Εκπαίδευση “Βιοτεχνολογία”

LO2_BL

LO3_BL

„ Βιοσένσορες & Βιοτσίπ για ένα βιώσιμο “

Αρχάριο επίπεδο

Τα βιοτσίπ εμφανίστηκαν ως μια καινοτόμος πλατφόρμα μικροτεχνολογίας για ανάλυση βιο-μορίων τη δεκαετία του 1980.

Περιεχόμενα

Βιοσένσορες & Βιοτσίπ: Μια επισκόπιση

Σχέδια για Βιοαισθητήρες: Σχεδιασμός & Λειτουργία

Ηλεκτροχημικοί βιοαισθητήρες
Βιοαισθητήρες με ενζυμική βάση
Ανοσολογικός βιοαισθητήρας
Βιοσένσορες DNA
Το μέλλον των κλινικών βιοαισθητήρων

Σχέδια για Βιοτσίπ: Σχεδιασμός & Λειτουργία

Μικροσυστοιχία DNA
Μικρορευστό τσιπ
Μικροσυστοιχία πρωτεϊνών
Εφαρμογές βιοτσίπ

Βιοσένσορες & Βιοτσίπ: Μια επισκόπιση

Σχέδια για Βιοαισθητήρες: Σχεδιασμός & Λειτουργία

Ηλεκτροχημικοί βιοαισθητήρες
Βιοαισθητήρες με ενζυμική βάση
Ανοσολογικός βιοαισθητήρας
Βιοσένσορες DNA
Το μέλλον των κλινικών βιοαισθητήρων

Σχέδια για Βιοτσίπ: Σχεδιασμός & Λειτουργία

Μικροσυστοιχία DNA
Μικρορευστό τσιπ
Μικροσυστοιχία πρωτεϊνών
Εφαρμογές βιοτσίπ

Βιοσένσορες & Βιοτσίπ: Μια επισκόπιση

Τα βιοτσίπ εμφανίστηκαν ως μια καινοτόμος πλατφόρμα μικροτεχνολογίας για ανάλυση βιο-μορίων τη δεκαετία του 1980. Μια ποικιλία τεχνολογιών, όπως οι επιστήμες της ζωής, η τεχνολογία των πληροφοριών, η μικροηλεκτρονική και η μικρομηχανική, εμπλέκονται στις βασικές τεχνολογίες. Τα βιοτσίπ θεωρούνται σημαντικά δυνητικά όργανα στη σύγχρονη έρευνα της επιστήμης της ζωής, την ιατρική διάγνωση, την ανακάλυψη φαρμάκων, την παρακολούθηση της ασφάλειας των τροφίμων και τη γεωργία ως χαρακτηριστικά υψηλής απόδοσης, μικρογραφίες, αυτοματοποιημένα και οικονομικά αποδοτικά. Τα βιοτσίπ αναμένεται να επιτρέψουν την ταχύτητα και το εύρος της αναλυτικής διαδικασίας να αυξηθούν δραματικά και να προσφέρουν τεράστια οικονομική αξία. Επιπλέον, τα τελευταία χρόνια, πολλές κυβερνήσεις και βιομηχανικές εταιρείες στον κόσμο έχουν επενδύσει σημαντικά σε αυτόν τον τομέα. Η τεχνολογία των βιοτσίπ βρίσκεται στην πρώτη της εξέλιξη προς το παρόν. Αυτός είναι ένας τομέας που αλλάζει συνεχώς. Το μέλλον για την έρευνα και την ανάπτυξη βιοτσίπ είναι λαμπρό. Υπάρχει έντονος ανταγωνισμός σε αυτόν τον τομέα.

Στη βιοϊατρική και την επιστήμη της ζωής, η μικρογραφία χημικών και βιοϊατρικών εργαστηριακών διαδικασιών στα μικροτσίπ είναι ένα πεδίο που επεκτείνεται ταχέως. Οι τεχνολογίες Lab-on-chip θα φέρουν πολλά οφέλη έναντι των ομολόγων τους μακρο-μεγέθους. Συγκεκριμένα, οι υψηλότερες αναλογίες επιφάνειας προς όγκο έχουν ως αποτέλεσμα μειωμένες χημικές απαιτήσεις, μειωμένα απόβλητα, καλύτερο έλεγχο, γρήγορη επεξεργασία και σημαντική ικανότητα παράλληλης επεξεργασίας και ενσωμάτωσης διαδικασίας. Οι τεχνολογίες εργαστηρίου σε τσιπ έχουν τη δυνατότητα να έχουν σημαντικό κοινωνικοοικονομικό αντίκτυπο. Στην εργαστηριακή ιατρική, πλήρως ενσωματωμένες μικροσυσκευές για χημική σύνθεση και διάγνωση ασθενειών προσφέρουν μια επιστημονική ανακάλυψη και μια αλλαγή παραδείγματος στη χημική επεξεργασία. Το έργο του ανθρώπινου γονιδιώματος έχει συμβάλει τεράστια σε αυτήν την τεχνολογία.

Στον τομέα της ανάλυσης, οι βιοαισθητήρες επιτρέπουν μεγάλες καινοτομίες που διευκολύνονται και διευκολύνονται από τις εξελίξεις στη συνθετική βιολογία. Η δυνατότητα των βιοαισθητήρων να εντοπίζουν ένα ευρύ φάσμα μορίων εύκολα και με ακρίβεια τα καθιστά εξαιρετικά σημαντικά για μια ποικιλία βιομηχανικών, ιατρικών, οικολογικών και επιστημονικών εφαρμογών. Οι στρατηγικές σχεδιασμού βιοαισθητήρων είναι τόσες πολλές όσο και οι εφαρμογές τους, με μεγάλες ομάδες βιοαισθητήρων να περιλαμβάνουν νουκλεϊκά οξέα, πρωτεΐνες και παράγοντες μεταγραφής. Με βάση την αναμενόμενη χρήση και τις παραμέτρους που απαιτούνται για τη βέλτιστη απόδοση, καθένας από αυτούς τους τύπους βιοαισθητήρων έχει πλεονεκτήματα και περιορισμούς. Ειδικά, πρέπει να ληφθούν υπόψη στοιχεία όπως η ιδιαιτερότητα του συνδέσμου, η ευαισθησία, το δυναμικό εύρος, το εύρος λειτουργίας, η λειτουργία εξόδου, ο χρόνος ενεργοποίησης, η ευκολία χρήσης και η ευκολία στη μηχανική κατά την επιλογή του σχεδιασμού του βιοαισθητήρα.

Σχέδια για Βιοαισθητήρες: Σχεδιασμός & Λειτουργία

Οι βιοαισθητήρες είναι αισθητήρες που μετατρέπουν τις διαδικασίες βιοανάγνωσης μέσω ενός φυσικοχημικού μετατροπέα σε παρατηρήσιμα σήματα, με ηλεκτρονικές και οπτικές τεχνικές ως δύο κύριους μορφοτροπείς. Η δημιουργία βιοαισθητήρων καλύπτει τη σημερινή ραγδαία αυξανόμενη ανάγκη για κλινική διάγνωση. Ένας συνδυασμός πλεονεκτημάτων επιτυγχάνεται με τη χρήση βιοαισθητήρων. Οι βιοαισθητήρες, πρώτον, είναι ιδιαίτερα ευαίσθητοι. Αυτό συμβαίνει επειδή τα βιομόρια έχουν μεγάλη συγγένεια με τους στόχους τους, για παράδειγμα, τα αντισώματα συλλαμβάνουν αντιγόνα με σταθερά διάστασης στη νανομοριακή κλίμακα και οι αλληλεπιδράσεις DNA -DNA είναι πολύ ισχυρότερες από το αντιγόνο -αντίσωμα. Δεύτερον, η βιολογική αναγνώριση είναι συνήθως πολύ επιλεκτική. Το ένζυμο και το υπόστρωμα είναι σαν μια κλειδαριά και ένα κλειδί, για παράδειγμα. Μια τέτοια υψηλή επιλεκτικότητα οδηγεί συχνά σε βιοαισθητήρες που είναι επιλεκτικοί. Τρίτον, η παραγωγή φθηνών, ολοκληρωμένων και έτοιμων προς χρήση συσκευών βιοαισθητήρων έχει γίνει σχετικά εύκολο να αναπτυχθεί λόγω της ανάπτυξης της σύγχρονης ηλεκτρονικής βιομηχανίας. Η ικανότητα ανίχνευσης παθογόνων ή η γενετική ανάλυση στα νοσοκομεία είναι σίγουρα βελτιωμένη από αυτούς τους βιολογικούς αισθητήρες. το πιο σημαντικό, είναι ιδιαίτερα χρήσιμα για μικρές κλινικές και ακόμη και ανάλυση σημείων φροντίδας.

Για βιοαισθητήρες με κλινικές εφαρμογές, έχει αναπτυχθεί μια σειρά νέων τεχνικών. Οι βιοαισθητήρες είναι, γενικά, αναλυτικές συσκευές κατασκευασμένες από ένα στοιχείο βιολογικής αναγνώρισης και έναν οπτικό/ηλεκτρονικό μετατροπέα. Το βιολογικό στοιχείο είναι υπεύθυνο για τη σύλληψη αναλυτών διαλύματος και ο μετατροπέας μετατρέπει το συμβάν σύνδεσης σε μετρήσιμη παραλλαγή σήματος. Από τη φύση της αναγνώρισης, οι βιοαισθητήρες με βάση το ένζυμο, οι ανοσολογικοί βιοαισθητήρες και οι βιοαισθητήρες DNA, θα μπορούσαν να κατηγοριοποιήσουν τον τύπο των βιοαισθητήρων. Επιπλέον, διατίθενται ηλεκτρονικοί βιοαισθητήρες (ηλεκτρικοί ή ηλεκτροχημικοί), οπτικοί βιοαισθητήρες (φθορισμός, συντονισμός πλασμώνος επιφάνειας ή Raman) και πιεζοηλεκτρικοί βιοαισθητήρες (μικροζυγός κρυστάλλου χαλαζία) ανάλογα με τον τύπο του μορφοτροπέα.

Ηλεκτροχημικοί βιοαισθητήρες

Για τη βιολογική ανίχνευση, όπου τα ηλεκτρόδια λειτουργούν είτε ως δότες ηλεκτρονίων είτε ως δέκτες ηλεκτρονίων, οι ηλεκτροχημικές τεχνικές είναι ιδιαίτερα χρήσιμες. Εκτεταμένα ηλεκτροχημικά πειράματα έχουν δείξει ότι η θεωρία μεταφοράς ηλεκτρονίων Marcus συμμορφώνεται επίσης με την ετερογενή μεταφορά ηλεκτρονίων μεταξύ ηλεκτροδίων και ορίων οξειδοαναγωγής που περιορίζονται στην επιφάνεια, παρόμοια με τα ζεύγη δότη-αποδέκτη σε ομοιογενή διαλύματα. Αυτό σημαίνει ότι οι μικρές μεταβολές της απόστασης στα οξειδοαναγωγικά περιορισμένα στην επιφάνεια μόρια μπορούν να προκαλέσουν μεγάλες διαφορές στους ετερογενείς ρυθμούς μεταφοράς ηλεκτρονίων που υποτίθεται ότι μεταφράζονται σε ανιχνεύσιμες αλλαγές των ηλεκτροχημικών σημάτων. Ο Hellinga και οι συνεργάτες του, για παράδειγμα, πρότειναν μια στρατηγική ηλεκτροχημικής ανίχνευσης που εκμεταλλεύεται τις κινήσεις κάμψης μεντεσέ που προκαλούνται από πρωτεΐνες. Ένα χρυσό ηλεκτρόδιο επικαλύφθηκε αρχικά με μια αυτοσυναρμολογημένη μονοστιβάδα (SAM), η οποία δίνει μια ευέλικτη πλατφόρμα για ακινητοποίηση πρωτεΐνης συγκεκριμένης θέσης. Η πρωτεΐνη που δεσμεύει τη μαλτόζη (MBP) στη συνέχεια συνδέθηκε με την επιφάνεια του ηλεκτροδίου χρυσού με έναν ιδιαίτερο προσανατολισμό, καθώς η ομάδα οξειδοαναγωγικής αναφοράς του ρουθηνίου (Ru (II)) είναι στερεωμένη σε ένα ορισμένο εύρος πάνω από το ηλεκτρόδιο. Καθώς η μαλτόζη προσδέματος συνδέεται με την ενεργή θέση, ο αναφορέας Ru (II) απομακρύνεται από το ηλεκτρόδιο προκαλώντας μια κίνηση κάμψης μεντεσέ του MBP (Εικόνα 1).

Εικόνα 1. Κατασκευή και λειτουργία ηλεκτροχημικού βιοαισθητήρα

Αυτή η αλλαγή απόστασης που προκαλείται από τη σύνδεση με μαλτόζη προκαλεί μειώσεις εξαρτώμενων από τη συγκέντρωση των ηλεκτροχημικών σημάτων, παρέχοντας έτσι έναν τρόπο για την ηλεκτρονική αίσθηση της μαλτόζης. Έχει επίσης αποδειχθεί η χρήση αυτής της εξαιρετικά γενικευμένης προσέγγισης ανίχνευσης για την ανίχνευση διαφόρων αναλυτών με μια οικογένεια πρωτεϊνών ή ενζύμων που υφίστανται μεταβολικές διαμορφώσεις που προκαλούνται από δέσμευση συνδέτη.

Βιοαισθητήρες με ενζυμική βάση

Οι πρώτοι βιοαισθητήρες που καταγράφηκαν ποτέ ήταν οι βιοαισθητήρες με βάση την οξειδάση της γλυκόζης (GOD), που δημιουργήθηκαν από τους Clark και Lyons το 1962. Η υπεργλυκαιμία, μια χρόνια αυξημένη συγκέντρωση γλυκόζης στο αίμα, είναι κοινή για τον σακχαρώδη διαβήτη. Ως αποτέλεσμα, ο τακτικός έλεγχος της συγκέντρωσης γλυκόζης στο αίμα τους είναι απαραίτητος για διαβητικούς ασθενείς. Το όφελος της ηλεκτροχημείας σε συνδυασμό με την κατάλυση ενζύμων είναι αυτός ο βιοαισθητήρας και οι νεότερες εκδόσεις του. Ένα ηλεκτρόδιο ακινητοποιημένο με τον GOD ήταν ο βιοαισθητήρας του Clark. Η οξειδωμένη μορφή του GOD αλληλεπιδρά με τη γλυκόζη παρουσία γλυκόζης και παράγει γλυκονικό οξύ και μειωμένο GOD, με δύο ηλεκτρόνια και δύο πρωτόνια. Καθώς το διαλυμένο οξυγόνο αντιδρά με μειωμένο GOD, αυτή η οξείδωση της γλυκόζης καταναλώνει επίσης οξυγόνο στο διάλυμα, παράγοντας έτσι υπεροξείδιο του υδρογόνου και οξειδωμένο GOD και μειώνοντας την πίεση οξυγόνου. Ως αποτέλεσμα, με την ηλεκτροχημική αίσθηση του οξυγόνου με ένα ηλεκτρόδιο οξυγόνου Clark, το ηλεκτρόδιο μπορεί να ανιχνεύσει τη γλυκόζη. Αυτό το είδος αισθητήρα θεωρείται βιοαισθητήρας της “πρώτης γενιάς”. Η Yellow Springs Instrument Company (Οχάιο, ΗΠΑ) κυκλοφόρησε αυτόν τον βιοαισθητήρα πρώτης γενιάς στη δεκαετία του 1970.

Ο βιοαισθητήρας δεύτερης γενιάς αντικαθιστά το φυσικό υπόστρωμα, το οξυγόνο, με μικρά τεχνητά οξειδοαναγωγικά μόρια που λειτουργούν ως οξειδοαναγωγικοί μεσολαβητές και ανταλλάσσουν ηλεκτρόνια μεταξύ ηλεκτροδίων και ενζύμων. Για τη βελτίωση της απόδοσης του αισθητήρα, δηλαδή της ευαισθησίας και της σχέσης σήματος προς θορύβου, χρησιμοποιήθηκε μια ποικιλία διαλυτών οξειδοαναγωγικών μορίων, όπως σιδηροκένιο, θειονίνη, μπλε του μεθυλενίου, μεθυλο βιολόγο. Αυτοί οι μεσολαβητές διαλύθηκαν αρχικά σε ένα διάλυμα. Παίρνουν ηλεκτρόνια από τα ηλεκτρόδια και στη συνέχεια, ή αντίστροφα, αυτά τα ηλεκτρόνια μεταφέρονται στο οξειδοαναγωγικό κέντρο των ενζύμων. Οι ακινητοποιημένοι διαμεσολαβητές προτάθηκαν ως ένα βήμα μπροστά, προκειμένου να ενισχυθούν οι βιοαισθητήρες χωρίς αντιδραστήριο. Για παράδειγμα, για το υπεροξείδιο του υδρογόνου, οι Ruan et al το 1998 τεκμηρίωσαν έναν αντιδραστήριο αισθητήρα στερεάς κατάστασης. Τα ηλεκτρόδια χρυσού τροποποιήθηκαν αρχικά με L-κυστεΐνη και στη συνέχεια συνδέθηκαν πολλαπλά στρώματα υπεροξειδάσης χρένου (HRP) με γλουταραλδεϋδη στην αμινο ομάδα κυστεΐνης και η θειονίνη συνδέθηκε περαιτέρω με το ένζυμο με τον ίδιο χημικό σύνδεσμο. Ως αποτέλεσμα, το ηλεκτρόδιο χρυσού ακινητοποιήθηκε τόσο από το ένζυμο όσο και από τον διαμεσολαβητή, το οποίο μπορούσε να ανιχνεύσει το υπεροξείδιο του υδρογόνου ευαίσθητα στο υπό εξέταση διάλυμα χωρίς περαιτέρω προσθήκη αντιδραστηρίου. Ένα ουσιαστικό πλεονέκτημα αυτής της διαμόρφωσης του βιοαισθητήρα είναι ότι ο διαμεσολαβητής είναι στερεωμένος στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου, αποτρέποντας έτσι το πρόβλημα διάχυσης.

Μια εναλλακτική λύση που περιελάμβανε τη χρήση οξειδοαναγωγικών πολυμερών ανέφερε η Heller και οι συνεργάτες της. Αρχικά, παρασκεύασαν ένα πολυμερές ντοπαρισμένο με σύμπλεγμα Os⁺². Αυτός ο τύπος πολυμερούς λειτουργεί ως “μοριακό σύρμα” και ανταλλάσσει ηλεκτρόνια μεταξύ του ενζύμου και του ηλεκτροδίου. Το πολυμερές Os και η οξειδάση γλυκόζης ακινητοποιούνται στη συνέχεια στο ηλεκτρόδιο άνθρακα, το οποίο δημιουργεί μια ευαίσθητη απόκριση στην παρουσία γλυκόζης. Theyταν σε θέση να κάνουν σχεδόν 100 % ακινητοποιημένα μόρια ενζύμου ηλεκτροενεργά χρησιμοποιώντας αυτά τα οξειδοαναγωγικά πολυμερή, τα οποία συνέβαλαν σε μια πολύ υψηλή ευαισθησία μέθοδο ανίχνευσης γλυκόζης.

Η εμπορευματοποίηση του βιοαισθητήρα δεύτερης γενιάς με ένζυμα ήταν αρκετά επιτυχής. Το 1987, δημιουργήθηκε το MediSense και απελευθερώθηκαν οι αισθητήρες γλυκόζης ExactechTM. Αυτή η επιτυχία οδήγησε σε μια επανάσταση στην υγειονομική περίθαλψη για τους διαβητικούς ασθενείς. Αντί να ταξιδέψουν σε νοσοκομεία, μπόρεσαν να ελέγξουν τη συγκέντρωση γλυκόζης αίματος στο σπίτι. Τα συστήματα MediSense και αργότερα αμπερομετρικός βιοαισθητήρας αποτελούνται από ηλεκτρόδια άνθρακα μίας χρήσης, με εκτύπωση οθόνης και διαμεσολαβητές (ταινίες δοκιμής). Ο αισθητήρας αρχίζει να λειτουργεί όταν μια σταγόνα αίματος εφαρμόζεται στη δοκιμαστική ταινία και καταγράφει την αμπερομετρική απόκριση, η οποία μετατρέπεται σε ένα ψηφίο που εμφανίζεται στην οθόνη LCD, υποδεικνύοντας τη συγκέντρωση γλυκόζης.

Πιο πρόσφατα, σχεδιάζοντας ένα ανασυσταμένο ένζυμο GOD, οι Xiao et al (2003) δημοσίευσαν μια νέα γενιά βιοαισθητήρα γλυκόζης. Πρώτα παρασκεύασαν apo-GOD απαλλαγμένο από τον συμπαράγοντα δινουκλεοτιδίου φλαβίνης αδενίνης (FAD), στη συνέχεια λειτούργησαν και ανακατασκεύασαν ένα νανοσωματίδιο χρυσού 1,4-nm με FAD στο apo-GOD. Χρησιμοποιώντας μονοστιβάδα διθειόλης, ένα τέτοιο ανασυσταθέν ένζυμο ευθυγραμμίστηκε με ηλεκτρόδια χρυσού (Εικόνα 2). Έδειξαν ότι ο κύκλος μεταφοράς ηλεκτρονίων αυτού του τεχνητού ενζύμου είναι τόσο υψηλός όσο 5000 s-1, περίπου 8 φορές υψηλότερος από το κανονικό ένζυμο (700 s-1). Το νανοσωματίδιο χρυσού σε αυτό το σύστημα χρησιμεύει ως ρελέ ηλεκτρονίων για την ηλεκτρική καλωδίωση του οξειδοαναγωγικού κέντρου του ενζύμου. Σε αυτόν τον τομέα, ο βιοαισθητήρας γλυκόζης που καθιερώθηκε από τους Xiao et al αντιπροσωπεύει ένα νέο μονοπάτι, απαλλαγμένο από κάθε μεσολαβητή και ιδιαίτερα ευαίσθητο. Πιο πρόσφατα, χρησιμοποιώντας νανοσωλήνες άνθρακα μονής τοιχώματος (SWNTs) αντί για νανοσωματίδια χρυσού, η ομάδα του Willner τεκμηρίωσε μια τροποποιημένη έκδοση αυτού του αισθητήρα και συνειδητοποίησε μια παρόμοια ανώτερη απόδοση. Αν και δεν υπάρχει ακόμη εμπορευματοποίηση αυτής της τεχνολογίας, αναμένεται ότι οι τελευταίας τεχνολογίας βιοαισθητήρες θα βελτιωθούν περαιτέρω.

Εικόνα 2. Κατασκευή και λειτουργία ενζυμικού βιοαισθητήρα

Ανοσολογικός βιοαισθητήρας

Για τον προσδιορισμό περιβαλλοντικών ή κλινικά σημαντικών στόχων, οι ανοσολογικοί βιοαισθητήρες εξαρτώνται από ένα ιδιαίτερα ειδικό ανοσολογικό σύστημα, δηλαδή αντισώματα και αντιγόνα. Στην πραγματικότητα, οι ανοσολογικοί βιοαισθητήρες είναι μια σύγχρονη παραλλαγή της ενζυμικής ανοσοπροσροφητικής δοκιμασίας (ELISA), με χαμηλότερο κόστος, αυξημένη ταχύτητα και ευκολία εξυπηρέτησης και ευαισθησία συγκρίσιμη ή και υψηλότερη.

Μεταξύ των πιο συνηθισμένων είναι οι ηλεκτροχημικοί ανοσολογικοί βιοαισθητήρες. Υπάρχουν δύο τύποι ανοσολογικών βιοαισθητήρων. Πρώτον, το ηλεκτρόδιο ακινητοποιείται με ένα αντίσωμα σύλληψης, το οποίο πιάνει ένα συγκεκριμένο αντιγόνο στόχο. Μέσω ενός δευτερογενούς αντισώματος επισημασμένου με οξειδοαναγωγικά μόρια ή ένζυμα, επιτυγχάνεται η μεταγωγή σήματος. Δεύτερον, ένα αντιγόνο ηλεκτροδίων ακινητοποιείται, το οποίο ανιχνεύει συγκεκριμένα αντισώματα.

Ο Ju και οι συνεργάτες του ανακάλυψαν έναν αμπερομετρικό ανοσολογικό βιοαισθητήρα καρκινοεμβρυονικού αντιγόνου (CEA). Τα θειονίνη και τα επισημασμένα με HRP αντισώματα CEA ακινητοποιήθηκαν ταυτόχρονα σε ένα υαλώδες ηλεκτρόδιο άνθρακα διασταυρωμένο με γλουταραλδεyδη. Στο διάλυμα, το οποίο συνδέθηκε με την αντίδραση ηλεκτροδίου της θειονίνης, το HRP μείωσε καταλυτικά το υπεροξείδιο του υδρογόνου, οδηγώντας σε καταλυτικό σήμα. Το οξειδοαναγωγικό κέντρο του HRP αποκλείστηκε εν μέρει από τη σύλληψη του CEA, οδηγώντας σε εξασθένηση των αμπερομετρικών σημάτων.

Ο Rusling και οι συνεργάτες του εκμεταλλεύτηκαν πρόσφατα τα SWNT για την ενίσχυση της ανοσολογικής απόδοσης του βιοαισθητήρα (Εικόνα 3).

Εικόνα 3. Κατασκευή και λειτουργία ανοσολογικού βιοαισθητήρα

Χρησιμοποιώντας αυτόματη συναρμολόγηση μετάλλων, σχεδίασαν κάθετα ευθυγραμμισμένες συστοιχίες SWNTs (forest SWNT) σε πυρόλυτα ηλεκτρόδια γραφίτη. Το Anti-HSA, χρησιμοποιώντας EDC/NHS, στη συνέχεια συνδέθηκε ομοιοπολικά στα καρβοξυλιωμένα άκρα του δάσους SWNT. Το ηλεκτρόδιο επωάστηκε περαιτέρω με ένα δευτερεύον σημασμένο με HRP αντίσωμα anti-HSA μετά τη σύλληψη του στόχου HSA. Ο στόχος HSA στο διάλυμα δοκιμής μπορεί να προσδιοριστεί με βάση το καταλυτικό σήμα του HRP για υπεροξείδιο του υδρογόνου. Η ευαισθησία ανίχνευσης, η οποία ήταν περίπου 1 nM, βελτιώθηκε δραματικά με τη χρήση forest SWNT. Αυτό πιθανότατα οφείλεται στη βελτιωμένη αντιδραστικότητα της μεταφοράς ηλεκτρονίων του HRP εγκλωβισμένου σε forest SWNT.

Ένα από τα πιο συναφή κλινικά εργαλεία ήταν οι ανοσολογικές δοκιμασίες. Ωστόσο, οι υπάρχουσες μέθοδοι ανάλυσης, όπως η ELISA, απαιτούν μεγάλα και δαπανηρά εργαλεία καθώς και καλά εκπαιδευμένους ειδικούς. Για την ανάπτυξη φθηνών, μικροσκοπικών και συμπαγών συσκευών, οι ηλεκτροχημικές μέθοδοι είναι καλά προσαρμοσμένες. Ως αποτέλεσμα, η ανάπτυξη ηλεκτροχημικών ανοσολογικών βιοαισθητήρων για την κάλυψη της ανάλυσης πεδίου και σημείου φροντίδας είναι ιδιαίτερα επιθυμητή. Είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι η χρήση ηλεκτροδίων μίας χρήσης με εκτύπωση οθόνης θα μπορούσε να είναι καθοριστική για αυτόν τον στόχο, συγκρίσιμο με τους βιοαισθητήρες γλυκόζης. Προκειμένου να διεξαχθούν δοκιμασίες υψηλής απόδοσης (HTS), είναι επίσης σημαντικό να δημιουργηθούν μικροσυστοιχίες αντισωμάτων με βάση την ηλεκτροχημεία.

Βιοσένσορες DNA

Υπήρξε τεράστιο επιστημονικό και τεχνολογικό ενδιαφέρον για τον εντοπισμό συμβάντων υβριδισμού του DNA. Το ταχέως αυξανόμενο ενδιαφέρον για κλινική διάγνωση με βάση τα τσιπ έχει αποδείξει ιδιαίτερα αυτή τη σημασία. Ως εκ τούτου, μια ποικιλία τεχνικών, συμπεριλαμβανομένων των οπτικών, ακουστικών και ηλεκτρονικών προσεγγίσεων, έχει αναπτυχθεί με την πάροδο των ετών. Τις προηγούμενες δεκαετίες, η ανίχνευση φθορισμού κυριάρχησε μεταξύ τους σε υπερσύγχρονες γεννήτριες. Ωστόσο, οι ηλεκτροχημικές μέθοδοι, οι οποίες έχουν αποδειχθεί αποτελεσματικές σε απλά χημικά είδη, ιδίως μεταλλικά ιόντα, έχουν προσελκύσει όλο και περισσότερο ενδιαφέρον για βιολογικά σχετικές εφαρμογές ανίχνευσης ειδών.

Τα οφέλη της ηλεκτρονικής ανίχνευσης περιλαμβάνουν: 1) η ηλεκτροχημική ανίχνευση είναι συνήθως φθηνή, καθιστώντας έτσι δυνατή την εξαιρετικά ευαίσθητη και γρήγορη εξέταση. 2) Αρκετές ηλεκτροενεργές ετικέτες, π.χ. μεταλλοκένια, είναι σταθερά και περιβαλλοντικά μη ευαίσθητα, σε αντίθεση με τα φθοροφόρα που συχνά έχουν προβλήματα “φωτο-λεύκανσης”. 3) Ο κατάλληλος μοριακός σχεδιασμός και σύνθεση που παράγει μια ποικιλία παραγώγων, το καθένα με συγκεκριμένο δυναμικό οξειδοαναγωγής, επέτρεψε την επισήμανση «πολύχρωμο». 4) Η ταχέως καθιερωμένη βιομηχανία πυριτίου άνοιξε το δρόμο για τη μαζική παραγωγή ολοκληρωμένων κυκλωμάτων, καθιστώντας την ηλεκτρονική ανίχνευση ιδιαίτερα κατάλληλη και συμβατή με τεχνολογίες που βασίζονται σε μικροσυστοιχία. 5) Η εκθετική ανάπτυξη της διεπιφανειακής επιστήμης και τεχνολογίας έχει αποκαλύψει μυστήρια στον ακριβή έλεγχο των ιδιοτήτων της επιφάνειας που αποτελούν ένα από τα βασικά εμπόδια στις βιοηλεκτρονικές εφαρμογές.

Σε μέτριες εφαρμοζόμενες τάσεις, το ίδιο το DNA είναι ηλεκτροχημικά σιωπηλό, ενώ σημαντικές παρεμβολές προβλέπονται σε υψηλές τάσεις που προκαλούν οξείδωση/μείωση των βάσεων DNA. Ο Millan ήταν ο πρώτος που πρότεινε ανιχνεύσεις στόχου επιλεκτικού DNA με βάση δείκτες ηλεκτροδραστικού υβριδισμού που παρέχουν ηλεκτρονική σήματα και διπλή και μονόκλωνη διάκριση DNA. Οι ανιχνεύσεις τύπου “σάντουιτς” προτάθηκαν σε μια προσπάθεια να μειωθεί το υψηλό υπόβαθρο που προέρχεται από τη δευτερεύουσα δέσμευση των δεικτών υβριδισμού στο ssDNA. Ένας κλώνος DNA που διαθέτει ηλεκτροενεργή ετικέτα έχει εισαχθεί για να λειτουργεί ως Ομοίως, με ανιχνευτές νανοσωματιδίων, ο Park και οι συνεργάτες του το 2002 ανέπτυξαν μια ηλεκτρική ανίχνευση DNA βασισμένη σε συστοιχία που επιδεικνύει υψηλή ευαισθησία και επιλεκτικότητα. Μια τεχνολογία βασισμένη στη σχετικά υψηλή δράση οξείδωσης της γουανίνης και της η συνεργασία με εξωγενείς οξειδοαναγωγικούς καταλύτες αναπτύχθηκε από την Thorp ένα χρόνο αργότερα. Η διάκριση των ds/ss επιτυγχάνεται από το γεγονός ότι η γουανίνη έχει σχετικά χαμηλή αντιδραστικότητα μεταφοράς ηλεκτρονίων σε διπλές όψεις, λόγω του στερικού αποτελέσματος. Στην ανίχνευση προϊόντων PCR, αυτή η μέθοδος είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη, αλλά σχετικά φτωχή σε διακρίσεις συμβάντων υβριδισμού. Επιπλέον, αυτή η μέθοδος είναι δυνατή μόνο σε επιφάνειες ITO μέχρι τώρα, επειδή το υψηλό δυναμικό οξείδωσης εξακολουθεί να αποκλείει τη χρήση χρυσού.

Παρά την πρόοδο, η ανάπτυξη ενός αισθητήρα all-in-one (δηλαδή χωρίς αντιδραστήριο) που σηματοδοτεί ειδικά τη σύλληψη στόχων εξακολουθεί να είναι πολύ σημαντική (δηλαδή, να αποφεύγεται η περαιτέρω επεξεργασία είτε με μόρια σήματος είτε με δείκτες υβριδισμού). Ένα βιώσιμο μέσο για το σκοπό αυτό παρέχεται από απταμερή DNA ή RNA. Τα απταμερή είναι καλά δομημένο DNA ή RNA που έχουν υψηλή συγγένεια και εκλεκτικότητα για συγκεκριμένους στόχους καθώς και φυσικά ένζυμα, δείχνοντας έτσι ανώτερη στιβαρότητα σε εύθραυστα ένζυμα. Ήταν ένα πολλά υποσχόμενο εργαλείο για θεραπεία και διάγνωση. Μέχρι τότε, σχεδόν για κάθε δεδομένο στόχο, η καλά ανεπτυγμένη in vitro επιλογή ήταν σε θέση να παράγει απταμερή. Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα οφέλη, τα ολιγονουκλεοτιδικά απταμερή προβλέπεται να είναι τα συστατικά βιοαισθητοποίησης της επόμενης γενιάς. Ένα εύκολο, οργανωμένο DNA που μοιάζει με φουρκέτα με ηλεκτροενεργή ετικέτα (φουρκέτα ηλεκτρονικού DNA) χρησιμοποιήθηκε από τον Fan και τους συναδέλφους ως το δομικό στοιχείο για τον καθορισμό συμβάντων υβριδισμού (Εικόνα 4).

Εικόνα 4. Κατασκευή και λειτουργία βιοαισθητήρα DNA

Το DNA που μοιάζει με φουρκέτα ήταν ένα απίστευτα συναρπαστικό απταμερές που αποτελεί τη βάση της ομοιογενούς αναγνώρισης υβριδισμού των φθορίζοντων «μοριακών φάρων». Η αλληλουχία DNA έχει σχεδιαστεί έτσι ώστε απουσία στόχων, αυτός ο «φάρος» βρίσκεται στην κοντινή κατάσταση ενώ θα «ενεργοποιηθεί» όταν φτάσει στο συγκεκριμένο γονιδιακό στόχο. Η παρουσία του σχεδιασμού του βρόχου στελέχους στη δομή προσφέρει έναν διακόπτη on/off καθώς και μια αυστηρότητα για τη διαφοροποίηση έναντι της αναντιστοιχίας υβριδισμού μεμονωμένου DNA. Ένα θειολωμένο άκρο δίνει ένα κολλώδες άκρο στη χρυσή επιφάνεια αυτής της ηλεκτρονικής φουρκέτας DNA, ενώ μια ετικέτα σιδηροκενίου μεταδίδει ηλεκτρονικά σήματα στο άλλο άκρο. Η αρχική φουρκέτα εντοπίζει το σιδηροκένιο εγγύς προς την επιφάνεια του ηλεκτροδίου, επιτρέποντας έτσι τη μεταφορά επιφανειακών ηλεκτρονίων. Μετά τον υβριδισμό, ο σχηματισμός της γραμμικής διπλής δομής διαταράσσει τη φουρκέτα και απομακρύνει το σιδηροκένιο και το ηλεκτρόδιο. Αυτή η σημαντική αλλαγή απόστασης (έως και μερικά nm) μπλοκάρει αποτελεσματικά τη διαμετακόμιση μεταφορά ηλεκτρονίων και οδηγεί στη μείωση των αντίστοιχων ηλεκτροχημικών σημάτων ρεύματος. Αυτή η στρατηγική προσφέρει την ευκαιρία να εντοπιστούν 10 στόχοι DNA pM. Το πιο σημαντικό, ένας τέτοιος σχεδιασμός εκμεταλλεύεται την ενσωμάτωση σε μια ενιαία δομή φουρκέτας περιορισμένης επιφάνειας το τμήμα σύλληψης (ακολουθία ανιχνευτή) και το τμήμα σηματοδότησης (ηλεκτροενεργά είδη). Σε αντίθεση με τους περισσότερους προηγουμένως προτεινόμενους αισθητήρες DNA στερεάς κατάστασης, αυτός ο σχεδιασμός είναι επομένως αποτελεσματικά χωρίς αντιδραστήριο, δηλαδή δεν απαιτείται εξωγενές αντιδραστήριο κατά τη διαδικασία αναγνώρισης εκτός από τους στόχους του DNA. Αυτό παρέχει τη βάση για την ανάπτυξη ενός φορητού, συνεχούς αναλυτή DNA που μπορεί να είναι χρήσιμος για ιατρικές και στρατιωτικές εφαρμογές.

Ένα μέσο για μεταφορά ηλεκτρονίων μεγάλου βεληνεκούς (ΕΤ) μέσω της στοίβαξης βάσης του προτάθηκε ως διπλή έλικα DNA. Παρόλο που αυτό το ζήτημα έχει συζητηθεί για μεγάλο χρονικό διάστημα, ο Barton και οι συνεργάτες του έχουν αποδείξει ηλεκτροχημικά ότι τα καλά προσανατολισμένα φιλμ DNA ηλεκτροδίου χρυσού επιτρέπουν τη μεταφορά ηλεκτρονίων μεγάλης εμβέλειας και ότι αυτό το ET είναι ιδιαίτερα ευαίσθητο στις διαταραχές στοίβαξης βάσεων, όπως οι αναντιστοιχίες. Διαπίστωσαν ότι οι ηλεκτροδραστικοί παρεμβολείς όπως το μπλε του μεθυλενίου (ΜΒ) θα μπορούσαν να μειωθούν αποτελεσματικά με ένα πλήρως αντιστοιχισμένο ηλεκτρόδιο με διπλή τροποποίηση DNA. Ωστόσο, η ύπαρξη μόνο μιας αναντιστοιχίας μετατρέπει το μέσο ET που μοιάζει με σύρμα σε μονωτικό, διαταράσσοντας εντελώς το ET μεταξύ του MB και του ηλεκτροδίου. Μέσω κυκλικών βολταμετρικών ή κουλομετρικών δοκιμασιών, που αποτελούν τη βάση ενός αισθητήρα ταχείας εξέτασης μετάλλαξης DNA, μια τέτοια διαφορά μπορεί να διαβαστεί εύκολα. Ο Μπάρτον και οι συνεργάτες του απέδειξαν επίσης ότι η ηλεκτροκατάλυση θα μπορούσε να βελτιώσει την ευαισθησία αυτής της στρατηγικής. Σε διάλυμα, η προσθήκη φερρικυανιδίου τραβά συνεχώς ηλεκτρόνια από ηλεκτροχημικά μειωμένη MB, ενισχύοντας τη ροή ηλεκτρονίων μέσω της διπλής έλικας του DNA. Αυτό βοηθά στην ανίχνευση ~ 108 μορίων DNA με ηλεκτρόδιο 30 μm. Έχουν επίσης αναπτύξει αισθητήρες βασισμένους στο DNA για την ανίχνευση πρωτεϊνών που δεσμεύουν το DNA παράλληλα με την ανίχνευση DNA. Ορισμένες πρωτεΐνες ή ένζυμα που δεσμεύουν το DNA πιστεύεται ότι αλληλεπιδρούν με τη στοίβαξη του ζεύγους βάσεων του DNA, μετατρέποντας τη διπλή έλικα του DNA από αποτελεσματικά σύρματα ΕΤ σε μονωτικά. Καθιέρωσαν έναν ευαίσθητο τρόπο ηλεκτρικής ανάλυσης μιας ποικιλίας πρωτεϊνών που δεσμεύουν το DNA με βάση τη συγκρίσιμη στρατηγική ανίχνευσης. Είναι σημαντικό ότι αυτοί οι αισθητήρες διακρίνουν επιτυχώς τις πρωτεΐνες που συνδέονται με το DNA, αλλά δεν διαταράσσουν τη στοίβαξη βάσεων. Αυτό σίγουρα επιβεβαιώνει ότι η διακοπή σήματος στη σύνδεση πρωτεΐνης οφείλεται στην αλλοίωση του μέσου ΕΤ που σχετίζεται με τη στοίβαξη βάσης.

Το μέλλον των κλινικών βιοαισθητήρων

Παρά την ταχεία βελτίωση στην ανάπτυξη βιοαισθητήρων, οι κλινικές εφαρμογές των βιοαισθητήρων είναι ακόμα ασυνήθιστες, με εξαίρεση το μόνιτορ γλυκόζης. Αυτό έρχεται σε άμεση αντίθεση με την κρίσιμη ανάγκη για δοκιμές σημείου φροντίδας σε μικρές κλινικές. Υποθέτουμε ότι οι παρακάτω προδιαγραφές είναι σχετικές. Πρώτον, υψηλή ευαισθησία: Η βελτίωση της ευαισθησίας είναι μια διαρκής προτεραιότητα στην ανάπτυξη βιοαισθητήρων. Είναι σαφές ότι το κριτήριο ευαισθησίας κυμαίνεται από περίπτωση σε περίπτωση. Για παράδειγμα, επειδή τα επίπεδα γλυκόζης είναι υψηλά στο αίμα, δεν χρειάζεται πολύ υψηλή ευαισθησία για την ανίχνευση γλυκόζης. Αυτό είναι βασικά μέρος του λόγου για τον οποίο οι μετρητές γλυκόζης ήταν επιτυχημένοι. Ωστόσο, σε πολλές περιπτώσεις, προκειμένου να ικανοποιηθούν οι απαιτήσεις της μοριακής διάγνωσης και της ανίχνευσης παθογόνων, είναι πολύ σημαντικό να δημιουργηθούν εξαιρετικά ευαίσθητοι βιοαισθητήρες με βέλτιστη ανίχνευση μορίων. Δεύτερον, υψηλή επιλεκτικότητα: Στην εφαρμογή βιοαισθητήρων, αυτό μπορεί να είναι ένα σημαντικό φράγμα. Οι περισσότεροι από τους βιοαισθητήρες που αναφέρονται στη βιβλιογραφία λειτουργούν πολύ καλά σε εργαστήρια, αλλά σε πραγματικά δείγματα δοκιμών, μπορούν να αντιμετωπιστούν σειριακά προβλήματα. Ως αποτέλεσμα, για να αποφευχθεί η μη ειδική απορρόφηση επιφάνειας, είναι σημαντικό να καθιερωθούν νέες προσεγγίσεις για την τροποποίηση της επιφάνειας. Τρίτον, η πολυπλεξία είναι ζωτικής σημασίας για την εξοικονόμηση χρόνου ανάλυσης, η οποία είναι ιδιαίτερα σημαντική για εργαστηριακές ή κλινικές δοκιμασίες. Είναι επομένως σημαντικό να δημιουργηθούν συστοιχίες ηλεκτροδίων υψηλής πυκνότητας καθώς και ηλεκτροχημικών οργάνων που μπορούν να διεξάγουν μεγάλο αριθμό δοκιμών ταυτόχρονα. Τέλος, για να αυξηθεί η φορητότητα, είναι απαραίτητο να δημιουργηθούν μικροαισθητοποιημένοι βιοαισθητήρες, ικανοποιώντας έτσι τις απαιτήσεις των δοκιμών πεδίου και σημείου φροντίδας. Πέμπτον, είναι σκόπιμο να ενσωματωθεί και να αυτοματοποιηθεί ιδιαίτερα ένας ιδανικός βιοαισθητήρας. Μια λύση σε αυτόν τον στόχο προσφέρεται από τις τρέχουσες τεχνολογίες εργαστηρίου σε τσιπ (μικρορευστολογία). Μπορούμε να περιμένουμε όλες αυτές τις δυνατότητες να ενσωματωθούν σε επιτυχημένους βιοαισθητήρες στο μέλλον και να εντοπίσουμε εύκολα μικρούς στόχους σε σύντομο χρονικό διάστημα.

Σχέδια για Βιοτσίπ: Σχεδιασμός & Λειτουργία

Ο όρος «βιοτσίπ» έχει λάβει διάφορες έννοιες. Οποιαδήποτε συσκευή ή συστατικό που εισάγει βιολογικά υλικά, είτε εξάγεται από βιολογικά είδη είτε συντίθεται σε εργαστήριο σε στερεό υπόστρωμα, μπορεί να θεωρηθεί βιοτσίπ με την πιο γενική έννοια. Από πρακτική άποψη, ωστόσο, τόσο οι μικρογραφίες, συνήθως σε μορφή μικροσυστοιχιών, όσο και η δυνατότητα μαζικής παραγωγής χαμηλού κόστους συχνά εμπλέκονται σε βιοτσίπ. Το ηλεκτρονικό τσιπ μύτης ή τεχνητής μύτης, η ηλεκτρονική γλώσσα, το τσιπ αλυσιδωτής αντίδρασης Πολυμεράσης, το τσιπ μικροσυστοιχιών DNA (τσιπ γονιδίων), το τσιπ πρωτεΐνης και το βιοχημικό εργαστήριο σε τσιπ είναι μερικά παραδείγματα που πληρούν αυτά τα προσόντα. Στο τσιπ γονιδίου και το τσιπ πρωτεΐνης, έχει γίνει η πιο δυναμική έρευνα βιοτσίπ.

Έχει δοθεί μεγάλη προσοχή, ιδίως, στα βιοτσίπ που ενσωματώνουν τη συμβατική βιοτεχνολογία με την επεξεργασία ημιαγωγών, τα μικροηλεκτρομηχανικά συστήματα (MEMS), την οπτικοηλεκτρονική και την απόκτηση και επεξεργασία ψηφιακού σήματος και εικόνας.

Χιλιάδες γονίδια και τα παράγωγά τους (δηλαδή, το RNA και οι πρωτεΐνες) σε έναν δεδομένο ζωντανό οργανισμό υποτίθεται ότι ενεργούν με περίπλοκο και συντονισμένο τρόπο που δημιουργεί το μυστήριο της ζωής. Ωστόσο, οι παραδοσιακές μέθοδοι στη μοριακή βιολογία συνήθως λειτουργούν με βάση “ένα γονίδιο σε ένα πείραμα”, το οποίο υποθέτει ότι η απόδοση είναι πολύ περιορισμένη και είναι δύσκολο να επιτευχθεί η “συνολική εικόνα” της γονιδιακής λειτουργίας. Μια νέα τεχνολογία, που ονομάζεται μικροσυστοιχία DNA, έχει κερδίσει μεγάλη προσοχή μεταξύ των βιολόγων τις τελευταίες δεκαετίες. Αυτή η τεχνολογία στοχεύει στη μέτρηση ολόκληρου του γονιδιώματος σε ένα μόνο τσιπ, έτσι ώστε, εν τω μεταξύ, οι ερευνητές να μπορούν να έχουν καλύτερη εικόνα των αλληλεπιδράσεων μεταξύ χιλιάδων γονιδίων.

Ένα γονίδιο ή ένα τσιπ DNA αντιστοιχεί σε μια δισδιάστατη σειρά μικρών κυττάρων αντίδρασης (100 x 100 μm το καθένα) που παράγονται χρησιμοποιώντας ρομποτική υψηλής ταχύτητας σε ένα στερεό υπόστρωμα. Μια γκοφρέτα πυριτίου, ένα λεπτό φύλλο γυαλιού, πλαστικού ή μια νάιλον μεμβράνη θα μπορούσαν να είναι το στερεό υπόστρωμα. Τρισεκατομμύρια πολυμερικά μόρια από μια συγκεκριμένη αλληλουχία θραυσμάτων DNA μονόκλωνου ακινητοποιούνται σε κάθε κύτταρο αντίδρασης (Εικόνα 5).

Εικόνα 5. Μια σχηματική απεικόνιση ενός τσιπ γονιδίων

Τα θραύσματα DNA μπορεί να είναι είτε σύντομες (περίπου 20 έως 25) ακολουθίες βάσεων (Α, Τ, G και C) είτε μεγαλύτερες συμπληρωματικές αλυσίδες DNA (cDNA). Σε κάθε κελί, η μοναδική ακολουθία βάσεων (π.χ. CTATGC …) προεπιλέγεται ή διαμορφώνεται ανάλογα με την αναμενόμενη χρήση. Οι ανιχνευτές ονομάζονται επίσης αναγνωρισμένες αλληλουχίες τεμαχίων DNA μονόκλωνου ακινητοποιημένου στο υπόστρωμα. Θραύσματα διπλού κλώνου DNA σχηματίζονται όταν άγνωστα θραύσματα δειγμάτων μονόκλωνου DNA, που ονομάζονται στόχος, αντιδρούν (ή υβριδοποιούνται) με τους ανιχνευτές στο τσιπ, όπου ο στόχος και ο ανιχνευτής είναι συμπληρωματικοί σύμφωνα με τον κανόνα σύζευξης βάσεων (Α με Τ, και Ζ σε συνδυασμό με Γ). Τα δείγματα-στόχοι επισημαίνονται συχνά με ετικέτες, όπως φθορίζοντα, βαφές ή μόρια ραδιοϊσοτόπων, για να διευκολύνουν τη διάγνωση ή την ανάλυση του υβριδοποιημένου τσιπ. Καθένα φέρει τη δική του διακριτή ετικέτα όταν οι στόχοι περιέχουν περισσότερους από έναν τύπους δείγματος. Αυτός ο τύπος τσιπ μικροσυστοιχιών DNA παρέχει μια πλατφόρμα όπου, με βάση το μέγεθος της συστοιχίας, ο άγνωστος στόχος ή οι στόχοι μπορούν θεωρητικά να οριστούν με πολύ υψηλή ταχύτητα και υψηλή απόδοση, αντιστοιχίζοντας τα συστατικά που εμπλέκονται στην έρευνα και την ανάπτυξη της τεχνολογίας βιοτσίπ με δεκάδες χιλιάδες διαφορετικοί τύποι ανιχνευτών μέσω υβριδισμού παράλληλα, και οι σχετικοί τεχνικοί κλάδοι φαίνονται στην Εικόνα 6. Βασικά, η τεχνολογία βιοχαρτών είναι διεπιστημονική. Είναι σημαντικό οι επιστήμονες και οι μηχανικοί από διαφορετικούς κλάδους να συνεργάζονται για να ωθήσουν αυτή τη νέα τεχνολογία από το εργαστηριακό ενδιαφέρον σε πρακτικές συσκευές και συστήματα.

Εικόνα 6. Τα συστατικά στοιχεία και οι σχετικοί τεχνικοί κλάδοι που εμπλέκονται στην έρευνα & ανάπτυξη της τεχνολογίας βιοτσίπ

Μικροσυστοιχία DNA

Όσον αφορά την ιδιότητα της συστοιχίας αλληλουχίας DNA γνωστής ταυτότητας, υπάρχουν δύο παραλλαγές της τεχνολογίας μικροσυστοιχιών DNA:

Τύπος Ι: Το cDNA ανιχνευτή (μήκους 500 ~ 5.000 βάσεων) ακινητοποιείται χρησιμοποιώντας κηλίδες ρομπότ σε μια στερεή επιφάνεια όπως το γυαλί και εκτίθεται είτε ξεχωριστά είτε σε μίγμα σε ένα σύνολο στόχων. Αυτή η στρατηγική, «παραδοσιακά» αναφέρεται ως μικροσυστοιχία DNA, είναι σε μεγάλο βαθμό γνωστό ότι αναπτύχθηκε στο Πανεπιστήμιο του Στάνφορντ.

Τύπος II: in situ (on-chip) ή με συμβατική σύνθεση που συνοδεύεται από ακινητοποίηση on-chip, συντίθεται μια σειρά ανιχνευτών ολιγονουκλεοτιδίου (20 ~ 80-μερών ολιγο) ή πεπτιδικού νουκλεϊκού οξέος (PNA). Ο πίνακας εκτίθεται σε υβριδισμένο, επισημασμένο δείγμα DNA και καθορίζει την ταυτότητα/αφθονία συμπληρωματικών αλληλουχιών. Αυτή η μέθοδος, που ονομάζεται «ιστορικά» τσιπ DNA, καθιερώθηκε στην Affymetrix INC., η οποία πωλεί τα φωτολιθογραφικά κατασκευασμένα προϊόντα της με το εμπορικό σήμα Genechip. Τα τσιπ με βάση τα ολιγονουκλεοτίδια αναπτύσσονται από πολλές εταιρείες χρησιμοποιώντας εναλλακτικές τεχνολογίες σύνθεσης ή εναπόθεσης επί τόπου.

Ανάλογα με τον τύπο του μορίου που έχει ακινητοποιηθεί, το βιοτσίπ κατασκευάζεται κυρίως σε δύο μορφές. Οι συστοιχίες CDNA αναφέρονται επίσης ως βιοτσίπ που περιέχουν προϊόντα PCR 200 ζευγών βάσεων σε μέγεθος 2ΚΒ ακινητοποιημένα κατά μήκος του μορίου με ομοιοπολική διασταύρωση με την επιφάνεια της συστοιχίας. Εναλλακτικά, ολιγονουκλεοτιδικοί ανιχνευτές μπορεί είτε να συντίθενται επί τόπου στη συστοιχία, είτε να ορίζονται ομοιοπολικοί σύνδεσμοι προς τα άκρα με προ-συνθετικούς ολίγους. Η μηχανική Genechip περιλαμβάνει πολλά διαφορετικά μέρη, όπως κατασκευή, προετοιμασία δείγματος και υβριδοποίηση της ακολουθίας στόχου, ανίχνευση αποτελεσμάτων υβριδισμού, σχεδιασμός του ανιχνευτή ολιγονουκλεοτιδίου και ανάλυση εικόνας υβριδισμού και διάφορες εφαρμογές, όπως φαίνεται στην Εικόνα 7.

Εικόνα 7. Αρκετές σημαντικές πτυχές που σχετίζονται με την τεχνολογία Genechip

Πρώτον, σύμφωνα με έναν συγκεκριμένο στόχο, πολλές σχετικές αλληλουχίες γονιδίων θα επιλεγούν από τη βάση δεδομένων DNA (μονός νουκλεϊκός πολυμορφισμός για συγκεκριμένα γονίδια, διαφορική έκφραση για μια δεδομένη ομάδα γονιδίων ή αναγνώριση μετάλλαξης). Καθορίζοντας την αλληλουχία και το μήκος κάθε ανιχνευτή και την ακριβή θέση του στο τσιπ, θα σχεδιαστεί μια σειρά μοναδικών ολιγονουκλεοτιδικών ανιχνευτών με βάση τις επιλεγμένες αλληλουχίες. Με τη μέθοδο κηλίδωσης ή τη σύνθεση επί του τσιπ, μπορεί να πραγματοποιηθεί η σύνθεση της μικροσυστοιχίας DNA. Τα γονίδια -στόχοι είναι συνήθως απαραίτητα για να ενισχυθεί και να επισημανθεί ο φθορισμός. Επιλογή των κατάλληλων πρώτων PCR, βελτιστοποίηση των συνθηκών ενίσχυσης και υβριδισμού θα χρειαστεί στις περισσότερες περιπτώσεις. Για τα αποτελέσματα του υβριδισμού υπάρχουν πολλές διαφορετικές στρατηγικές ανίχνευσης. Μια παραδοσιακή προσέγγιση είναι η ανίχνευση φθορισμού. Για την επεξεργασία μιας τόσο μεγάλης ποσότητας που λαμβάνεται από ένα γενικό τσιπ, απαιτείται ανάλυση δεδομένων με βάση τις φθορίζουσες εικόνες και τη διαμόρφωση της βάσης δεδομένων. Η χρήση προϊόντων PCR που αντιστοιχούν στα γονίδια ως μόρια ανιχνευτή είναι μια κοινή πλατφόρμα για την παρασκευή μικροσυστοιχιών. Βιολογικές πηγές βιβλιοθηκών cDNA προσφέρουν ένα αποτελεσματικό πρότυπο για την ενίσχυση PCR των ανιχνευτών. Αυτή η πλατφόρμα αναφέρεται επομένως ως συστοιχίες cDNA.

Η χρήση ολιγονουκλεοτιδικών ανιχνευτών αντί για προϊόντα PCR έχει πολλά οφέλη. Πρώτον, έχουν συνήθως παρόμοιο μήκος και μπορούν να δημιουργηθούν με τέτοιο τρόπο ώστε να έχουν παρόμοιες ιδιότητες υβριδισμού. Δεύτερον, μπορούν να διαμορφωθούν ώστε να υβριδοποιούνται έναντι της συγκεκριμένης περιοχής γονιδίου. Το προϊόν PCR επιτρέπει επίσης τη διασταυρούμενη υβριδοποίηση μεταξύ ομόλογων γονιδίων που ενοχλούν τα μέλη του προφίλ γονιδιακής έκφρασης της ίδιας γονιδιακής οικογένειας. Επιπλέον, η ανάγκη για ενίσχυση PCR των μορίων ανιχνευτή εξαλείφεται από συστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων και μειώνει τον κίνδυνο σφάλματος λόγω χειρισμού κλώνων και μόλυνσης κατά τη μεταφορά.

Μικρορευστό τσιπ

Τις τελευταίες δεκαετίες, η μικρορευστολογική τεχνολογία έχει αναπτυχθεί γρήγορα και παρέχει πολυάριθμες εφαρμογές στις επιστήμες της ζωής. Χάρη στα ξεχωριστά οφέλη που προσφέρει η μικρογραφία του συστήματος, προέκυψε η επανάσταση των μικρορευστών, συμπεριλαμβανομένης της υψηλής αναλυτικής απόδοσης, της αυξημένης ευαισθησίας, της βελτιωμένης αναλυτικής απόδοσης, της γρήγορης παραλληλοποίησης πολυπλεξίας, της ικανότητας διαχείρισης και επεξεργασίας μειωμένων όγκων αντιδραστηρίων και δραματικά μειωμένων αποτυπωμάτων οργάνων.

Τα μικρορευστά θα μπορούσαν ταυτόχρονα να προσφέρουν αναλυτική απόδοση και υψηλή ικανότητα απόδοσης ως τεχνολογία μικρογραφίας, χωρίς την έλλειψη ακρίβειας και αυτοματισμού. Η τεχνολογία μικρορευστοποίησης δεν είναι μόνο ένα ισχυρό εργαλείο για τον γρήγορο έλεγχο και τη μελέτη της ανάπτυξης φαρμάκων κατά τη διαδικασία εφαρμογής του φαρμάκου, αλλά και για τις μικροσκοπικές συσκευές της που μειώνουν το κόστος και την κατανάλωση αντιδραστηρίων.

Έχει σημειωθεί σημαντική πρόοδος στην ανάπτυξη εξαρτημάτων και συστημάτων ελέγχου φαρμάκων που βασίζονται σε μικρορευστά τα τελευταία χρόνια. Για τον έλεγχο φαρμάκων, χρησιμοποιούνται διαφορετικοί τύποι μικρορευστοποιημένων τσιπ για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας του ελέγχου και τη μείωση του κόστους. Αρκετοί συνήθεις τύποι τεχνολογίας τσιπ περιγράφονται στις ακόλουθες παραγράφους.

Εικόνα 8. Εφαρμογή μικρορευστοποιημένου τσιπ στον έλεγχο φαρμάκων.

Μικρορευστικά σταγονιδίων – Για να πραγματοποιηθούν πειράματα σε συνεχή ή τμηματική ροή, η μικρορευστολογική τεχνολογία σταγονιδίων χρησιμοποιεί σταγονίδια υγρού διαμερισμένα από ένα μη αναμίξιμο ρευστό ως νανολίτρο στα χωριστά δοχεία αντίδρασης. Τέτοιες μέθοδοι δείχνουν σημαντικά πλεονεκτήματα, όπως μειωμένη χρήση δείγματος, βελτιωμένη ταχύτητα αντίδρασης και αυξημένη απόδοση και αναπαραγωγιμότητα, χειρισμός απίστευτα μικρών όγκων με ισχυρό έλεγχο σύνθεσης.

Με βάση την διαδοχική τεχνική της σειράς σταγονιδίων, οι μικρορευστικές μέθοδοι σταγονιδίων μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον έλεγχο συνδυασμού φαρμάκων (Εικόνα 8Α), για τον έλεγχο διαφόρων συνδυασμών δοσολογίας και μήκη χορήγησης και για τη βελτίωση του βέλτιστου σχήματος δοσολογίας ελάχιστης κατανάλωσης που είναι σημαντικό για καταστάσεις συνδυασμένων ασθενειών.

Όργανο σε τσιπ-Η λεπτομερής ρύθμιση της δομής και της ροής μικροκλίμακας καθιστά δυνατή την ακριβή μοντελοποίηση των δομών μικροκλίμακας του ιστού του οργάνου. Τα όργανα στα τσιπ είναι βιομιμητικά συστήματα που είναι μικρο-κατασκευασμένα και αντιπροσωπεύουν βασικές λειτουργικές μονάδες ζωντανών ανθρώπινων οργάνων. Οι λειτουργίες πολλών οργάνων και ιστών, όπως το ήπαρ, τα νεφρά, οι πνεύμονες και τα έντερα, έχουν αναπαραχθεί ως μοντέλα in vitro μέχρι σήμερα. Αυτά τα συστήματα θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως μοντέλα in vitro που επιτρέπουν την προσομοίωση και τη φαρμακολογικά διαμόρφωση σύνθετων βιολογικών διεργασιών.

Το τσιπ οργάνων προσομοιώνει τις βασικές διαδικασίες του ανθρώπινου σώματος, χρησιμοποιώντας έναν αριθμό κυττάρων για να δημιουργήσει ένα βιομιμητικό τσιπ με παρόμοιες φυσιολογικές λειτουργίες στη μοναδική δομή του τσιπ, το οποίο είναι συγκρίσιμο με το πραγματικό εξωτερικό περιβάλλον της νόσου από το τυπικό μοντέλο καλλιέργειας ενός κυττάρου.

Προκειμένου να αναπαραχθεί η περίπλοκη μικροαρχιτεκτονική του καρκινικού ιστού, έχει δημιουργηθεί ένα μικροσύστημα που επιτρέπει τη συν-καλλιέργεια σφαιροειδών όγκων του μαστού με γειτονικά κύτταρα σε ένα διαμερισμένο τρισδιάστατο μικρορευστό σύστημα που βοηθά στη δημιουργία της πλατφόρμας ανίχνευσης φαρμάκων κατά του καρκίνου του μαστού (Εικόνα 8Β). Για τη μελέτη της μετανάστευσης καρκινικών κυττάρων και της ανίχνευσης αντικαρκινικών φαρμάκων, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί η συν-καλλιέργεια πολλών ιστών με ένα μικρορευστό σύστημα.

Άλλα μικρορευστοποιημένα τσιπ για διαλογή φαρμάκων-Υπάρχουν πολλές άλλες τεχνολογίες που εφαρμόζονται σε μικρορευστοποιημένα τσιπ για τον έλεγχο φαρμάκων, εκτός από τις προαναφερθείσες υπάρχουσες μεθόδους, οι οποίες επεκτείνουν τις ιδέες των ερευνητών. Η πιο σημαντική και ολοκληρωμένη πτυχή της ανάπτυξης φαρμάκων στις περισσότερες φαρμακευτικές και διάφορες βιοτεχνολογικές βιομηχανίες σε όλο τον κόσμο ήταν ένα εξαιρετικό σύστημα HTDS.

Με τη χρήση συστημάτων μικρορευστοειδούς συστοιχίας ανοικτής πρόσβασης και τσιπ μικροσυστοιχιών κυττάρων, μπορούν να ελεγχθούν διάφορες συγκεντρώσεις και συνδυασμοί φαρμάκων. Διάφορες διαμορφώσεις και συστοιχίες μικρών θαλάμων καλλιέργειας μπορεί να δημιουργηθούν από τον διαφορετικό σχεδιασμό του τσιπ. Οι γεννήτριες κλίσης συγκέντρωσης μπορούν να παρέχουν μια αποτελεσματική κλίση υγρής συγκέντρωσης και αυτές οι συσκευές έχουν εφαρμοστεί και συνδυαστεί με μικρορευστολογικές τεχνολογίες από διάφορες ερευνητικές ομάδες για τη βελτιστοποίηση των συστημάτων HTDS. Οι διαχυτικοί μικρορευστοποιητές στο Σχήμα 8C θα μπορούσαν επίσης να αναγνωρίσουν ένα πλήρως αυτόματο HTDS.

Οι πλατφόρμες κυτταρικών συστοιχιών κατασκευάζονται χρησιμοποιώντας υλικό πολυδιμεθυλοσιλοξανίου (PDMS) σε ορισμένα μικρορευστικά κανάλια για διαλογή φαρμάκων. Η δομή των τσιπς, όμως, είναι δύσκολη και έχει κάποια μειονεκτήματα, όπως ακριβά καλούπια πυριτίου και βιομοριακή απορρόφηση. Ως φυσική εξωκυτταρική μήτρα (ECM), η υδρογέλη πολυ (αιθυλενογλυκόλης) διακρυλικής (PEGDA) έχει πανομοιότυπες μηχανικές ιδιότητες και περιεκτικότητα σε νερό. Οι μικρορευστές υδρογέλες PEGDA έχουν χρησιμοποιηθεί συνήθως για την ενθυλάκωση των κυττάρων και είναι διαπερατές σε ενώσεις όπως το νερό, τα βιομόρια και τα χημικά. Προκειμένου να ερευνηθεί η συνδυαστική θεραπευτική επίδραση δύο φαρμάκων, χρησιμοποιήθηκαν μικρορευστικές συσκευές κατασκευασμένες από αυτούς τους τύπους υλικών και σε συνδυασμό με τεχνολογίες τρισδιάστατης καλλιέργειας εγκεφαλικών κυττάρων (Εικόνα 8D).

Η γοητεία του μικρορευστού τσιπ είναι ότι για να εκτελεί διάφορες λειτουργίες, μπορεί να έχει πολλαπλές σχεδιασμένες δομές και μπορεί να συνδυαστεί για να επεκτείνει το εύρος εφαρμογής του με διαφορετικές συσκευές και εξοπλισμό δοκιμών. Ωστόσο, απαιτούνται σημαντικές προσπάθειες σχεδιασμού, κατασκευής και βελτιστοποίησης. Κάθε μοντέλο έχει τα δικά του μοναδικά χαρακτηριστικά. Χρησιμοποιείται όχι μόνο για τον έλεγχο φαρμάκων, αλλά και για τη δοκιμή φαρμάκων.

Μικροσυστοιχία πρωτεϊνών

Στην έρευνα των πρωτεϊνών, οι μικροσυστοιχίες πρωτεϊνών είναι χρήσιμα εργαλεία με αμερόληπτο τρόπο, υψηλής απόδοσης, καθώς επιτρέπουν παράλληλα να χαρακτηρίζονται έως και χιλιάδες ξεχωριστά καθαρισμένες πρωτεΐνες. Η προσαρμοστικότητα αυτής της τεχνολογίας κατέστησε δυνατή τη χρήση σε ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών, συμπεριλαμβανομένης της μελέτης των μοριακών αλληλεπιδράσεων σε επίπεδο πρωτεώματος, της ανάλυσης μετα-μεταφραστικών αλλαγών, της ανακάλυψης νέων στόχων φαρμάκων και της αξιολόγησης των αλληλεπιδράσεων παθογόνου-ξενιστή. Επιπλέον η τεχνολογία έχει ήδη αποδειχθεί ότι είναι αποτελεσματική στη διαμόρφωση της ιδιαιτερότητας των αντισωμάτων καθώς και στον εντοπισμό νέων βιοδεικτών για αυτοάνοσα νοσήματα και καρκίνους ειδικότερα.

Οι πρωτεΐνες είναι πολύπλοκα βιομόρια με μεγάλο φάσμα δομών και λειτουργιών και ως εκ τούτου, η μελέτη τους με τρόπο υψηλής απόδοσης αποτελεί πρόκληση. Υπάρχουν τρεις βασικοί τύποι μικροσυστοιχιών πρωτεϊνών: λειτουργική, αναλυτική και αντίστροφη φάση. Οι λειτουργικές μικροσυστοιχίες πρωτεϊνών συναρμολογούνται με υψηλό τρόπο με πρωτεΐνες καθαρισμένες/συντεθειμένες, επιτρέποντας σε εκατοντάδες και ακόμη και χιλιάδες διαφορετικές πρωτεΐνες να εξεταστούν παράλληλα με τις βιοχημικές τους ιδιότητες. Προκειμένου να ανιχνευθούν ή να μετρηθούν σύνθετα βιολογικά δείγματα, οι αναλυτικές μικροσυστοιχίες πρωτεΐνης χρησιμοποιούν αντιδραστήρια συγγένειας ακινητοποιημένα στη συστοιχία. Τέλος, σύνθετα βιολογικά δείγματα ακινητοποιημένα στη συστοιχία χρησιμοποιούνται από μικροσυστοιχίες πρωτεΐνης αντίστροφης φάσης που χρησιμοποιούν αντιδραστήρια συγγένειας για αναγνώριση.

Οι λειτουργικές μικροσυστοιχίες πρωτεϊνών είναι πιο ικανές να εντοπίσουν αδύναμες αλληλεπιδράσεις, πιο ευέλικτες για πρωτεΐνες χαμηλής αφθονίας και πιο ικανές να αναλύσουν ακατέργαστα δείγματα όπως ορός, σε σύγκριση με άλλες μεθόδους, όπως η φασματομετρία μάζας. Όσον αφορά τις διαφορές στην κάλυψη πρωτεϊνών, τα μήκη πρωτεΐνης και τους αγωγούς παραγωγής, αρκετοί διαφορετικοί τύποι λειτουργικών μικροσυστοιχιών πρωτεϊνών έχουν παραχθεί μέχρι σήμερα.

Ανάπτυξη της Μικροσυστοιχίας Λειτουργικής Πρωτεΐνης – Το σύνολο των πρωτεϊνών που μπορούν να εκφραστούν από ένα γονιδίωμα είναι το πρωτέωμα. Συνήθως, η δημιουργία μιας καθαρισμένης μικροσυστοιχίας πρωτεϊνών απαιτεί τη συναρμολόγηση ενός συνόλου ανοικτών πλαισίων ανάγνωσης (ORF) που κλωνοποιούνται σε έναν φορέα έκφρασης, κωδικοποιημένη έκφραση πρωτεΐνης σε κύτταρα, εξατομικευμένο καθαρισμό πρωτεϊνών υψηλής απόδοσης και ακινητοποίηση πρωτεϊνών σε μικροσυστοιχία Το

Εφαρμογή μικροσυστοιχιών πρωτεϊνών ζυμομυκήτων-Για τη δημιουργία προφίλ μοριακών αλληλεπιδράσεων σε ολόκληρο το πρωτεώμα, οι λειτουργικές μικροσυστοιχίες πρωτεϊνών, ειδικά οι καθαρισμένες μικροσυστοιχίες πρωτεϊνών, είναι χρήσιμες και επιτρέπουν λεπτομερή, αμερόληπτο έλεγχο. Οι ερευνητές έχουν χρησιμοποιήσει μικροσυστοιχίες πρωτεΐνης σε θεμελιώδη έρευνα για να μελετήσουν αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-λιπιδίων, αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-DNA, πρωτεΐνη-κύτταρο/λύματα, σύνδεση μικρών μορίων, αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-RNA και PTMs, όπως ακετυλίωση, SUMOylation, γλυκοζυλίωση, πανταχού παρούσα, φωσφορυλίωση και μεθυλίωση (Εικόνα 9Α-9G). Συνοψίζουμε αντιπροσωπευτικές μελέτες στον Πίνακα Ι με βάση τις εφαρμογές έρευνας που φαίνονται στην Εικόνα 9.

Εικόνα 9. Εφαρμογή Μικροσυστοιχιών Λειτουργικής Πρωτεΐνης

Εφαρμογές βιοτσίπ

Οι πιο αναδυόμενες εφαρμογές βιοτσίπ περιλαμβάνονται στον Πίνακα 1.


Βιοτσίπ στα τρόφιμα	Βιοτσίπ που ανιχνεύει γενετικά τροποποιημένους οργανισμούς (gmo’s) στα τρόφιμα.
Διαγνωστικά βιοτσίπ	Βιοτσίπ DNA που φέρνει επανάσταση στον τρόπο με τον οποίο το ιατρικό επάγγελμα εκτελεί εξετάσεις στο αίμα.
Βιοτσίπ στην επιδημία φυματίωσης	Η τεχνολογία βιοτσίπ αναμένεται να βοηθήσει στην καταπολέμηση της νέας ποικιλίας ανθεκτικών στα φάρμακα στελεχών της νόσου.
Βιοτσίπ στον καρκίνο	Η τεχνολογία τσιπ βιοσένσορα παρέχει γρήγορη και εύκολη πρόσβαση σε κρίσιμες πληροφορίες σχετικά με τη βλάβη του DNA από ενώσεις που παράγουν καρκίνο και βοηθά στην έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου του παχέος εντέρου.
Βιοτσίπ στην ανάπτυξη φαρμάκων	Τσιπ DNA που βρίσκει γενετικές διαφορές μεταξύ των ατόμων που ανταποκρίνονται σε ένα φάρμακο και εκείνων που δεν το κάνουν, ξεκινώντας από τη Φάση ΙΙ ή από το μεσαίο στάδιο, κλινικές δοκιμές.

Βιβλιογραφικές αναφορές

Adams DA, Brus L, Chidsey CED, et al. 2003. Charge transfer on the nanoscale: current status. J Phys Chem B, 107: 6668-97.
Ashley GW, Henise J, Reid R, et al. 2013. Hydrogel drug delivery system with predictable and tunable drug release and degradation rates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110: 2318–2323.
Bard AJ, Faulkner LR. 2001. Electrochemical Methods. New York: John W Willey & Sons.
Benson DE, Conrad DW, de Lorimier RM, et al. 2001. Design of bioelectronic interfaces by exploiting hinge-bending motions in proteins. Science, 293:1641–4.
Boon EM, Ceres DM, Drummond TG, et al. 2000. Mutation detection by electrocatalysis at DNA-modified electrodes. Nature Biotech, 18:1096–100.
Boon EM, Livingston AL, Chmiel NH, et al. 2003. DNA-mediated charge transport for DNA repair. Proc Natl Acad Sci U S A, 100:12543–7.
Boon EM, Salas JE, Barton JK. 2002. An electrical probe of protein-DNA interactions on DNA-modiﬁed surfaces. Nat Biotechnol, 20:282-6.
Brazill SA, Kim PH, Kuhr WG. 2001. Capillary gel electrophoresis with sinusoidal voltammetric detection: A strategy to allow four-“color” DNA sequencing. Anal Chem, 73:4882–90.
Burgstaller P, Girod A, Blind M. 2002. Aptamers as tools for target prioritization and lead identification. Drug Discov Today, 7:1221–8.
Choi Y, Hyun E, Seo J, et al. 2015. A microengineered pathophysiological model of early-stage breast cancer. Lab Chip, 15: 3350–3357.
Cooper MA, Dultsev FN, Minson T, et al. 2001. Direct and sensitive detection of a human virus by rupture event scanning. Nature Biotechnol, 19:833–7.
Dai Z, Yan F, Yu H, et al. 2004. Novel amperometric immunosensor for rapid separation-free immunoassay of carcinoembryonic antigen. J Immuno Methods, 287:13–20.
Das, H.K. 2005. “Functional Gernomics using Microarrays Technology.” Text book of Biotechnology, pp .1276-1288, Wiley Dreamtech Publisher.
Drummond TG, Hill MG, Barton JK. 2003. Electrochemical DNA sensors. Nat Biotechnol, 21:1192–9.
Fan C, Plaxco KW, Heeger AJ. 2003. Electrochemical interrogation of conformational changes as a reagentless method for the sequence-speciﬁc detection of picomolar DNA. Proc Natl Acad Sci U S A, 100:9134–7.
Fan C, Plaxco KW, Heeger AJ. 2005. Biosensors based on binding-modulated donor-acceptor distances. Trends Biotechnol, 23:186–92.
Fan Y, Nguyen DT, Akay Y, et al. 2016. Engineering a brain cancer chip for high-throughput drug screening. Sci. Rep., 6: 25062.
Fritz J, Cooper EB, Gaudet S, et al. 2002. Electronic detection of DNA by its intrinsic molecular charge. Proc Natl Acad Sci U S A, 99:14142–6.
Gao Z, Binyamin G, Kim H-H, et al. 2002. Electrodeposition of redox polymers and co-electrodeposition of enzymes by coordinative crosslinking. Angew Chem Int Ed, 41:810–13.
Gaylord BS, Heeger AJ, Bazan GC. 2002. DNA detection using watersoluble conjugated polymers and peptide nucleic acid probes. Proc Nat Acad Sci U S A, 99:10954.
Grifﬁths AD, Tawﬁk DS. 2000. Man-made enzymes – from design to in vitro compartmentalisation. Curr Opin Biotech, 11:338–53.
Heeger AJ. 2000. Nobel Lecture: Semiconducting and Metallic polymers: The fourth generation of polymeric materials [online]. URL: http:// wwwnobelse.
Hook F, Ray A, Norden B, et al. 2001. Characterization of PNA and DNA immobilization and subsequent hybridization with DNA using acoustic- shear-wave attenuation measurements. Langmuir, 17:8305–12.
Hsiung LC, Chiang CL, Wang CH, et al. 2011. Dielectrophoresis-based cellular microarray chip for anticancer drug screening in perfusion microenvironments. Lab Chip, 11: 2333–2342.
Li Z, Su W, Zhu Y, et al. 2017. Drug absorption related nephrotoxicity assessment on an intestine-kidney chip. Biomicrofluidics, 11: 034114.
Lin D, Li P, Lin J, et al. 2017. Orthogonal screening of anticancer drugs using an open-access microfluidic tissue array system. Anal. Chem., 89: 11976–11984.
Liu J, Zhang Y, Jiang M, et al. 2017. Electrochemical microfluidic chip based on molecular imprinting technique applied for therapeutic drug monitoring. Biosens. Bioelectron., 91: 714–720.
Moore CD, Ajala O.Z, Zhu H. 2016. Applications in high-content functional protein microarrays. Curr. Opin. Chem. Biol., 30: 21–27.
Palecek E, Jelen F. 2002. Electrochemistry of nucleic acids and development of DNA sensors. Crit Rev Anal Chem, 32:261–70.
Palecek E. 2004. Surface-attached molecular beacons light the way for DNA sequencing. Trends Biotechnol, 22:55–8.
Park SJ, Taton TA and Mirkin CA. 2002. Array-based electrical detection of DNA with nanoparticle probes. Science, 295:1503–6.
Patolsky F, Lichtenstein A, Willner I. 2001. Detection of single-base DNA mutations by enzyme-ampliﬁed electronic transduction. Nature Biotech, 19:253–7.
Patolsky F, Weizmann Y, Wilner I. 2004. Long-range electrical contacting of redox enzymes by SWCNT connectors. Angew Chem Int Ed, 43:2113–17.
S. Mi, Z. Du, Y. Xu, et al. 2016. Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening. Sci. Rep., 6: 35544.
Schuster GB. 2000. Long-range charge transfer in DNA: transient structural distortions control the distance dependence. Acc Chem Res, 33:253-60. Sullivan CKO. 2002. Aptasensors–the future of biosensing? Anal Bioanal Chem, 372:44–8.
Stone HA, Stroock AD, Ajdari A. 2004. Engineering ﬂows in small devices: microﬂuidics toward a lab-on-a-chip. Annu. Rev. Fluid Mech., 36: 381–411.
Sugiura S, Hattori K, Kanamori T. 2010. Microfluidic serial dilution cell-based assay for analyzing drug dose response over a wide concentration range. Anal. Chem., 82: 8278–8282.
Taton TA, Mirkin CA, Letsinger RL. 2000. Scanometric DNA array detection with nanoparticle probes. Science, 289:1757–60.
Thorp HH. 2003. Reagentless detection of DNA sequences on chemically modiﬁed electrodes. Trends Biotechnol, 21:522–4.
Umek RM, Lin SW, Vielmetter J, et al. 2001. Electronic detection of nucleic acids–A versatile platform for molecular diagnostics. J Mol Diag, 3:74–84.
Van Hove AH, Antonienko E, Burke K, et al. 2015. Temporally tunable, enzymatically responsive delivery of proangiogenic peptides from poly (ethylene glycol) hydrogels. Adv. Healthc. Mater., 4: 2002–2011.
Whitesides GM, Grzybowski B. 2002. Self-assembly at all scales. Science, 295:2418–21.
Willner I. 2002. Biomaterials for sensors, fuel cells, and circuitry. Science, 298:2407.
Wosnick JH, Swager TM. 2000. Molecular photonic and electronic circuitry for ultra-sensitive chemical sensors. Curr Opin Chem Biol, 4:715–20.
Xiao Y, Patolsky F, Katz E, et al. 2003. Plugging into enzymes: nanowiring of redox enzymes by a gold nanoparticle. Science, 299:1877–81.
Xu H, Wu H, Huang F, et al. 2005. Magnetically assisted DNA assays: High selectivity using conjugated polymers for ampliﬁed ﬂuorescent transduction. Nucleic Acids Res, 33:e83.
Yu CJ, Wan YJ, Yowanto H, et al. 2001. Electronic detection of single-base mismatches in DNA with ferrocene-modiﬁed probes. J Am Chem Soc, 123:11155–61.
Yu X, Kim SN, Papadimitrakopoulos F, et al. 2005. Protein immunosen- sor using single-wall carbon nanotube forests with electrochemical detection of enzyme labels. Mol Biosyst, 1:70–8.

Adams DA, Brus L, Chidsey CED, et al. 2003. Charge transfer on the nanoscale: current status. J Phys Chem B, 107: 6668-97.
Ashley GW, Henise J, Reid R, et al. 2013. Hydrogel drug delivery system with predictable and tunable drug release and degradation rates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110: 2318–2323.
Bard AJ, Faulkner LR. 2001. Electrochemical Methods. New York: John W Willey & Sons.
Benson DE, Conrad DW, de Lorimier RM, et al. 2001. Design of bioelectronic interfaces by exploiting hinge-bending motions in proteins. Science, 293:1641–4.
Boon EM, Ceres DM, Drummond TG, et al. 2000. Mutation detection by electrocatalysis at DNA-modified electrodes. Nature Biotech, 18:1096–100.
Boon EM, Livingston AL, Chmiel NH, et al. 2003. DNA-mediated charge transport for DNA repair. Proc Natl Acad Sci U S A, 100:12543–7.
Boon EM, Salas JE, Barton JK. 2002. An electrical probe of protein-DNA interactions on DNA-modiﬁed surfaces. Nat Biotechnol, 20:282-6.
Brazill SA, Kim PH, Kuhr WG. 2001. Capillary gel electrophoresis with sinusoidal voltammetric detection: A strategy to allow four-“color” DNA sequencing. Anal Chem, 73:4882–90.
Burgstaller P, Girod A, Blind M. 2002. Aptamers as tools for target prioritization and lead identification. Drug Discov Today, 7:1221–8.
Choi Y, Hyun E, Seo J, et al. 2015. A microengineered pathophysiological model of early-stage breast cancer. Lab Chip, 15: 3350–3357.
Cooper MA, Dultsev FN, Minson T, et al. 2001. Direct and sensitive detection of a human virus by rupture event scanning. Nature Biotechnol, 19:833–7.
Dai Z, Yan F, Yu H, et al. 2004. Novel amperometric immunosensor for rapid separation-free immunoassay of carcinoembryonic antigen. J Immuno Methods, 287:13–20.
Das, H.K. 2005. “Functional Gernomics using Microarrays Technology.” Text book of Biotechnology, pp .1276-1288, Wiley Dreamtech Publisher.
Drummond TG, Hill MG, Barton JK. 2003. Electrochemical DNA sensors. Nat Biotechnol, 21:1192–9.
Fan C, Plaxco KW, Heeger AJ. 2003. Electrochemical interrogation of conformational changes as a reagentless method for the sequence-speciﬁc detection of picomolar DNA. Proc Natl Acad Sci U S A, 100:9134–7.
Fan C, Plaxco KW, Heeger AJ. 2005. Biosensors based on binding-modulated donor-acceptor distances. Trends Biotechnol, 23:186–92.
Fan Y, Nguyen DT, Akay Y, et al. 2016. Engineering a brain cancer chip for high-throughput drug screening. Sci. Rep., 6: 25062.
Fritz J, Cooper EB, Gaudet S, et al. 2002. Electronic detection of DNA by its intrinsic molecular charge. Proc Natl Acad Sci U S A, 99:14142–6.
Gao Z, Binyamin G, Kim H-H, et al. 2002. Electrodeposition of redox polymers and co-electrodeposition of enzymes by coordinative crosslinking. Angew Chem Int Ed, 41:810–13.
Gaylord BS, Heeger AJ, Bazan GC. 2002. DNA detection using watersoluble conjugated polymers and peptide nucleic acid probes. Proc Nat Acad Sci U S A, 99:10954.
Grifﬁths AD, Tawﬁk DS. 2000. Man-made enzymes – from design to in vitro compartmentalisation. Curr Opin Biotech, 11:338–53.
Heeger AJ. 2000. Nobel Lecture: Semiconducting and Metallic polymers: The fourth generation of polymeric materials [online]. URL: http:// wwwnobelse.
Hook F, Ray A, Norden B, et al. 2001. Characterization of PNA and DNA immobilization and subsequent hybridization with DNA using acoustic- shear-wave attenuation measurements. Langmuir, 17:8305–12.
Hsiung LC, Chiang CL, Wang CH, et al. 2011. Dielectrophoresis-based cellular microarray chip for anticancer drug screening in perfusion microenvironments. Lab Chip, 11: 2333–2342.
Li Z, Su W, Zhu Y, et al. 2017. Drug absorption related nephrotoxicity assessment on an intestine-kidney chip. Biomicrofluidics, 11: 034114.
Lin D, Li P, Lin J, et al. 2017. Orthogonal screening of anticancer drugs using an open-access microfluidic tissue array system. Anal. Chem., 89: 11976–11984.
Liu J, Zhang Y, Jiang M, et al. 2017. Electrochemical microfluidic chip based on molecular imprinting technique applied for therapeutic drug monitoring. Biosens. Bioelectron., 91: 714–720.
Moore CD, Ajala O.Z, Zhu H. 2016. Applications in high-content functional protein microarrays. Curr. Opin. Chem. Biol., 30: 21–27.
Palecek E, Jelen F. 2002. Electrochemistry of nucleic acids and development of DNA sensors. Crit Rev Anal Chem, 32:261–70.
Palecek E. 2004. Surface-attached molecular beacons light the way for DNA sequencing. Trends Biotechnol, 22:55–8.
Park SJ, Taton TA and Mirkin CA. 2002. Array-based electrical detection of DNA with nanoparticle probes. Science, 295:1503–6.
Patolsky F, Lichtenstein A, Willner I. 2001. Detection of single-base DNA mutations by enzyme-ampliﬁed electronic transduction. Nature Biotech, 19:253–7.
Patolsky F, Weizmann Y, Wilner I. 2004. Long-range electrical contacting of redox enzymes by SWCNT connectors. Angew Chem Int Ed, 43:2113–17.
S. Mi, Z. Du, Y. Xu, et al. 2016. Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening. Sci. Rep., 6: 35544.
Schuster GB. 2000. Long-range charge transfer in DNA: transient structural distortions control the distance dependence. Acc Chem Res, 33:253-60. Sullivan CKO. 2002. Aptasensors–the future of biosensing? Anal Bioanal Chem, 372:44–8.
Stone HA, Stroock AD, Ajdari A. 2004. Engineering ﬂows in small devices: microﬂuidics toward a lab-on-a-chip. Annu. Rev. Fluid Mech., 36: 381–411.
Sugiura S, Hattori K, Kanamori T. 2010. Microfluidic serial dilution cell-based assay for analyzing drug dose response over a wide concentration range. Anal. Chem., 82: 8278–8282.
Taton TA, Mirkin CA, Letsinger RL. 2000. Scanometric DNA array detection with nanoparticle probes. Science, 289:1757–60.
Thorp HH. 2003. Reagentless detection of DNA sequences on chemically modiﬁed electrodes. Trends Biotechnol, 21:522–4.
Umek RM, Lin SW, Vielmetter J, et al. 2001. Electronic detection of nucleic acids–A versatile platform for molecular diagnostics. J Mol Diag, 3:74–84.
Van Hove AH, Antonienko E, Burke K, et al. 2015. Temporally tunable, enzymatically responsive delivery of proangiogenic peptides from poly (ethylene glycol) hydrogels. Adv. Healthc. Mater., 4: 2002–2011.
Whitesides GM, Grzybowski B. 2002. Self-assembly at all scales. Science, 295:2418–21.
Willner I. 2002. Biomaterials for sensors, fuel cells, and circuitry. Science, 298:2407.
Wosnick JH, Swager TM. 2000. Molecular photonic and electronic circuitry for ultra-sensitive chemical sensors. Curr Opin Chem Biol, 4:715–20.
Xiao Y, Patolsky F, Katz E, et al. 2003. Plugging into enzymes: nanowiring of redox enzymes by a gold nanoparticle. Science, 299:1877–81.
Xu H, Wu H, Huang F, et al. 2005. Magnetically assisted DNA assays: High selectivity using conjugated polymers for ampliﬁed ﬂuorescent transduction. Nucleic Acids Res, 33:e83.
Yu CJ, Wan YJ, Yowanto H, et al. 2001. Electronic detection of single-base mismatches in DNA with ferrocene-modiﬁed probes. J Am Chem Soc, 123:11155–61.
Yu X, Kim SN, Papadimitrakopoulos F, et al. 2005. Protein immunosen- sor using single-wall carbon nanotube forests with electrochemical detection of enzyme labels. Mol Biosyst, 1:70–8.