetico, acetone, ecc.
Trattamenti biologici. L’idrolisi enzimatica è il metodo di saccarificazione preferito a causa dei suoi rendimenti più elevati, della maggiore selettività, del costo energetico inferiore e delle condizioni operative più miti rispetto ai processi chimici.
Modalità diverse di fermentazione. La fermentazione del bioetanolo può essere effettuata in modalità batch, fed-batch, batch ripetuto o continuo. Nel processo batch, il substrato è fornito all’inizio del processo senza aggiunta o rimozione del mezzo. È conosciuto come il sistema più semplice di bioreattore con un processo di controllo flessibile e facile. Il processo di fermentazione si svolge in un sistema a circuito chiuso con un’alta concentrazione di zuccheri all’inizio e termina con un’alta concentrazione di prodotto. Ci sono diversi vantaggi del sistema batch tra cui la sterilizzazione completa, non richiede competenze di manodopera, è facile da gestire le materie prime e può essere controllato facilmente. Tuttavia, la produttività è bassa e richiede costi di manodopera intensivi ed elevati. La presenza di un’alta concentrazione di zucchero nel mezzo di fermentazione può portare all’inibizione del substrato per la crescita cellulare e la produzione di etanolo. La fermentazione a lotti con riciclo di cellule è un metodo strategico per un’efficace produzione di etanolo in quanto riduce i tempi e i costi per la preparazione dell’inoculo. Gli altri vantaggi del processo a lotti ripetuti sono la facile raccolta delle cellule, il funzionamento stabile e la produttività a lungo termine. I materiali zuccherini e le cellule di lievito immobilizzate sono utilizzati per facilitare la separazione delle cellule per il riciclaggio delle cellule. Tuttavia, la sua applicazione nel processo di materiali lignocellulosici è estremamente difficile perché i residui lignocelluosici rimangono nel mezzo di fermentazione insieme alle cellule di lievito. L’uso di cellule libere in questo sistema riduce la concentrazione di cellule di lievito e comporta una minore produzione di etanolo nei lotti successivi. La fermentazione a lotti ripetuti può essere eseguita sostituendo le cellule libere con le cellule immobilizzate. La fermentazione fed-batch è una combinazione di modalità batch e continua che comporta l’aggiunta di substrato nel fermentatore senza rimuovere il mezzo. È stata usata per superare il problema dell’inibizione del substrato nel funzionamento in batch. Il volume della cultura nei processi fed-batch può variare ampiamente, ma deve essere alimentato correttamente a un certo tasso con la giusta composizione dei componenti. La produttività della fermentazione fed-batch può essere aumentata mantenendo il substrato a bassa concentrazione che permette la conversione di una quantità sufficiente di zuccheri fermentabili in etanolo. Questo processo ha una produttività più alta, più ossigeno disciolto nel mezzo, un tempo di fermentazione più breve e un minore effetto tossico dei componenti del mezzo rispetto ad altri tipi di fermentazione. Tuttavia, la produttività dell’etanolo in fed-batch è limitata dalla velocità di alimentazione e dalla concentrazione della massa cellulare.
Il funzionamento continuo viene effettuato aggiungendo costantemente substrati, terreno di coltura e nutrienti in un bioreattore contenente microrganismi attivi. Il volume della cultura nel funzionamento continuo deve essere costante e i prodotti di fermentazione sono presi continuamente dal mezzo. Vari tipi di prodotti possono essere ottenuti dalla parte superiore del bioreattore come etanolo, cellule e zucchero residuo. I vantaggi del sistema continuo rispetto al sistema batch e fed-batch sono una maggiore produttività, volumi di bioreattore più piccoli e meno investimenti e costi operativi. Ad alto tasso di diluizione, la produttività dell’etanolo è aumentata mentre la resa dell’etanolo è diminuita a causa del consumo incompleto del substrato da parte dei lieviti. Tuttavia, la possibilità di contaminazione è maggiore rispetto ad altri tipi di fermentazione. Inoltre, la capacità dei lieviti di produrre etanolo in un processo continuo è ridotta a causa dei lunghi tempi di coltivazione.
Fattori che influenzano la produzione di bioetanolo
Diversi fattori influenzano la produzione di bioetanolo: temperatura, concentrazione di zucchero, pH, tempo di fermentazione, tasso di agitazione e quantità di inoculo. Il tasso di crescita dei microrganismi è direttamente influenzato dalla temperatura. L’alta temperatura che è sfavorevole per la crescita delle cellule diventa un fattore di stress per i microrganismi. L’intervallo di temperatura ideale per la fermentazione è compreso tra 20 e 35 °C per Saccharomyces cerevisiae. Le cellule libere di S. cerevisiae hanno una temperatura ottimale vicino ai 30 °C, mentre le cellule immobilizzate hanno una temperatura ottimale leggermente più elevata grazie alla sua capacità di trasferire calore dalla superficie delle particelle all’interno delle cellule. Inoltre, gli enzimi che regolano l’attività microbica e il processo di fermentazione sono sensibili alle alte temperature che possono denaturare la sua struttura terziaria e inattivare gli enzimi. Pertanto, la temperatura è accuratamente regolata durante tutto il processo di fermentazione.
L’aumento della concentrazione di zucchero fino a un certo livello ha causato un aumento del tasso di fermentazione. Tuttavia, l’uso di un’eccessiva concentrazione di zucchero causerà un tasso di fermentazione costante. Questo perché la concentrazione dell’uso dello zucchero va oltre la capacità di assorbimento delle cellule microbiche. In generale, il tasso massimo di produzione di etanolo si ottiene quando si utilizzano zuccheri alla concentrazione di 150 g/L. Anche la concentrazione iniziale di zucchero è stata considerata un fattore importante nella produzione di etanolo. L’elevata produttività e resa dell’etanolo nella fermentazione in lotti può essere ottenuta utilizzando una maggiore concentrazione iniziale di zucchero. Tuttavia, ha bisogno di tempi di fermentazione più lunghi e di costi di recupero più elevati.
La produzione di etanolo è influenzata dal pH del brodo in quanto influisce sulla contaminazione batterica, sulla crescita del lievito, sul tasso di fermentazione e sulla formazione di prodotti di base. La permeabilità di alcuni nutrienti essenziali nelle cellule è influenzata dalla concentrazione di H+ nel brodo di fermentazione. Inoltre, la sopravvivenza e la crescita dei lieviti è influenzata dal pH nell’intervallo 2.75–4.25. In fermentazione per la produzione di etanolo, la gamma ottimale di pH di S. cerevisiae è 4.0–5.0 [34]. Quando il pH è inferiore a 4,0, è necessario un periodo di incubazione più lungo ma la concentrazione di etanolo non viene ridotta in modo significativo. Tuttavia, quando il pH era superiore a 5,0, la concentrazione di etanolo si riduce sostanzialmente.
Il tempo di fermentazione influisce sulla crescita dei microrganismi. Tempi di fermentazione più brevi causano fermentazione inefficiente a causa della crescita inadeguata dei microrganismi. D’altra parte, tempi di fermentazione più lunghi danno un effetto tossico sulla crescita microbica soprattutto in modalità batch a causa dell’alta concentrazione di etanolo nel brodo fermentato. La fermentazione completa può essere ottenuta a temperatura inferiore utilizzando tempi di fermentazione più lunghi che si traducono nella più bassa resa di etanolo.
Il tasso di agitazione controlla la permeabilità dei nutrienti dal brodo di fermentazione all’interno delle cellule e la rimozione dell’etanolo dalla cella al brodo di fermentazione. Maggiore è il tasso di agitazione, maggiore è la quantità di etanolo prodotto. Inoltre, aumenta la quantità di consumo di zucchero e riduce l’inibizione dell’etanolo sulle cellule. Il tasso comune di agitazione per la fermentazione da parte delle cellule di lievito è di 150-200 giri/min. Il tasso di agitazione in eccesso non è adatto per una produzione liscia di etanolo in quanto causa limitazioni alle attività metaboliche delle cellule.
La concentrazione di inoculo non dà effetti significativi sulla concentrazione finale di etanolo, ma influisce sul tasso di consumo di zucchero e produttività dell’etanolo.
Biotecnologia per la produzione di bioplastica (livello B)
Principali passi verso le moderne BIOPLASTICHE
- Le bioplastiche non sono una vera innovazione: le resine naturali venivano utilizzate fin dai tempi antichi (ad esempio ambra, gommalacca, ecc.)
- A partire dal 1860 furono rilasciate le prime plastiche derivanti dalla cellulosa (ad esempio celluloide, cellophane)
- Negli anni ’40, Henry Ford fece parti di auto con plastica ottenuta dalla soia
- Negli anni ’50 le plastiche derivate dalla diffusione dell’olio
- Crisi petrolifera negli anni ’70: riscoperto l’interesse per le bioplastiche. Attualmente la domanda di bioplastiche è in aumento, principalmente a causa dei pressanti problemi ambientali (esaurimento delle risorse, effetto serra, smaltimento dei rifiuti, ecc.). I punti 5, 6 e 7 forniscono alcune informazioni di base sulle bioplastiche.
Fig. 5. Bioplastiche e normative europee
La plastica e la gomma sono materiali polimerici costituiti da monomeri. Questi sono principalmente prodotti dal petrolio e il materiale originato non è quindi rinnovabile. Circa il 4% del consumo mondiale di petrolio viene utilizzato come materia prima nella produzione di plastica e una quantità simile viene utilizzata come energia nel processo di produzione. Oltre al petrolio, la produzione di plastica richiede l’uso di additivi chimici come plastificanti, ritardanti di fiamma, stabilizzatori termici e UV, biocidi, pigmenti ed estensori. Diversi additivi sono classificati come pericolosi secondo le normative dell’UE (cancerogeni, mutageni, dannosi per la salute riproduttiva o per la vita acquatica o aventi impatti negativi persistenti sull’ambiente).
Negli anni ’60 la plastica è stata considerata per la prima volta come una preoccupazione per l’inquinamento marino e oceanico e cominciavano a essere descritti gli impatti negativi sulla salute umana e ambientale. Infatti, le plastiche rilasciano sostanze chimiche tossiche durante tutto il ciclo di vita del prodotto.
Il riciclaggio della plastica è emerso come una possibile soluzione. Il riciclaggio, però, non nell’unica soluzione necessaria per risolvere le crisi dei rifiuti plastici che stanno inquinando l’ambiente. La plastica può variare dall’essere non riciclabile, riciclabile solo una o due volte, o a un numero definito di volte ma non per sempre. Dopo questo limite, la plastica finirà in una discarica. Inoltre, molti consumatori di plastica non consentono nemmeno alla loro plastica di avere così tanto tempo di vita. Le plastiche rinnovabili– ovvero le plastiche derivate da fonti rinnovabili e facilmente biodegradabili nell’ambiente – possono offrire una soluzione al problema dell’avvelenamento da bioplastica.
Fig. 6. Materie plastiche a base biologica e biodegradabili
Fig. 7. Principali bioplastiche prodotte
Bio-based è definito nella norma europea EN 16575 come “derivato dalla biomassa”. I materiali biodegradabili sono materiali che possono essere scomposti da microrganismi come batteri o funghi in acqua, anidride carbonica o metano e biomassa. Tuttavia, la biodegradabilità dipende dalle condizioni ambientali: presenza di microrganismi, temperatura e disponibilità di ossigeno e acqua. I materiali compostabili sono materiali che si decompongono in condizioni di compostaggio. Le condizioni di compostaggio industriale richiedono una temperatura elevata (55˚C – 60˚C) combinata con un’alta umidità relativa e la presenza di ossigeno, e sono di fatto ottimali se confrontate con altre condizioni di degradazione come nel suolo, nelle acque di superficie e in quelle marine. Il rispetto della norma EN 13432 è considerato una buona misura per la compostabilità dei materiali da imballaggio. Secondo questo standard, gli imballaggi in plastica possono essere definiti compostabili. Alcuni dettagli sulle 3 categorie principali di bioplastiche sono riportati di seguito.
Materie plastiche a base di amido
Il 75% di tutto il materiale organico sulla terra è presente sotto forma di polisaccaridi. Un importante polisaccaride è l’amido. Le piante sintetizzano e immagazzinano l’amido nella loro struttura come riserva di energia. L’amido si trova nei semi, nei tuberi o nelle radici delle piante. Fonti di amido sono il mais, il grano, il riso, la patata, la tapioca, il pisello e molte altre risorse vegetali. La maggior parte dell’amido prodotto nel mondo deriva dal mais. L’amido viene generalmente estratto dalle risorse vegetali tramite processi di macinazione a umido. L’amido consiste di due tipi di polimeri di glucosio: amilosio e amilopectina. L’amilosio è essenzialmente un polimero lineare in cui le unità di glucosio sono prevalentemente collegate attraverso legami glucosidici α-D-(l, 4). L’amilopectina è un polimero ramificato, contenente ramificazioni periodiche collegate con lo scheletro attraverso legami glucosidici α-D-(l, 6). Il contenuto di amilosio e amilopectina nell’amido varia e dipende dalla fonte di amido.
Una classe importante di materie plastiche è rappresentata dalle plastiche a base di amido. A partire dai primi anni ’90, gli sviluppi della ricerca e della tecnologia hanno permesso di complessare polimeri naturali come l’amido (di mais, di patata ecc.) con macromolecole biodegradabili (agenti complessanti polimerici) per ottenere materiali innovativi termoplastici e biodegradabili su scala industriale. In particolare, la tecnologia Novamont a base di amido (Fig. 8) impiega condizioni di lavorazione in grado di distruggere quasi completamente la cristallinità dell’amilosio e amilopectina, in presenza di macromolecole in grado di formare un complesso con l’amilosio. Queste possono essere di origine naturale o sintetica e sono biodegradabili. Il complesso formato dall’amilosio con l’agente complessante è generalmente cristallino ed è caratterizzato da una singola elica di amilosio formata intorno all’agente complessante. A differenza dell’amilosio, l’amilopectina non interagisce con l’agente complessante e rimane nel suo stato amorfo. La fonte dell’amido, cioè il suo rapporto tra amilosio e amilopectina, le condizioni di lavorazione e la natura degli agenti complessanti permettono di ingegnerizzare varie strutture supramolecolari con proprietà molto diverse. Negli ultimi anni sono stati fatti molti sforzi con successo per aumentare la quantità di materie prime rinnovabili per produrre poliesteri biodegradabili. Novamont è quindi uno degli attori più importanti nel settore delle bioplastiche a base di amido. L’azienda sta attualmente lavorando allo sviluppo di un progetto di bioraffineria che consiste in un modello di sviluppo innovativo in grado di sintetizzare vari intermedi chimici utilizzando materie prime rinnovabili coltivate con basso input e in aree marginali al posto delle materie prime fossili.
Plastiche all’acido polilattico
I polilattoni biodegradabili sintetici come l’acido polilattico (PLA), l’acido poliglicolico (PGA) e il policaprolattone (PCL) sono polimeri che vengono degradati per semplice idrolisi dei legami esteri. I prodotti idrolitici di tale processo di degradazione sono poi trasformati in sottoprodotti non tossici (Fig. 9).
Fig. 9. Ciclo di vita dei PLA
Le plastiche PLA sono derivate dalla fermentazione di sottoprodotti agricoli come sostanze ricche di amido come mais, grano o zucchero e amido di mais. Il processo comporta la conversione del mais o di altre fonti di carboidrati in glucosio seguito dalla fermentazione in acido lattico (Fig. 9 e 10).
Fig. 10. Produzione PLA da amido
Il PLA derivato dall’acido lattico è un poliestere alifatico termoplastico e biodegradabile con un ampio potenziale per le applicazioni di imballaggio. I monomeri dell’acido lattico sono direttamente policondensati o subiscono la polimerizzazione ad apertura di anello del lattide con conseguente formazione di pellet di PLA. Le proprietà del PLA come materiale da imballaggio dipendono dal rapporto tra i due isomeri ottici del monomero dell’acido lattico. Quando si usano monomeri L-PLA al 100%, si ottiene una cristallinità e un punto di fusione molto alti, mentre i copolimeri D/L al 90/10% soddisfano i requisiti dell’imballaggio alla rinfusa. Il PLA è il primo polimero a base bio commercializzato su larga scala e può essere modellato in oggetti stampati a iniezione, film e rivestimenti. Il PLA ha sostituito il polietilene ad alta densità, il polietilene a bassa densità (LDPE), il polietilene tereftalato e il PS come materiale da imballaggio.
Le principali proprietà del PLA sono: i) la resistenza meccanica e la sensibilità al calore sono simili alle plastiche tradizionali; ii) durezza, rigidità e grado di elasticità sono simili al PET, iii) può contenere grassi, oli, alcool e molecole alifatiche, iv) scarsa resistenza agli acidi e alle basi è ma una buona resistenza alle radiazioni UV, v) può essere stampato e tinto, vi) può essere trasformato in merci attraverso macchine standard utilizzate per le plastiche tradizionali, vii) lafase post-uso può comportare il compostaggio negli impianti industriali.
Poliidrossialcanoati
I poliidrossialcanoti (PHA) sono polimeri biodegradabili che vengono accumulati da alcuni batteri come composti di stoccaggio in forma di granuli intracellulari. I PHA sono uno dei biopolimeri che possono sostituire efficacemente le plastiche petrolchimiche convenzionali con le loro proprietà materiali parallele. Anche allora, la loro produzione su larga scala è ancora limitata dal suo alto costo di produzione rispetto alle plastiche convenzionali a base di combustibili fossili, poiché il prezzo di PHA, a seconda della composizione del polimero, varia da 2,2 a 5,0 €/kg che è almeno tre volte superiore ai principali polimeri a base petrolchimica che costano meno di 1,0 €/kg (calcoli fatti nel 2016).
Nella maggior parte delle aziende che producono PHAs, vengono utilizzate soprattutto colture pure. Il problema con l’uso di colture pure è rappresentato dai requisiti di sterilità, dai substrati raffinati se non vengono utilizzate materie prime a base vegetale, limitando così il processo di commercializzazione. Tutti questi problemi sono superati usando le colture microbiche miste (MMC): questo combina la trasformazione dei rifiuti nella produzione di prodotti a valore aggiunto. Il trattamento biologico delle acque reflue e la gestione dei fanghi per il recupero del carbonio dalle acque reflue come PHAs è una via per trasformare le infrastrutture di protezione ambientale di fine ciclo in bioraffinerie. Le strategie di integrazione per la produzione di MMC PHA all’interno dei processi di trattamento delle acque reflue sono state proposte per le acque reflue dei processi industriali e per il trattamento delle acque reflue comunali.
Uno dei membri più caratterizzati della famiglia PHA è poliidrossibutirrato (PHB), Prodotto presso microrganismi che lo immagazzinano all’interno del citoplasma cellulare. Nel 1926, è stata scoperta per la prima volta una produzione microbica di poliestere lineare di acido D (-)-3-idrossibutirrico come granuli intracellulari, che si è verificata sia in batteri gram-positivi che gram-negativi in condizioni di fame (Fig. 11).
Fig. 11. Poliidrossibutirrato
Il costo è lo svantaggio principale della produzione di PHB durante l’industrializzazione. La produzione industriale di PHB è più costosa di quella delle petroplastiche. La produzione di PHB in grandi quantità è stimata a circa 4,4 USD/kg, cioè molto più costosa del costo di produzione del polipropilene, che è vicino a 1 USD/kg. Le difficoltà finanziarie sono senza dubbio legate ai costi di produzione, sia a monte che a valle dei processi. Circa il 40% e il 50% del costo complessivo di produzione del PHB sono stati assegnati rispettivamente al materiale grezzo e ai sistemi di separazione/purificazione. Nelle tecniche di bioestrazione, l’ingegneria genetica è la più comunemente usata per introdurre microrganismi, ed essi sono in grado di estrarre efficacemente PHB dalle cellule che accumulano PHB. Ci sono diversi approcci che sono stati studiati tra cui il sistema di lisi mediato da batteriofagi e i batteri predatori, che sono migliori degli approcci di estrazione convenzionali che producono solventi dannosi per l’ambiente, con costi di degradazione più elevati. Quindi, a causa delle proprietà non ambientali e non economiche dei metodi di estrazione convenzionali, viene data maggiore attenzione ai sistemi di bioestrazione.
Biotecnologie per la bonifica dei siti contaminati
Questa unità è fondamentalmente focalizzata sulle tecnologie che consentono lo studio del microbiota nel suolo o nelle matrici complesse. Le principali tecnologie sono raffigurate qui di seguito (Fig. 12).
Fig. 12: Tecniche per studiare la complessità del microbioma
L’approccio culturomico è ben descritto nel video che è stato prodotto all’interno di Digit-Biotech. Questo “metodo classico”, prevede l’identificazione dei microrganismi attraverso l’isolamento di colture pure, seguito da test che analizzano alcune caratteristiche morfo-fisiologiche e biochimiche. Queste analisi spesso non sono sufficienti per l’identificazione della maggior parte delle specie di microrganismi e inoltre sono limitate alle specie coltivabili che rappresentano una percentuale molto piccola di tutte le specie presenti in natura. Questi test hanno anche il grave limite di richiedere un notevole dispendio di tempo. Tuttavia, hanno il grande vantaggio di ottenere attraverso l’approccio di isolamento dei microrganismi bersaglio che possono essere utilizzati nell’approccio di bioremediation.
Negli ultimi decenni, le ricerche nel campo della microbiologia ambientale hanno dimostrato che le comunità microbiche svolgono un ruolo funzionale di controllo degli ecosistemi che non è attribuibile alle singole specie ma alle comunità stesse come “unità funzionali”. Questa attività funzionale delle comunità microbiche è, in molti casi, responsabile di processi importanti per l’uomo, tra cui la biodegradazione dei rifiuti originali negli impianti di trattamento delle acque reflue e nelle discariche, il compostaggio e, in generale, tutti i processi in cui avvengono trasformazioni chimiche delle sostanze prodotte dalle attività. La Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), la real time PCR (o PCR quantitativa) e l’approccio whole genome (high-throughput sequencing e shotgun sequencing) sono le principali tecnologie utilizzate per lo studio delle popolazioni microbiche nell’ambiente.
DGGE: è una tecnica di separazione elettroforetica utilizzata per la separazione e l’analisi di frammenti di DNA che differiscono nella sequenza nucleotidica anche di una sola coppia di basi. Nell’elettroforesi classica condotta su gel di agarosio o acrilamide, i frammenti di DNA vengono separati in base al peso molecolare; la velocità di scorrimento diminuisce parallelamente all’aumento della lunghezza del frammento. Al contrario, nella DGGE, i frammenti di DNA di uguale peso molecolare sono separati in base al modello di denaturazione. La presenza di denaturanti termici o chimici permette la denaturazione dei due filamenti costituenti una molecola di DNA a doppio filamento (dsDNA). La temperatura e la concentrazione del denaturante a cui avviene la separazione dei due filamenti dipendono fortemente dalla sequenza del frammento stesso. In particolare, i fattori determinanti sono: quantità di legami idrogeno che si stabiliscono tra basi complementari e tipo di interazioni che si stabiliscono tra basi adiacenti sullo stesso filamento (stacking interaction). Una molecola di DNA ha quindi domini con temperature di fusione o Tm caratteristiche, determinate dalla sequenza nucleotidica. Frammenti di DNA quasi identici per peso molecolare, ma che differiscono anche per un solo nucleotide, possono essere caratterizzati dalla Tm e domini di fusione diversi tra loro. L’analisi DGGE viene condotta su gel di poliacrilammide contenente un gradiente denaturante in modo tale che il dsDNA sia soggetto, durante la corsa, ad un aumento delle condizioni di denaturazione con conseguente separazione ai domini di fusione. Nella parte superiore del gel, dove ci sono condizioni di denaturazione lievi, i domini di fusione a Tm inferiore iniziano a denaturare parzialmente, creando molecole ramificate con meno mobilità. L’aumento delle condizioni di denaturazione lungo il gel di poliacrilammide può determinare la dissociazione totale dei frammenti parzialmente denaturati nel DNA a singolo filamento (ssDNA). Sperimentalmente, la completa dissociazione dei due filamenti di dsDNA è ostacolata dall’introduzione, alla fine di ogni filamento, di domini caratterizzati da un alto contenuto di G + C e da un’alta Tm. Le regioni ricche di G + C sono create artificialmente a un’estremità del dsDNA per mezzo dell’incorporazione di un GC-clamp durante le reazioni di amplificazione. L’incorporazione del GC-clamp è reso possibile dall’uso di primer caratterizzati da una sequenza di circa 30-40 GC all’estremità 5 ‘. La presenza del GC-clamp della stessa sequenza all’estremità di ogni molecola fa sì che le differenze tra i profili di corsa dei frammenti analizzati siano determinate principalmente da variazioni nella sequenza dei domini a bassa fusione. Poiché la Tm è determinata dalla sequenza nucleotidica, la presenza di una singola mutazione è in grado di generare un diverso profilo di denaturazione e, di conseguenza, una diversa corsa elettroforetica. Quindi la ricorrenza di polimorfismi in geni altamente conservati può essere analizzata tramite DGGE e può fornire informazioni utili per caratterizzare la struttura delle comunità microbiche. Infatti, con l’elettroforesi su gel a gradiente denaturante si ottiene un profilo elettroforetico formato da una serie di bande in cui, in prima approssimazione, il numero di bande è proporzionale al numero di specie presenti e la posizione di ogni banda è diversa per ogni specie. La tecnica DGGE fornisce quindi un approccio semplice per ottenere profili di comunità microbiche che possono essere utilizzati per identificare differenze spaziali e temporali nella struttura della comunità o per monitorare i cambiamenti nella struttura che si verificano in risposta a disturbi ambientali.
Real-Time PCR: È una tecnica che permette di amplificare e allo stesso tempo quantificare una sequenza di DNA target. Comporta l’uso di coloranti fluorescenti, come il Sybr Green che si intercalano nel solco minore del doppio filamento di DNA, o di sonde con sequenze specifiche, costituite da oligonucleotidi marcati con agenti fluorescenti. La fluorescenza emessa viene misurata costantemente e fornisce informazioni “in tempo reale” sulla quantità di ampliconi prodotti. Da una reazione di amplificazione si ottiene un grafico con una curva sigmoidale; questa inizierà tanto prima quanto maggiore è la quantità di DNA di partenza e continuerà a crescere con un andamento esponenziale fino a raggiungere un valore massimo (plateau), in cui la reazione rallenterà per l’esaurimento dei substrati.
Nello studio di un grafico della Real-Time PCR, vengono stabiliti tre parametri:
– la linea di base di fluorescenza o la regione di base;
– la linea di soglia, parallela alla linea di base;
– il ciclo di soglia o CT, specifico per ogni campione, identifica il valore del ciclo PCR in cui la curva della fase esponenziale interseca la linea di soglia.
La maggior parte degli strumenti Real-Time PCR sono programmati per leggere le lunghezze d’onda dello spettro di emissione ed eccitazione del SYBR Green (rispettivamente 495nm e 537nm). Questo colorante è molto sensibile alla luce, si lega solo al DNA a doppio filamento e quindi solo all’amplicone appena sintetizzato. I campioni vengono quantificati sulla base di curve di calibrazione ottenute attraverso l’uso di quantità note di copie del gene 16 S rDNA. Il confronto tra il segnale emesso dal campione sconosciuto e i valori di fluorescenza utilizzati per la costruzione della curva di calibrazione permette la quantificazione di una specifica specie microbica. Oltre alla misurazione quantitativa dei batteri target, gli intercalatori come SYBR Green permettono di distinguere ampliconi di diversa lunghezza e di rilevare amplificazioni aspecifiche eventualmente presenti.
Next Generation Sequencing: La peculiarità di questa tecnologia introdotta nel 2006 consiste non solo nella capacità di sequenziare un singolo frammento di DNA alla volta, estendendo questo processo a milioni di frammenti allo stesso tempo, ma anche nella capacità di sequenziare frammenti di DNA in entrambe le direzioni.
Il primo passo coinvolge frammenti di DNA a singolo filamento, alle cui estremità sequenze univoche, chiamate “indice”, vengono caricate su un flusso di cellule dove vengono catturate su una superficie contenente “oligonucleotidi ancora” complementari agli indici, sulla quale vengono immobilizzati per la preparazione delle librerie. L’ibridazione tra questi ultimi e i frammenti di DNA avviene attraverso processi di riscaldamento e raffreddamento, seguiti dall’incubazione con reagenti specifici e una polimerasi isotermica. Attraverso un’amplificazione “a ponte” ogni frammento viene amplificato distintamente dagli altri, creando un cluster di cloni. Quando la generazione del cluster è completa, i modelli generati, dopo un’adeguata denaturazione, sono pronti per il sequenziamento vero e proprio.
Illumina utilizza una tecnologia basata su nucleotidi fluorescenti terminanti a catena con un OH al 3′; questo assicura che venga incorporata una singola base per ciclo. Segue una fase di imaging per identificare il nucleotide incorporato in ogni cluster e una fase chimica per rimuovere il gruppo fluorescente e l’OH terminale per consentire l’incorporazione di un’altra base nel ciclo successivo.
Alla fine del sequenziamento, che dura circa 4 giorni, la sequenza di ogni cluster è sottoposta a processi di selezione (trimming) per eliminare i prodotti di bassa qualità. Durante l’analisi dei dati i frammenti di varie lunghezze vengono allineati e sovrapposti, in questo modo è possibile identificare la sequenza del filamento di partenza. In una procedura standard, vengono analizzate almeno 40-50 milioni di sequenze.
Il sequenziamento shotgun è la sequenza di tutti i genomi presenti in una matrice complessa, come un campione di suolo. Il sequenziamento shotgun è quindi il modo più efficiente per sequenziare un grande pezzo di DNA. Per questo, il DNA di partenza viene suddiviso in modo casuale in molti pezzi più piccoli, una specie di shotgun, e ognuno di questi pezzi viene sequenziato individualmente. Le letture di sequenza risultanti generate dai diversi pezzi vengono poi analizzate da un programma per computer, alla ricerca di tratti di sequenza da diverse letture che sono identiche tra loro. Quando vengono identificate regioni identiche, queste vengono sovrapposte l’una all’altra, permettendo alle due letture di sequenza di essere cucite insieme. Questo processo informatico viene ripetuto più e più volte, per ottenere alla fine la sequenza completa del pezzo di DNA di partenza. L’iniziale frammentazione e lettura casuale del DNA ha dato a questo approccio il nome di “sequenziamento shotgun”.
Tecnologie microbiche per la salute delle api
Numerosi stress biotici e abiotici, come l’uso massiccio di pesticidi in agricoltura e il cambiamento climatico, stanno compromettendo la sopravvivenza degli insetti impollinatori, con conseguenze potenzialmente dannose sia sugli agroecostemi che sui sistemi naturali. In effetti, le api sono responsabili dell’impollinazione dell’84 per cento delle specie vegetali coltivate, il 35 per cento delle quali sono di importanza globale e il 78 per cento di quelle selvatiche. Basti dire che il 70% delle sole colture di sementi (come carote, cipolle, aglio, ecc.) dipende strettamente dall’impollinazione degli insetti, così come l’80% delle 264 specie vegetali di interesse in Europa. Da ciò consegue che l’attività degli insetti impollinatori, comprese le api, svolge un ruolo essenziale a livello economico la cui stima monetaria è di circa € 15 miliardi / anno nella sola Europa, mentre a livello mondiale la stima sale a 153 miliardi di euro / anno.
Oltre a un valore incalcolabile per il mantenimento della biodiversità e degli equilibri presenti nei vari ecosistemi, quindi, le api forniscono miele, cera d’api, propoli, polline e pappa reale: in Europa, i dati raccolti nel 2010 hanno mostrato una produzione di circa 220 000 tonnellate di miele con prezzi che vanno da 1,50 a 40 €/kg a seconda della zona di origine. Oppure, in Australia la produzione di miele e cera d’api ogni anno si aggira intorno a un valore commerciale di $ 90 milioni, sottolineando ancora una volta l’importanza che il settore dell’apicoltura gioca nel panorama. economia mondiale. Le colonie di api da miele sono diminuite rapidamente da 6 milioni negli anni ’40 a circa 2,6 milioni oggi. L’elevata perdita annuale di colonie di api da miele è ancora osservata ed è diventata la norma per gli apicoltori. La salute intestinale gioca un ruolo significativo nella risposta immunitaria dell’ospite innato e nell’adattabilità alla moltitudine di stressanti che le api da miele affrontano oggi.
Anche le covate colpite da “Disturbo del collasso della colonia” (CCD), o “Sindrome da spopolamento dell’alveare”, hanno mostrato segni significativi di squilibrio. Le cause di questa sindrome non sono ancora chiare, ma si pensa che possano essere attribuibili a cambiamenti nei fattori ambientali, malnutrizione, presenza di agenti patogeni e uso massiccio di insetticidi. La sintomatologia vede la presenza di covate che abbandonano le loro larve nonostante la presenza della regina e la mancanza di appetito per le scorte di polline e nettare che non vengono consumate immediatamente (Fig. 13).
Fig. 13. Approfondimenti sul disturbo del collasso della
Una delle possibili cause di questo die-off può essere legata alla disbiosi del microbiota intestinale, come alterazione microbica in termini di quantità e composizione. Con questo termine si indica il fenomeno che influisce negativamente sulle funzioni benefiche del microbiota e che si associa a specifici squilibri metabolici. Infatti, queste carenze potrebbero creare seri problemi sullo sviluppo dei giovani adulti influenzando la loro capacità di sviluppare geni di resistenza, compresi quelli per la sintesi della vitellogenina, e inibendo le funzioni del sistema immunitario, data l’evidenza che lo stesso microbiota promuove la sua efficacia (Fig. 14).
Fig. 14. Consequences of altered gut microbial compositions in bees
Pochi anni fa, abbiamo cercato di capire quali fattori sono in grado di destabilizzare il microbiota, arrivando alla conclusione che la disbiosi è causata da fattori sia biotici che abiotici. Considerando gli stress biotici, si è visto che la dieta, la presenza di patogeni e disturbi specifici (per esempio, CCD) e le condizioni ambientali avverse giocano un ruolo fondamentale. La mancanza di nutrienti ha un impatto distruttivo sul normale sviluppo della flora microbica intestinale, la cui conseguenza è l’aumento della mortalità delle api, così come l’aumento della suscettibilità a malattie e patogeni. Inoltre, le temperature anomale inducono uno stato di stress negli ospiti tale da avere ripercussioni drammatiche sui simbionti.
Considerando gli stressor abiotici, i danni sono quasi interamente attribuibili all’uso di insetticidi, fungicidi, acaricidi e antibiotici. Le api, infatti, durante le operazioni di bottinatura rischiano di ingerire indirettamente e di incontrare i principi attivi, sia sulle principali colture trattate che su quelle limitrofe sottoposte a drift. Questo potrebbe causare seri problemi e squilibri nel metabolismo e nelle difese immunitarie: c’è infatti la possibilità che l’esposizione a certe sostanze interferisca con la capacità delle api di regolare la loro popolazione microbica intestinale.
Per questi motivi, una delle prospettive future più innovative è quella di comprendere il rapporto profondo tra i microrganismi e le api, al fine di migliorare la loro drammatica durata di vita e le loro condizioni.
Disbiosi intestinale: un esempio
Dato il crescente interesse che l’opinione pubblica sta mostrando verso questo prodotto, la prima analisi oggettiva cade sull’effetto del Glifosato (N-fosfonometil-glicina). Si tratta di un erbicida sistemico post-emergenza non selettivo, quindi un erbicida totale. Il suo meccanismo d’azione interrompe la via metabolica responsabile della sintesi di fenilalanina, tirosina e triptofano, inibendo la sintesi della 3-fosfosimato-1-carbossiviniltransferasi (EPSP synthase). Questo erbicida è sempre stato visto come uno dei prodotti meno tossici per gli animali, dato che non hanno questa via metabolica. Nonostante ciò, è stato dimostrato che può colpire organismi non bersaglio mostrando effetti altamente tossici verso lombrichi, microalghe, batteri acquatici, rizosfera ed endofiti. Colpendo i batteri, poi, va sottolineato che gli effetti sono stati rilevati anche nei microrganismi intestinali e nei simbionti della fauna adiacente alle aree agricole, comprese le api.
Nello specifico, Motta et al. (2018) hanno condotto uno studio volto a caratterizzare il microbiota delle api esposte al Glifosato, concludendo che l’abbondanza assoluta di S. alvi, G. apicola, Lactobacillus sp. e Bifidobacterium sp. (Fig. 15) ha subito una significativa diminuzione.
Fig. 15. Analisi sul microbiota intestinale dell’ape
Il prodotto ha compromesso la flora batterica bloccandone la crescita senza però ucciderla direttamente; si è quindi ipotizzato che l’effetto ricada sulla divisione cellulare nei primi giorni di colonizzazione. Le api che hanno incontrato l’erbicida in campo, infatti, avrebbero trasportato il principio attivo all’interno dell’alveare che, essendo molto stabile e insolubile in acqua, sarebbe potuto rimanere a lungo sulle superfici. Allo stesso modo, anche in campo, la persistenza fa sì che la contaminazione possa durare a lungo. All’interno dell’alveare, quindi, la diffusione per trofallassi e il contatto con altre api fa sì che il prodotto raggiunga le giovani larve nutrite dagli adulti, alterando irreparabilmente lo sviluppo delle specie simbionti benefiche.
Come viene acquisito il microbiota?
Fig. 16. Il ciclo di crescita di un’ape
I batteri naturali raccolti dalle api da fiori durante la raccolta di nettare e polline risiedono prevalentemente nel midgut e nel hindgut delle api. I batteri intestinali che si trovano naturalmente nelle api sono dinamici. Durante lo sviluppo delle larve (Fig. 16), la popolazione batterica fluttua. Le larve ricevono alcuni batteri dalle api nutrici che le nutrono. Durante l’impupamento, il rivestimento dell’intestino viene rimosso, e l’intestino di un’ape adulta appena nata è sterile. L’intestino viene rapidamente ripopolato con il microbiota caratteristico. Come avviene questo? Le vie principali sono la trofallassi orale, l’interazione con il materiale dell’alveare e la trasmissione fecale-orale. In particolare, il microbiota caratteristico delle api adulte inizia a svilupparsi circa quattro giorni dopo lo sfarfallamento.
Anche se i fattori che hanno permesso l’evoluzione del microbiota di ogni essere vivente sono ancora sconosciuti, è provato che le api sociali possiedono una microflora distintiva a seconda della famiglia a cui appartengono. Per esempio, si è visto che analizzando il microbiota di diversi generi di Apoidea corbiculati eusociali come Bombus spp., Megachile spp. e Apis spp., i principali generi batterici erano ricorrenti (Snodgrassella spp., Gilliamella spp., Bifidobacterium spp. e Lactobacillus spp.) ma le specie variavano in relazione alla specie dell’insetto. Da qui l’ipotesi che vede il microbiota come il risultato di una co-evoluzione dinamica tra microrganismi e ospiti, dipendente dall’ambiente e dalle variazioni genotipiche a cui le specie sono state sottoposte nel corso dei secoli, la cui ricchezza è anche correlata alla dimensione delle singole api e di intere colonie. Infatti, la costituzione di una flora microbica specie-specifica è il risultato di una lunga selezione in cui sono stati stabiliti i rapporti benefici ottimali sia per i microrganismi che per gli ospiti.
Chi e dove sono?
È stato stimato che all’interno dell’intestino delle api operaie adulte sono presenti circa 1 miliardo di cellule batteriche, il 95% delle quali si trova, nello specifico, nell’intestino posteriore (Fig. 17). Qui si è notata una specifica differenziazione tra ileo e retto; nel primo tre specie di Proteobatteri come G. apicola, F. perrara e S. alvi che formano un denso biofilm in corrispondenza dei tubi di Malpighi e che continua per tutta la lunghezza della parete dell’ileo. Nel retto, invece, prevale una densa comunità batterica formata da tre classi di Gram positivi, quali Firmicutes (Firm-4, Firm- 5) e Bifidobacteria. Per quanto riguarda l’intestino medio, si è visto che sono presenti soprattutto Lactobacillus spp. e Acetobacteraceae, cioè quei taxa che si trovano anche nel polline, nel nettare e più in generale nell’alveare. Si può quindi affermare che nell’intestino medio non esiste un microbiota pre-adattato e che esso varia in relazione all’ambiente e alle abitudini alimentari dell’individuo. In termini quantitativi, quindi, qui c’è una flora molto meno abbondante che nell’intestino crasso. Anche l’intestino medio contiene pochi batteri, e quelli presenti sono più concentrati nella zona pro-ventricolare adiacente all’intestino posteriore.
Fig. 17. Nucleo del microbiota dell’ape
Quali sono le funzioni del microbiota intestinale?
Negli ultimi anni, la comunità scientifica ha iniziato ad interessarsi sempre più al ruolo che il microbiota svolge nel benessere delle api (Fig. 18). Numerosi studi e ricerche hanno dimostrato che le interazioni con l’ospite hanno effetti di supporto sia a livello metabolico e nutrizionale che in termini di risposta immunitaria agli agenti patogeni. Per quanto riguarda il supporto alimentare, una flora batterica equilibrata è necessaria per una corretta assimilazione dei nutrienti in quanto, grazie alla sua attività enzimatica, partecipa alla degradazione degli zuccheri complessi. Oltre ad essere responsabile della presenza nell’intestino di cellulasi, emicellulasi ed enzimi ligninolitici utili al processo di digestione dei grani di polline, la ricchezza di specie è tale da permettere la coesistenza di diverse vie di catalisi degli zuccheri (soprattutto per Gammaproteobatteri, Firmicutes e Bifidobacteriaceae). In effetti, è stato stimato che il 91% dei trascritti proteici legati alla digestione delle macromolecole vegetali e ai fenomeni di fermentazione delle subunità monomeriche sono prodotti dai batteri. Un altro esempio concreto riguarda le pectin-lasi capaci di degradare le pectine presenti nelle cellule della parete dei grani di polline. Quest’ultima è anche un ottimo indicatore dell’alta variabilità e adattabilità genetica all’interno della stessa specie di microrganismi. Infatti, si è visto che solo alcuni ceppi di G. apicola le possiedono mentre altri ne sono completamente privi. L’importanza di una maggiore capacità digestiva e, di conseguenza, la capacità di metabolizzare i nutrienti che non potrebbero essere demoliti, è stata dimostrata in diversi studi. Zheng et al. (2017), per esempio, confrontando api con un microbiota normale e altre senza alcun tipo di flora intestinale, hanno evidenziato differenze fisiologiche apprezzabili. Nelle prime, i simbionti influenzavano positivamente le dimensioni dell’intestino, il peso degli individui, i valori di vitellogenina e insulina e la sensibilità agli zuccheri. Questi risultati hanno quindi suggerito che il microbiota potrebbe influenzare l’appetito e la crescita del corpo delle api attraverso l’aumento dei segnali legati alla presenza di insulina.
Oltre all’idrolisi di carboidrati complessi, i microrganismi intestinali producono utili substrati metabolici, come la vitamina B e altre e corte catene di acidi grassi. Ad esempio, è stato visto che i generi Lactobacillus sp. Il fenomeno della simbiosi con l’ospite va oltre il supporto nutrizionale e metabolico: il microbiota svolge un ruolo importante nel sostenere il sistema immunitario. Infatti, in primo luogo, i batteri potrebbero stimolare direttamente la produzione delle molecole di difesa dell’ape. A seguito del contatto tra la superficie epiteliale e il peptidoglicano (componente principale della parete cellulare dei batteri Gram-positivi), il sistema immunitario potrebbe attivare i geni per produrre 6 peptidi antimicrobici come: abaecina, imenoptaecina, apidicaina, defensin-1 e defensin-2. La produzione di questi composti, quindi, è accentuata dalle alterazioni delle membrane microbiche stesse e può anche essere indotta dall’esposizione ad alcuni microrganismi patogeni e non patogeni. Ad esempio, Frischella perrara, un simbionte che colonizza la regione dell’ileo nell’intestino posteriore, stimola soprattutto la produzione di apidicaina. In secondo luogo, il microbiota può essere direttamente responsabile della produzione di composti antimicrobici, che, tra le altre cose, è confermato da numerosi studi. (2015), ad esempio, ha documentato la presenza di numerosi geni coinvolti nella biosintesi della streptomicina e dei metaboliti secondari espressi dai simbionti e che possono svolgere un ruolo nel mantenimento del microbiota.
Fig. 18. Funzioni del microbiota
Cosa possiamo fare?
Dalla nostra e generale esperienza nell’uomo e negli animali, gli stress biotici e abiotici potrebbero influenzare negativamente la composizione del microbiota intestinale e quindi indurre cambiamenti specifici nelle attività del microrganismo a livello intestinale.
Dobbiamo chiederci se qualsiasi tipo di modulazione microbiota, mediante la somministrazione di ceppi selezionati, possa ripristinare questa perturbazione, ridurre la mortalità delle api e/o migliorare la salute delle api.
I probiotici sono “microrganismi vivi che, se somministrati in quantità adeguate, apportano un beneficio alla salute dell’ospite, esclusi i riferimenti ad agenti bioterapeutici e microrganismi benefici non utilizzati negli alimenti” (FAO /OMS, 2001). La loro somministrazione, quindi, non deve essere associata a effetti negativi sugli organismi e sull’ambiente. Le modalità di azione di questi microrganismi possono essere riassunte nelle seguenti funzioni:
- FUNZIONE PROTETTIVA: lussazione degli agenti patogeni, competizione per i nutrienti, competizione con i recettori e produzione di molecole antimicrobiche (ad esempio batteriocina, acidi organici …);
- FUNZIONE STRUTTURALE: effetto barriera, biofilm sulla parete intestinale dei capelli, sviluppo del sistema immunitario;
- FUNZIONE METABOLICA: differenziazione e proliferazione delle cellule epiteliali intestinali, catalisi di sostanze cancerogene presenti nella dieta, sintesi di vitamine, fermentazione di zuccheri non digeribili, assorbimento ionico e risparmio energetico.
Tuttavia, sembra che il principale meccanismo d’azione dei probiotici sia la stimolazione del sistema immunitario: seguendo la coesione con la parete intestinale, sono in grado di stimolare una serie di segnali a cascata che attivano la sintesi dei peptidi antimicrobici. In pratica, sono in grado di svolgere quei compiti descritti in precedenza che il microbiota dell’ape svolge naturalmente, dimostrandosi un ipotetico aiuto ottimale nella salvaguardia e nell’ottimizzazione, oltre a migliorare le prospettive di vita dell’ape.
Come per l’alimentazione umana e animale, i principali batteri considerati in grado di questi benefici sono Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Bacillus spp.
In conclusione, l’uso di probiotici ha recentemente iniziato a essere valutato anche all’interno dell’alveare stesso. Infatti, sebbene le api preferiscano consumare polline fresco, in determinate condizioni, come la stagionalità, devono rifornirsi delle riserve immagazzinate. L’ambiente umido (50-60% RH) che si crea a seguito della raccolta del polline aumenta il rischio di crescita batterica incontrollata e, soprattutto, fungina. C’è una chiara necessità di preservare le scorte all’interno dell’alveare per evitare infezioni che potrebbero portare a esiti fatali, come larve calcificate a causa di api Ascosphaerao infezioni intestinali dovute a Nosema spp.
Test: LO7 Livello avanzato
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